О.Э. Костерин, ИЦиГ СО РАН и ФЕН НГУ, Новосибирск, 2012 г.
15.1. Вводные замечания.
Данный вопрос представляется мне наиболее сложным во всей первой части курса генетики. В этом деле очень мало помогают существующие учебники. В учебнике Жимулева 2003 г. издания изложение перескакивает с эукариот на прокариот, а также с in vivo на in vitro и обратно, хотя обсуждаемые процесс происходит в этих случаях по разному, и вообще рассмотрение сведено к минимуму, по сути – к ссылкам на иллюстрации, из которых многое якобы должно быть ясным. Хочу оговориться, что нас сейчас интересует механизм мейотического кроссинговера как фундаментального процесса, общего и единообразного для всех эукариот и не свойственного прокариотам. В свежем учебнике С.Г. Инге-Вечтомова подробно рассмотрена устаревшая модель Р. Холлидея, основанная на однонитевых разрывах, а совеременная модель, основанная на двунитевых разрывах подана в том ключе, что «в инициации мейотического кросинговера играют роль не только однонитевые разрывы, но и (а возможно и в большей степени) двунитевые разрывы ДНК» (с. 202). Лучше всего данный вопрос освещен в недавней книге Корякова и Жимулева «Хромосомы: структура и функция», однако его обсуждение приведено в странном месте – в подразделе 15.6 «Синаптонемный комплекс» - притом, что синаптонемный комплекс лишь косвенным образом участвует в механизме кроссинговера - и оборвано на полуслове перед самым сложным моментом – разрешением структур Холлидея. (Кроме того, дело там представлено так, как если бы сестринский обмен был равновероятен с гомологическим, хотя это и не сказано в явной форме, а на последней картинке, иллюстрирущей механизм, не показаны гетеродуплексные участки.)
Для правильного понимания всего того, о чем будет говориться ниже, нужно все время держать в голове, что в кроссинговере участвуют две хромосомы, которые в сумме имеют четыре хроматиды и восемь цепей ДНК. В каждом акте кроссинговера участвуют две хромосомы, две хроматиды и четыре цепи ДНК. Ниже у вас возникнет много соблазнов перепутать цепи ДНК и двухцепочечные молекулы ДНК (хроматиды) и перекрест между вторыми – с перекрестом между первыми. Следует быть внимательными, чтобы этого не сделать.
С той же целью – чтобы вас не спутать - я не буду отвлекаться на исторические представления о механизме кроссинговера, еще недавно господствовавшие, но оказавшиеся неверными – в частности, о том, что он основан на однонитевых разрывах ДНК.
15.2. Механизм кроссинговера
Рассмотрев митотический кроссинговер и сестринский хроматидный обмен, мы пришли к выводу, что эти явления по всей видимости являются всего лишь побочными продуктами репарации двунитевых разрывов (причем сами эти разрывы могут быть не случайными дефектами, а вноситься специально для облегчения рассоединения сестринских хроматид после репликации ДНК). Также мы имели возможность убедиться в сходстве митотического и мейотического кроссинговера как по результату, так, скажем, и по нетривиальной U-образной зависимости от температуры. Это дает нам основание предположить, что и в механизме мейотического кроссинговера у эукариот задействованы элементы механизма, связанного с залечиванием двойных разрывов, общего для прокариот и эукариот.
Немаловажно, что если однонитевой разрыв ДНК может быть залечен по матрице второй, целой цепи, то двунитевой разрыв может быть залечен только по матрице идентичной или гомологичной хромосомы. Поэтому репарация двунитевых разрывов должна включать в себя механизмы поиска таких гомологов. Неудивительно, что и эта система очень пригодилась в мейозе, в профазе которого совершенно необходимо обеспечить гомологическое выравнивание гомологичных хромосом в целях их дальнейшего разделения.
Кроссинговер становится возможен только после того, как обеспечено спаривание и выравнивание гомологов. По образному выражению П.М. Бородина, первым этапом спаривания гомологов является грубое выравнивание «по штрихкоду» - друг друга «узнают» участки ДНК, имеющие сходный тип хроматина, то есть набор белков хроматина, который в конечном счете так или иначе определяется первичной структурой ДНК. К таким участкам прежде всего относятся теломерные и ценромерные районы, блоки гетерохроматина, но существует и более дробное разделение хроматина по белковому составу.
Вслед за этим наступает тонкое выравнивание по гомологии ДНК, которое обычно завершается образованием синаптонемного комплекса. Механизм выравнивания по гомологии ДНК заслуживает особого внимания. Начало его выглядит совершенно по-варварски. На стадии лептотены белок Spo11, гомологичный топоизомеразе археобактерий, вносит в ДНК множественные двунитевые разрывы. Примерно 300 разрывов на хромосому у мыши, несколько тысяч – у лилии.
Затем с разрывами связывается белок RAD51 и расплетает ДНК на определенную длину. У дрожжей функции RAD51 препятствует та самая «антирекомбиназа» - белок SRS2, мутанты по которому имеют повышенную интенсивность кроссинговера и более чувствительны к мутагенам. По всей видимости, гомологичные или аналогичные белки существуют и у других эукариот. Далее разрыв расширяется с каждой стороны путем разрушения той цепи ДНК, которая в этом месте имеет 5’-конец, так что на некоторую дистанцию от разрыва ДНК оказывается одноцепочечной и оканчивается 3’-концом. Один из таких одноцепочечных концов связывается с белками RAD51 и RAD54, другой – с белком DMC1.
Одноцепочечный конец ДНК, связанный с этим последним, делается активным и начинает блуждать, пока не обнаружит двойную цепь ДНК, содержащую комплементарный себе участок. При этом он способен вытеснять из двойной цепи ДНК участок, гомологичный себе, и вместо него сам образовывать дуплекс с участком, комплементарным им обоим. Тем самым он осуществляет инвазию; принято говорить об инвазии конца одиночной нити (single end invasion). Все это показано на следующей упрощенной схеме:
Вслед за инвазивным концом, в новую двойную спираль-акцептор вовлекается гораздо большая длина инвазивной нити ДНК, при этом двойная спираль-донор расплетается. Этот процесс назвается миграцией ветви (branch migration) Вытесненный из двойной спирали-акцептора одноцепочечный участок ДНК образует так называемую D-петлю (D-loop), которая находит одноцепочечный участок ДНК-донора и образует с ним дуплекс. При миграции ветви D-петля также расширяется, двойная спираль ДНК-донора расплетается, и оба дуплекса, образованные цепями ДНК от разных хроматид, расширяются. (Давайте в дальнейшем для простоты называть дуплексы, образованные цепями ДНК от разных хроматид «гетеродуплексами», хотя первичная структура обеих хроматид может быть и идентичной). Миграция ветви, образование D-петли и расширение гетеродуплексов распространяется и по другую сторону от точки инициации обмена (точки инвазии, соответствующей точке первоначального двуцепочечного разрыва), так что D-петля оказывается приблизительно симметричной относительно этой точки.
В результате мы получаем два ДНК-дуплекса, образованных цепями ДНК от двух разных хроматид. Однако эти дуплексы имеют однонитевые бреши, соответствующие первоначальному расширению двунитевого разрыва. В этом месте вторая цепь ДНК достраивается по матрице имеющейся. В точке, где одноцепочечный участок на ДНК-доноре кончается (слева на наших схемах), вновь синтезируемая цепь сшивается с 5-концом второй цепи ДНК-донора, и у нас получается симметричная с точки зрения цепей ДНК промежуточная структура: участок, где два ДНК дуплекса образованы цепями от разных хроматид, отграниченный с каждой стороны местами, где обе «чужие» цепи, перекрещиваясь, возвращаются в свои хроматиды. Такой перекрест цепей ДНК от разных дуплексов называется структурой Холлидея (Holliday structure) или полухиазмой, так что промежуточная структура ограничена с каждой стороны такой структурой Холлидея и иногда сама называется двойной структурой Холлидея (double Holliday structure).
Р. Холлидей предложил данную структуру в 1964 г. в рамках модели механизма кроссинговера, основанной на однонитевых разрывах ДНК. Модель оказалась неверной, но структура эта, как видим, действительно образуется, правда всякий раз в двух экземплярах. Представленная здесь модель механизма кроссинговера была предложена М.С. Мезельсоном и С.М. Рэддингом в 1975 г.
Ниже показаны два крайних варианта промежуточных структур, оба из которых встречаются у сумчатых грибов. Сверху показана промежуточная структура, характерная для дрожжей. В ней практически отсутствует миграция ветвей. Снизу показана промежуточная структура сумчатого гриба Sordaria fimicola, у которой протяженность миграции ветвей распространяется далеко за пределы однонитевых участков вокруг первичного двуцепочечного разрыва (стрелками показаны 3’-концы; длина участков ДНК показана не в масштабе – у сордарии промежуточная структура гораздо длиннее, чем у дрожжей, а несимметричная область у них, по-видимому, сравнимых размеров):
В мейозе инвазия в основном происходит в молекулу ДНК гомолога, а не сестринской хроматиды. Исследования на дрожжах показали, что инвазии в сестринскую хроматиду чисто механически мешает уже сформировавшийся к тому времени осевой элемент синаптонемного комплекса. В результате нахождение сестринской хроматиды в качестве ДНК, гомологичной инвазивному концу, оказывается менее вероятным, а образующиеся сестринские гетеродуплексы – менее стабильными. Поэтому по чисто кинетическим причинам подавляющее число промежуточных структур формируется между несестринскими хроматидами гомологов. В тех случаях, когда гомолог отсутствует - например в случае делеций или унивалентов (неспаренных хромосом), например В-хромосом – то в отсутствии «более легкой мишени» инвазия в конце концов происходит и в сестринскую хроматиду. В результате, например на унивалентных В-хромосомах, в профазе мейоза можно наблюдать рекомбинационные узелки. Мы помним, что в митотическом кроссинговере, где синаптонемный комплекс отсутствует вовсе, сестринская хроматида оказывается более предпочтительным (примерно на два порядка!) партнером для обмена.
Посредством всей этой сложной механики осуществляется тонкое выравнивание гомологичных хромосом по гомологии первичной структуры ДНК, которое, как мы увидим ниже, необходимо для кроссинговера.
Внесение разрывов и инвазия у большинства эукариот происходят до формирования синаптонемного комплекса, обеспечивая необходимое для него гомологическое выравнивание хромосом. Что характерно, небольшие участки нарушения гомологии, например, небольшие инверсии в гетерозиготе (участки ДНК, в одном из гомологов повернутые на 180о), не препятствуют формированию синаптонемного комплекса по всей длине бивалента. Однако у дрозофилы наоборот, формирование синаптонемного комплекса предшествует разрывам. Скорее всего, она может это себе позволить потому что у нее гомологичные хромосомы пребывают в выровненном состоянии не только в профазе мейоза, но и в интерфазе.
Когда количество опознаний достигает некоего критического уровня, двойные структуры Холлидея начинают разрешаться. Их разрешение происходит путем ликвидации перекрестов между двумя двойными цепями ДНК. Это достигается путем разрезания двух одноцепочечных ДНК, создающих перекрест, и залечивании образующегося одноцепочечного разрыва.
В этом месте следует заметить, что структурам Холлидея свойственна так называемая изомеризация. ДНК – достаточно гибкая подвижная молекула, и ее вращение в районах перекреста может создавать два варианта структуры Холлидея, когда
1) Перекрещиваются цепи ДНК, побывавшие в составе другой хроматиды, то есть цепь, участвовавшая в инвазии и цепь, образовывавшая D-петлю, а цепи ДНК, не покидавшие своих хроматид не перекрещиваются;
2) Перекрещиваются цеп ДНК, не покидавшие своих хроматид, а цепи, участвовавшие в инвазии и образовании D-петли не неперекрещиваются.
В учебнике Жимулева этот момент отражен в трех словах «после серии вращений». Он неплохо изображен в учебнике Инге-Вечтомова на рисунке, иллюстрирующем модель Холлидея, за исключением иного (согласно той модели) расположения гетеродуплексных и гомодуплексных участков ДНК вблизи перекреста. На основе последней картинки я сделал свою. Здесь показана «левая» структура Холлидея, слева от которой идут интактные хроматиды, а справа – гетеродуплексы промежуточной структуры. Цепи ДНК от разных хроматид показаны разными цветами, цепи, не покидавшие своих хроматид показаны прямыми, покидавшие – извилистыми. Здесь знак равенства обозначает разные плоскостные представления одной и той же ситуации, то есть связанные им картинки топологически эквивалентны; стрелки означают возможные переходы, включая вращение.
Напомню, что мы рассматриваем плоскую картинку, тогда как процессы происходят в объеме. Чтобы пояснить модель, я нахожу возможным провести трехмерную демонстрацию посредством двух черных и двух белых веревочек.
Является ли это двумя альтернативными состояниями или же лишь крайними состояниями при множестве промежуточных вариантов? Из чисто тригонометрических соображений я бы предположил, что верно последнее. Но по результатам мы видим, что все происходит так, как если бы было верно первое. Более того, эти два альтернативных состояния оказываются далеко не равновероятными, и на то, какое именно возобладает, оказывает влияние присутствие ряда специальных белков. Таким образом, наше представление ограничено не только плоскими картинками, но и тем, что основные фигуранты процесса – белки – у нас традиционно остаются за кадром.
Разрешение структур Холлидея состоит в разрезании перекрещивающихся цепей и сшивании их таким образом, что перекрест между хроматидами исчезает. Это может происходить по одному из двух вариантов – либо по конверсионному пути, либо по рекомбинационному пути. Выбор пути соответствует одному из изомеров, показанных выше, но определяется не случайным изгибанием нитей ДНК, а тем, с какими белками связана та или иная структура Холлидея. При разрешении по конверсионному пути структура Холлидея разрешается, исходя из такого изомера, где перекрещивающиеся цепи ДНК, покидавшие свои хроматиды. При разрешении по рекомбинационному пути структура Холлидея разрешается исходя из изомера, где перекрещиваются цепи ДНК, покидавшие свои хроматиды.
Если по конверсионному пути разрешаются обе структуры Холлидея промежуточной структуры, то цепи ДНК, не покидавшие своих хроматид, не разрезаются ни разу, а цепи, покидавшие свои хроматиды, разрезаются и сшиваются дважды, так что каждая из них сначала обменивается на участок цепи от другой хроматиды, а потом обменивается обратно на свой же. При этом обе участвовавшие в обмене хроматиды в конечном счете получают обратно свои цепи, которые могут нести изменения только в области, побывавшей в составе гетеродуплексов.
Такую ситуацию легко визуализовать на уже приведенной схеме промежуточных структур (повторим ее еще раз), если мысленно разрезать перекрещивающиеся нити ДНК в местах перекреста и сшить их так, чтобы они не перекрещивались.
Разрешение по рекомбинационному пути происходит исходя из такого изомера, где перекрещивающиеся те цепи ДНК, которые не покидали своих хроматид. В результате именно они оказываются разрезанными в области перекреста и сшитыми наоборот. Если вторая структура Холлидея разрешалась по конверсионному пути, то в ней разрезаются и сшиваются наоборот две цепи, покидавшие свои хроматиды. Как следствие, обе цепи каждой хроматиды оказываются сшитыми с цепями другой хроматиды, то есть теперь уже обе двуцепочечные хроматиды оказываются сшитыми наоборот. Тем самым мы с вами имеем долгожданный кроссинговер.
На приведенной ниже схеме для промежуточной структуры дрожжей слева показан случай, когда таким образом разрешилась правая структура Холлидея, справа – когда так разрешилась левая структура Холлидея; из экономии места для сордарии показано разрешение по кроссоверному пути только правой полухиазмы. (Чтобы подчеркнуть, что разрешеник по кроссоверному пути происходит исходя из другого топологического изомера, образующегося путем вращения относительно структуры Холлидея, цепи ДНК за пределами промежуточной структуры пририсованы с другой стороны, что чистая условность, так как двуцепочечная ДНК в любом случае представляет собой двойную спираль):
На этой картинке процедуру разрезания перекрещивающихся цепей и сшивания образовавшихся концов так, чтобы исключить перекрест с соседней хроматидой мысленно представить сложнее, поэтому нарисуем, что при этом получится. Каждая из цепей ДНК каждой из хроматид оказывается пришитой к цепям противоположной хроматиды справа и слева от бывшей промежуточной структуры, то есть имеет место кроссинговер. Следует обратить внимание на то, что кроссинговер затрагивает обе цепи ДНК участвующих в нем хроматид, но с некоторым сдвигом (на длину бывшей промежуточной структуры).
Нетрудно понять, что если бы обе структуры Холлидея одной промежуточной структуры разрешились по кроссоверному пути, то мы снова не имели бы кроссинговера (вернее, имели бы двойной кроссинговер с очень близкими точками разрыва). Но такого судя по всему просто не бывает –для разрешения структуры Холлидея по кроссоверному пути необходима сборка определенного белкового комплекса и не исключено, что два таких комплекса не помещаются на одну промежуточную структуру.
15.3. Закономерности интерференции.
У дрожжей оба варианта разрешения структур Холлидея приблизительно равновероятны. У многоклеточных большая часть D-петель разрешается по конверсионному пути, и лишь немногие – по рекомбинационному.
У дрожжей разрешение по рекомбинационному требует присутствия белка MSH4, к которому затем присоединяются белки MLH1 и MLH3. У млекопитающих происходит множественные посадки MSH4 на хромосомы в момент их спаривания, их количество все уменьшается, и наконец в тех сайтах, где также появляются белки MLH1 и MLH3, происходит кроссинговер. Отсутствие любого из двух белков убирает у млекопитающих более 90% кроссоверных событий. Остающиеся 10% кроссинговера идут по какому-то другому механизму, по-видимому с вовлечением других белков.
Все упомянутые белки принадлежат к семейству белков mismatch repair и участвуют в репарации гетеродуплексов. И все они непосредственно взаимодействуют друг с другом во время кросинговера.
На стадии пахитены в местах, в которых произошел кроссинговер, под электронным микроскопом видны довольно крупные, около 90 нм, белковые гранулы – поздние рекомбинационные узелки, представляющие собой комплексы вышеупомянутых и, возможно, каких-то еще белков. Как мы уже говорили, флюоресцентные антитела к MLH1 также хорошо маркируют точки будущего кроссинговера уже на стадии пахитены, как это визуализовано на фотографии П.М. Бородина (места посадки MLH1 здесь мелкие точки, светящиеся зеленым, тогда как крупные – это центромеры):
На этой стадии хромосомы компактизованы еще не очень сильно и, главное, равномерно, поэтому расстояние между соседними сайтами посадки MLH1 более или менее адекватно физическому расстоянию (вдоль молекулы ДНК). Это расстояние варьирует, и чтобы понять как именно, следует построить и проанализировать его статистическое распределение.
Мы помним, что первая наша гипотеза состояла в том, что кроссинговер представляет собой простой пуассоновский процесс. Затем мы убедились в том, что это не так, то есть в существовании интерференции. Однако у этой последней должны существовать какие-то свои закономерности, которые желательно выявить.
Распределение Пуассона количества случайных событий на отрезке шкалы длиной T
P(n) = хn e –х / n!
(где x = λT) не есть единственное распределение, которое характеризует простой пуассоновский процесс. Можно рассмотреть также распределение длины интервалов шкалы y между соседними случайными событиями (например, времени между поступлением двух последовательных телефонных звонков). Оно будет описываться так называемым показательным распределением.
P(y) = λ e –λy
Заметим, что если распределение Пуассона задано на множестве неотрицательных целых чисел, что показательное – на множестве неотрицательных вещественных чисел. Вопреки интуитивным ожиданиям, это распределение имеет максимум в нуле и J-образную форму (то есть оно монотонно убывает по мере увеличения y).
Как нам теперь и следовало ожидать на основании существования интерференции, реальное распределение расстояний между точками посадки MLH1 не соответствует показательному распределению. Прежде всего, оно имеет максимум, отличный от нуля. Однако оно оказалось в удивительном соответствии с гамма-распределением, вернее с распределением Эрланга. Гамма-распределение имеет дополнительный параметр k. Если он задан на множестве натуральных чисел, то оно называется распределением Эрланга. Это распределение также порождается простым пуассоновским процессом. Оно есть распределение интервалов шкалы y не между соседними, а между k-ми соседними событиями: от каждого события до второго следующего при k=2, до третьего при k=3 и т. д. Показательное распределение – это распределение Эрланга с k=1. (Другой частный случай гамма-распределения, где параметр k не обязан быть целым – распределение хи-квадрат.) К сожалению, распределение Эрланга не выразить простыми формулами. Оно унимодально и при больших k приближается к нормальному.
Получается, что в основе кроссинговера все же лежит простой пуассоновский процесс, но он свойственен не кроссинговеру, а предшествующему ему событию, тогда как кроссинговер происходит на каждом k-м таком событии. Как вы уже догадались, предшествующим событием здесь является двуцепочечный разрыв, который развивается в промежуточную структуру. Расстояние между ними как раз таки должно соответствовать распределению Пуассона, однако визуализовать их не удается, поскольку разрывы происходят на стадии лепотены, когда хромосомы еще слишком длинные и перепутаны.
Как мы уже знаем, промежуточные структуры разрешаются по конверсионному либо кроссоверному пути. Получается, что существует некий механизм, заставляющий разрешаться по кроссоверному пути каждую k-ю промежуточную структуру. Природа этого механизма пока неизвестна. Не исключено, что какие-то белки связываются с промежуточными структурами и при этом собираются в аггрегаты – k-(или около того)-меры, оставляя k+1-ю структуру свободной для сборки комплекса белков, необходимых для разрешения структуры Холлидея по кроссоверному пути.
Есть данные, что указанная закономерность работает на участках бивалентов с ненарушенным синатонемным комплексом. Вокруг точек нарушения последнего вследствие хромосомных перестроек интерференция резко падает, а у грибов, не имеющих синаптонемного комплекса в мейозе, отсутствует и интерференция. По видимому, синаптонемный комплекс каким-то образом участвует в передаче «сигнала» о произошедшем кроссоверном обмене. Неудивительно, что интерференция не передается и через центромеру – поэтому двуплечие хромосомы как правило обязательно имеют минимум одну хиазму на каждом плече.
Так или иначе, так называемая счетная модель кроссинговера, суть которой изложена выше, хорошо соответствует экспериментальным данным – с той разницей, что значение k не фиксировано жестко, а допускает вариацию в незначительных пределах. Таким образом, для кроссинговера и интерференции на данном этапе наших знаний мы как минимум уже можем принять довольно изящную математическую модель.
Те же экспериментальные данные позволяют эмпирически оценить значение параметра k для разных организмов, то есть ответить на вопрос – каждый который разрыв разрешается у них по кроссоверному пути. У млекопитающих получается примерно такая картина:
у кошки k ~ 3,5,
у собаки 6,5,
у мыши 9-12,
у обыкновенной бурозубки 14-18.
Соотношения между количеством мест посадки белка RAD51, которые можно пометить флюоресцентными антителами к нему и сосчитать на стадии лептотены (но не измерить расстояние между ними, так как хромосомы на этой стадии еще мало конденсированы, длинны и перепутаны) и количеством мест посадки MLH1 в пахитене очень хорошо согласуются со значениями параметра k, экспериментально оцененными на основе формы распределения расстояния между посадками одного лишь MLH1.
У дрожжей примерно половина двунитевых разрывов в профазе мейоза сопровождается кроссинговером, но значении параметра k у них говорить нельзя, так как их кроссинговер не вписывается в счетную модель за счет существования и высокой частоты второго, неинтерферирующего пути кроссинговера, о котором речь пойдет ниже.
15.4. Генная конверсия.
Тетрадный анализ, проведенный на гетерозиготных модельных объектах, относящихся к аскомицетам – дрожжах, нейроспоре и сордарии, иногда выявлял мейотические тетрады с аномальными соотношениями аллелей, которое, казалось бы, не могло получиться в результате мейоза. Как мы знаем, в первом делении мейоза расходятся два гомолога, а во втором – две хроматиды. Гетерозиготы получают разные аллели от своих двух родителей, они находятся каждая на своем гомологе и удваиваются в S-фазе мейоцита, когда в каждом гомологе образуются по две хроматиды. Вне зависимости от какого бы то ни было кроссинговера, в одной тетраде мы должны наблюдать два продукта мейоза с одним аллелем и два с другим аллелем. Однако иногда можно наблюдать и иные соотношения. Первые такие результаты были получены К. Линдегерном в 1949 г. У гетерозиготных дрожжей он иногда наблюдал тетрады с соотношением аллелей 3:1 и 1:3. На этом основании он возродил гипотезу генной конверсии , высказанную в 1930 г. Винклером для объяснения кроссинговера через таинственное взаимное превращение аллелей друг в друга. В каком-то смысле в нашем случае это оказывается верно, как мы увидим ниже.
У нейроспоры и Sordaria fimicola в качестве преобладающего типа конверсии можно наблюдать октады аскоспор (клетки, получающиеся при первом митотическом делении аскоспор одной тетрады – именно то, что содержится в одной аске обеих упомянутых плесеней) с соотношением аллелей 5:3 и 3:5. Если дождаться следующего деления тетрад дрожжей и также получить октады, то исключительно редко такие соотношения можно получить и у них, хотя у дрожжей преобладающим типом аномальных октад являются все же 6:2 и 2:6. Появление таких соотношений было названо постмейотической сегрегацией. Нетрудно догадаться, что такие соотношения могут получаться за счет того, что хроматида, попавшая в клетку тетрады, в области анализируемого гена была представлена гетеродуплексом, и в s-фазе следующего митотического цикла каждая цепь дала начало хроматиде с разным аллелем.
Иногда можно наблюдасть коконверсию двух близко сцепленных (не более 1 сМ) локусов, и вероятность ее тем больше, чем ближе расположены локусы. Допустим, в потомстве дигетерозиготы в фазе отталкивания a + / + b мы можем наблюдать, к примеру, тетрады a + / a + / a + / + b. Это свидетельствует о том, что конверсия имеет протяженность, то есть захватывает некоторый участок ДНК. Исключительно редко можно наблюдать даже реципрокную конверсию соседних локусов, когда по обоим из них наблюдается аномальные соотношения аллелей в тетрадах или октадах, находящиеся в противофазе, например, в нашем примере a + / a b / a b / + b/, причем вероятность реципрокной конверсии, наоборот, увеличивается по мере сближения локусов.
У объектов, где тетрадный анализ невозможен, конверсию наблюдать также практически невозможно, поскольку это крайне редкое событие состоит всего лишь в отклонении соотношения аллелей в продуктах одного индивидуального мейоза. Однако в свое время появились данные, что у дрозофилы на очень близких рекомбинационных расстояниях наблюдается отрицательная интерференеция – резко повышенная доля двойных кроссоверов. На самом деле при этом наблюдался результат не двух кроссоверных событий, а одно событие той же генной конверсии – когда один из аллелей «превращался» в своего визави в другом гомологе, оставаясь сцепленным с теми же самыми аллелями локусов, расположенных неподалеку с обеих сторон.
Наблюдавшаяся в 70-х годах прошлого века у дрожжей связь между конверсией и кроссинговером (примерно половина случаев конверсии сопровождалась кроссинговером) предполагала, что они являются разными проявлениями одного и того же процесса. Эти наблюдения существенно продвинули понимание молекулярного механизма кроссинговера, но выяснен он все же был достаточно недавно.
Мы сейчас вполне можем дать объяснение генной конверсии, исходя из знания механизма кроссинговера, вернее его начальных этапов. Мы не зря называли один из путей разрешения структур Холлидея конверсионным. Когда обе структуры Холлидея одной промежуточной структуры разрешаются по этому пути, целостность исходных хроматид восстанавливается, но в том месте, где она находилась, остаются участки гетеродуплексов. Посмотрим еще раз на эту картинку, где изображены промежуточные структуры, характерные сверху - для дрожжей, снизу – для сордарии, и отличающиеся по характеру миграции ветвей – почти отсутствующей у дрожжей и протяженной у сордарии (здесь красным и синим помечены цепи ДНК изначально одной несестринской хроматиды, а пунктиром – ДНК, достроенная по матрице соответствующего цвета):
Вспомним еще, что за кадром у нас остались две хроматиды, не участвующие в обмене. В области, где происходило достраивание второй цепи ДНК в бреши, мы видим асимметричное расположение гетеродуплекса: так что в этом районе три цепи ДНК одного цвета и одну – другого цвета. Прибавляя по две цепи каждого цвета от необменных хроматид мы получаем расщепление 5 : 3. Если гетеродуплекс случайно захватил вариабельный сайт (участок, по которому различаются аллели) изучаемого нами локуса, то мы будем наблюдать октады (продукты одного митоза, следующего за одним мейозом) именно с таким соотношением аллелей, как, например, на вот этой фотографии:
и в случаях d и e на следующей схеме:
Напомню, что внизу подписаны цифры соответствущих классов тетрад, реально наблюдавшиеся японским генетиком Китани у сордарии. Причины превышения асок с избытком темных спор над асками с избытком светлых пор остались мне неизвестными.
В области, затронутой миграцией ветвей, где достраивания не происходило, мы наблюдаем симметричное расположение гетеродуплексов, которое не нарушает соотношения нитей ДНК разного цвета, так что мы будем иметь соотношение цепей ДНК 4 : 4. Хотя соотношение нитей и не нарушено, мы можем распознать получающиеся октады как аберрантные, поскольку вследствие постмейотической сегрегеции нарушено привычное нам расположение аскоспор с идентичным аллелем смежными двойками, как например в случае c предыдущей картинки.
В тех случаях, когда одна из структур Холлидея разрешается по рекомбинационному пути, конверсия будет сопровождаться кроссинговером краевых маркеров. Верно и обратное – любой кроссинговер всегда сопровождается конверсией определенных участков ДНК, оказавшихся внутри промежуточной структуры.
Вопрос – откуда берутся конверсионные тетрады с соотношениями 6 : 2, как в случаях f и g выше и на следующих фотографиях?
Напомним, что у дрожжей такие случаи гораздо вероятнее, чем тетрады 5: 3.
Рассмотренные нами механизмы не дают ответа на этот вопрос, поскольку такие тетрады появляются в результате еще одного, дополнительного процесса. Этот процесс – мейотическая репарация гетеродуплексов (meiotic mismatch repair). Репарация гетеродуплексов инициируется однонитевым разрывом и исправляет надрезанную цепь по целой – она представляет собой способ борьбы с мутациями при сшивании фрагментов Оказаки при репликации ДНК. В нашей системе эта репарация может происходить в двух местах, где происходят однонитевые разрывы – в области инвазии одновременно с ней и возле структур Холлидея в момент их разрешения.
Возле точки инвазии репарация гетеродуплексов неизменно имеет место у одних объектов и с небольшой вероятностью просиходит у других. Если она происходит с небольшой вероятностью, как у сордарии, то преимущественно возникают конверсионные октады 5:3. Если она имеет место всегда, как у дрожжей, то репарации цепи, имевшей надрез, по матрице неразрезанной цепи ДНК приводит к унификации в этом месте всех четырех цепей ДНК двух хроматид, участвующих в промежуточной структуре. С учетом цепей ДНК двух хроматид, в ней не участвующих, - мы получим соотношение цепей ДНК 6:2. Это можно вывести из схемы, которую имеет смысл привести в третий раз, обратив внимание, что в области такой промежуточной структуры репарация гетеродуплексов по матрице неразрезанных цепей ДНК сделает все четыре цепи ДНК «синими»:
Репарация гетеродуплексов при разрешении структур Холлидея и возле них как минимум у сумчатых грибов идет всегда. При этом она инициируется однонитевыми разрывами ДНК, в данном случае возникающие при разрезании перекрещивающихся цепей, а матрицей служат неперекрещивающиеся цепи. Понять ее результаты нам поможет повторение приведенной выше схемы вариантов разрешения структур Холлидея, где для одной полухиазмы показан конверсионный путь, а для другой – кроссоверный.
В силу асимметрии промежуточной структуры у дрожжей репарация гетеродуплексов при разрешении «правой» и «левой» полухиазмы по тому или иному пути приводит к разным результатам. Мысленно разрезаем перекрещивающиеся цепи, находим примыкающие к перекрестам гетеродуплексы и репарируем их по неразрезанной цепи. Слева имеем только один гетеродуплекс у верхней хроматиды, который репарируется по красной цепи при разрешении по конверсионному пути, в результате чего получаем октаду 4 : 4 без конверсии, и по синей цепи при разрешении по рекомбинационному пути, с конверсией 6 : 2. Справа гетеродуплекс распложен снизу, а результат противоположен: он будет репарирован по красной цепи при разрешении по рекомбинационному пути, с результатом 4 : 4, и по синей цепи при разрешении по конверсионному пути, с результатом 6 : 2. Кроссинговер происходит, когда правая и левая структуры Холлидея разрешаются по разному. Поэтому исходя из репарации гетеродуплкесов в момент разрешения структур Холлидея, конверсией вблизи этой структуры должна сопровождаться половина случаев кроссинговера – а именно когда по рекомбинацинному пути разрешилась левая структура.
У сордарии (снизу), вследствие протяженной миграции ветвей края промежуточной структуры представляют собой симметричные протяженные участки гетеродуплексов. Репарация при разрешении структур Холлидея дает тетрады 4:4 без конверсии, однако большая часть гетеродуплексов остаются не затронутыми такой репарацией и дают аберрантные 4 : 4 октады, то есть октады с постмейотической сегрегацией.
В завершение, учитывая все упомянутые выше возможности, мы можем расписать полную группу возможных событий в следующей схеме, где колонки по четыре строчки обозначают четыре хроматиды, из которых верхняя и нижняя не взаимодействовали, а две средние формировали промежуточные структуры. Здесь A, a и B, b обозначают аллели краевых генетических маркеров, + и m обозначают доминантный либо мутантный аллель, за которым мы следим в анализе; средние два символа в каждой короткой строчке, разделенные косой чертой обозначают аллели локуса m в двойных цепях ДНК, то есть гомо- либо гетеродуплексы.
•Конверсии нет Конверсия
•Норм. 4:4 аберр. 4:4 5:3 6:2
• Кроссинговера нет
•A m/m B A m/m B A m/m B A m/m B
•A m/m B A m/+ B A m/m B A m/m B
•a +/+ b a +/m b a m/+ b a m/m b
•a +/+ b a +/+ b a +/+ b a +/+ b
•
• Кроссинговер есть
•A m/m B A m/m B A m/m B A m/m B
•A m/m b A m/+ b A m/m b A m/m b
•a +/+ B a +/m B a m/+ B a m/m B
•a +/+ b a +/+ b a +/+ b a +/+ b
Заметим, что в тетрадном анализе кроссинговер мы можем зафиксировать на вполне заметных расстояниях между локусами a и b, до тех пор пока более одного события маловероятно (в пределах 10 см), тогда как конверсию мы будем наблюдать в опыте только в случае, если промежуточная структура случайно захватит локус m. Поэтому велика вероятность наблюдать кроссинговер, но не сопровождающую его конверсию, притом что в любой промежуточной структуре всегда есть участки гетеродуплексов.
15.5. Загадочный второй путь кроссинговера.
У аскомицетов (сордария, дрожжи) полного совпадения распределения кроссоверов со счетной моделью кроссинговера не наблюдаются. Довольно сложные данные о конверсии и рекомбинации свидетельствуют, что у них есть два пути кроссинговера.
1). «Ранний» путь: msh4-независимый кроссинговер без интерференции (вернее со слабой отрицательной интерференцией), который полностью определяется событиями в момент инвазии однонитевого конца и, возможно, не связан с образованием D-петли и знакомой нам промежуточной структуры, то есть в чем-то схож с моделью Холлидея для кроссинговера, (которую мы не рассматривали). Какие именно при этом образуются структуры и каким образом они разрешаются – пока неизвестно. У дрожжей, у которых репарация гетеродуплексов в районе инвазии почти облигатна, этот путь кроссинговера в норме сопровождается конверсией вблизи точки инвазии по типу 6:2. У сордарии, у которой репарация гетеродуплексов в районе инвазии происходит далеко не всегда, он сопровождается конверсией по типу 5:3, реже 6:2.
2). Описанный выше «поздний» путь: msh4-зависимый кроссинговер с положительной интерференцией в соответствии со счетной моделью, который происходит во время разрешения структур Холлидея. У дрожжей он в половине случаев должен сопровождаться конверсией типа 6:2 вблизи структуры Холлидея, разрешившейся по рекомбинационному пути. Однако в реальности дело обстоит так как если бы такой конверсией сопровождался любой случай этого типа кроссинговера – поскольку точка инициации, всегда сопровождающаяся конверсией с репарацией при инвазии, находится неподалеку. У сордарии этот путь кроссинговера связан с отсутствием конверсии вблизи структур Холлидея, которые, во-первых, контактируют с симметричными гетеродуплексами, а во-вторых, находятся на значительном расстоянии от точки инвазии.
С этим были связаны полученные на сордарии результаты Китани, опубликованные в 1978, который сделал следующий вывод: есть два типа кроссинговера, происходящие на разных стадиях профазы мейоза:
- кроссинговер без интерференции, который сопровождается конверсией.
- кроссинговер с интерференцией, который не сопровождается конверсией
(сам Китани сделал оказавшееся неверным предположение, что кроссинговер с интерференцией и без конверсии идет только в промежутках между генами, поэтому конверсия никогда не может быть зафиксирована).
Действительно, события раннего неинтерферирующего кроссинговера всегда наблюдаются связанными с конверсией вблизи точки инициации обмена, где этот кроссинговер и происходит. В то же время репарация гетеродуплексов вблизи структур Холидея, происходящая в момент их разрешения за счет позднего интерферирующего кроссинговера, исключает конверсию в этом районе у сордарии, тогда как конверсия вблизи точки инициации при ее длинных промежуточных структурах происходит достаточно далеко и не ассоциируется с данным событием кроссинговера.
Заметим, что изучать связь конверсии и кроссинговера можно лишь имея много подходящих генетических маркеров, допускающий тетрадный анализ, и сосчитав астрономические количества тетрад. Однако совершенно надежные и многозначительные результаты, полученные Китани в 1974 г., во-первых, в течение четырех лет оставались неопубликованными, поскольку противоречили результатам, полученным на дрожжах, из которых следовало, что любой кроссинговер сопровождается конверсией поблизости от точки своего прохождения (мы уже знаем почему), и ее можно зарегистрировать, если там есть подходящий ген. (Данная ситуация была позднее образно охарактеризована как «дрожжевой шовинизм» - не путать с квасным патриотизмом.) Во-вторых, будучи опубликованными, эти результаты на тридцать лет оказались на обочине генетики, не получив ни подтверждения, ни объяснения, ни развития. После закрытия его лаборатории в Иокогаме в 1989 г., Китани предался изучению китайской и английской поэзии и садоводству. И только в 2008 году группа под руководством Фрэнклина Сталя – того самого, который экспериментально установил полуконсервативный характер репликации ДНК – вернулась к работам Китани и исследовала тот же вопрос на дрожжах, подтвердив наличие второго типа кроссинговера, которому не свойственна интерференция.
У дрожжей, где вся промежуточная структура асимметрична, наблюдается конверсия 6:2 и в районе инвазии, и в половине случаев разрешения структур Холлидея. Группа Сталя ввела в исследуемый район короткие палиндромы, которые подавляли конверсию в районе инвазии, но не при разрешении структур Холлидея. Это позволило группе Сталя, работая с дрожжами, наблюдать неинтерферирующие кроссоверные события, сопровождавшиеся конверсией 5 : 3. Если бы репарация гетеродуплексов в районе инвазии не была бы подавлена и конверсия шла бы по механизму 6:2, такие неинтерферирующие события кроссинговера растворились бы на фоне численно преобладающих интерферирующих событий, сопровождавшихся такой же конверсией.
Остается лишний раз поразиться, как чисто генетические методы, связанные с анализом расщепления генов у огромного количества тетрад плесени, указали на обстоятельства, связанные с интимными молекулярными механизмами. А также тому, как много прошло времени, прежде чем они привлекли внимание молекулярных биологов.
У дрожжей второй путь кроссинговера ответственен за 30-50% всех кроссоверов. У нематоды Coenorhabdites elegans обнаружен только msh4-зависимый механизм кроссинговера. У мышей на долю канонического кроссинговера приходится около 90% всех кроссоверных событий, остальные 10% происходят по какому-то другому пути, но похож ли этот второй путь на дрожжевой - пока неизвестно.