Работа выполнена в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии

Московского областного научно-исследовательского клинического института им. М.Ф. Владимирского и лаборатории трансплантационной иммунологии ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий

Научные консультанты:
Заслуженный деятель науки,

доктор медицинских наук, профессор Молочков Владимир Алексеевич

Доктор медицинских наук, профессор Белецкая Людмила Вячеславовна
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Кочергин Николай Георгиевич

Доктор медицинских наук, профессор Бутов Юрий Сергеевич

Доктор медицинских наук, профессор Резайкина Анна Васильевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита состоится «____»__________ 2009 г. в _____ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.115.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУ «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий»

107076 г. Москва, ул. Короленко, д. 3, корп. 4
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий»

Автореферат разослан «____»__________ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат медицинских наук Иванова Наталья Константиновна

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

За последние три-четыре десятилетия накоплены фундаментальные знания по поводу клиники и иммунопатологии аутоиммунных буллезных дерматозов. Несмотря на достигнутые успехи, изучение патогенеза этих дерматозов на уровне молекулярно-биологических исследований остается одной из важных проблем в дерматологии и в настоящее время. Это связано с необходимостью преодоления развития таких тяжких, порой угрожающих жизни, заболеваний как аутоиммунная пузырчатка, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз.

Современная медицина обладает целым рядом эффективных средств, позволяющих успешно подавлять развитие иммунопатологического процесса при аутоиммунных состояниях [Уоллис Д. и др., 2000; Hertl M., 2005; Laffitte E., Borradori L., 2005; Schmidt E. et al., 2006]. Однако те же средства обладают нередко побочным действием, нарушающим функцию ряда физиологических систем организма. К ним, в частности, относятся кортикостероиды, азатиоприн, метотрексат, циклоспорин. Принцип лечения аутоиммунных заболеваний, при которых одним из основных патогенетических факторов являются аутоантитела, направленные к антигенам тканевых структур, сходен для многих аутоиммунных заболеваний. Однако разные формы патологии, включая аутоиммунные буллезные дерматозы, требуют различные схемы лечения, в частности разные дозировки, назначаемых препаратов. Учитывая возможные осложнения, необходимо подбирать оптимальные дозы, позволяющие достигать терапевтического эффекта, не нанося вред организму больного. Оптимальные дозы препаратов при таких заболеваниях как истинная пузырчатка, буллезный пемфигоид, приобретенный буллезный эпидермолиз и линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, также как и схемы их лечения, значительно отличаются друг от друга [Bystryn J-C., Rudolph J.L., 2005; Hertl M., 2005], в связи с чем необходима тщательная дифференциальная диагностика.

Нередко клиническое сходство буллезных дерматозов, а порой и атипичные их проявления на ранних этапах развития патологического процесса с сомнительными результатами феномена Никольского не позволяют клиницисту у постели больного поставить с уверенностью клинический диагноз. Существующие данные [Цветкова Г.М. и др., 2003; Mihai S., Sitaru C., 2007] свидетельствуют о том, что применение гистологических и ряда иммунологических методов, в том числе метода меченых антител, в дополнение к клиническому обследованию, во многих случаях позволяет уточнить диагноз. Полученные нами результаты подтверждают эти наблюдения [Белецкая Л.В., Махнева Н.В., 2000]. Однако и эти методы имеют свои ограничения. Так, гистологическое исследование на основании определения уровня образования пузыря способствует диагностике и дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов только между различными их группами, такими как группа пузырчатки и группа буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения, но затрудняет проведению дифференциальной диагностики среди буллезных дерматозов одной группы, таких как буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз [Eming R., Hertl M., 2006]. Сложности могут возникнуть и при использовании методов прямой и непрямой иммунофлюоресценции [Millns J.L. et al., 1980; Coscia-Porzzi L. et al., 1985; Махнева Н.В., Белецкая Л.В., 2007]. Это требует дополнительных методов диагностики.

Разнообразие клинических проявлений аутоиммунных буллезных дерматозов и поиск новых методов терапии заставляет специалистов продолжать исследования по изучению механизмов и факторов, способствующих как проявлению в латентной форме заболевания, так и развитию этих буллезных дерматозов de novo. Исследования по изучению молекулярно-биологической структуры кожи (система межклеточного и дермо-эпидермального соединений, белки поверхности кератиноцитов и десмосом) позволяют более полно выяснить состояние различных белковых структур и клеточных элементов кожи при различных аутоиммунных буллезных дерматозах. Известно, что молекулы адгезии вовлечены во все физиологические процессы, обеспечивая функциональную целостность кожи. В кожной патологии некоторые молекулы адгезии выступают в качестве мишеней для аутоиммунных антител, например, при пузырчатке, а другие страдают опосредованно - как при буллезном пемфигоиде [Kitajima Y., 2002; Koeser J. Et al., 2003; Getsios S. et al., 2004]. До сих пор дискутируется роль системы комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов [Dubelsteen E., 1998; Yancey K.B., 2005; Leighty L. et al., 2007].

Принимая во внимание возможность участия самых различных молекулярно-биологических механизмов, эта проблема нуждается в дальнейшем изучении и развитии. При этом целесообразно изучение клинико-морфологических особенностей аутоиммунных буллезных дерматозов конкретно больных дерматозами в Московской области. В процессе исследования клинико-патогенетических особенностей буллезных дерматозов следует изучить: влияние величины титров циркулирующих аутоантител и степени интенсивности фиксации иммунных комплексов на течение аутоиммунных буллезных дерматозов; участие ранних компонентов комплемента в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов; степень экспрессии некоторых антигенов десмосом и цитоскелета как показателя характера поражения эпидермиса. Поскольку предметом исследований является патология, связанная с нарушениями в иммунной системе (аутоиммунные процессы) необходима оценка экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA I и II классов) на клетках тканей кожи, как одного из показателей участия антигенов гистосовместимости в развитии изучаемой патологии. Использование иммуногистохимических методов с целью изучения некоторых сторон патогенеза аутоиммунных буллезных дерматозов и антигенной структуры эпидермиса в норме и при патологии способствуют разработке дополнительных методов диагностики и тактики ведения больных.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение клинико-морфологических и иммунологических особенностей аутоиммунных буллезных дерматозов на примере больных Московской области и совершенствование способа их ранней диагностики и лечения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. 
   Изучить клинико-морфологические особенности аутоиммунных буллезных дерматозов, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и приобретенный буллезный эпидермолиз на современном этапе.
   
2. 
   Научно обосновать сущность возникновения симптома Никольского с точки зрения иммунопатологии и оценить его прогностическую ценность при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.
   
3. 
   Изучить роль и влияние циркулирующих аутоантител и фиксированных иммунных комплексов на течение аутоиммунных буллезных дерматозов.
   
4. 
   Исследовать участие ранних компонентов комплемента (C4, C4d, C3) в патогенезе аутоиммунных буллезных дерматозов.
   
5. 
   Определить степень экспрессии некоторых антигенов десмосом (десмосомальный протеин, кадгериновый комплекс) и цитоскелета (цитокератин 5) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.
   
6. 
   Изучить экспрессию некоторых антигенов базальной мембраны эпидермиса (коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.
   
7. 
   Провести оценку экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (HLA I и II классов) в биоптатах кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.
   
8. 
   Разработать на основе полученной молекулярно-биологической характеристики состояния различных структур тканей кожи схему детального иммуноморфологического анализа биопсии кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами с использованием моноклональных и поликлональных антител к белкам тканевых структур (кадгерины, десмосомальный протеин десмоплакин, цитокератин 5, коллаген IV типа, протеиновый комплекс основного вещества базальной мембраны lamina densa, HLA I класса и HLA-DR антигены).
   
9. 
   Разработать алгоритм ранней диагностики и контроля эффективности лечения аутоиммунных буллезных дерматозов.
   

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. 
   На современном этапе в регионе Московской области выявлена следующая закономерность распространения аутоиммунных буллезных дерматозов. Среди 267 больных аутоиммунными буллезными дерматозами 61,4% составили больные, страдающие аутоиммунной пузырчаткой, 33,3% - буллезным пемфигоидом, 3,4% - приобретенным буллезным эпидермолизом и 1,9% - линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом. При этом у 6% больных из 267 выявлен аутоиммунный буллезный дерматоз, протекающий на фоне неоплазии (паранеопластическая пузырчатка - 62,5%, буллезный пемфигоид - 25% и приобретенный буллезный эпидермолиз - 12,5%).
   
2. 
   При аутоиммунных буллезных дерматозах патогенетическую роль могут играть аутоантитела, относящиеся к иммуноглобулинам классов G и/или А, и иммунные комплексы в растворимой и нерастворимой формах. При этом мишенями могут быть не только специфические антигены, характерные для определенной группы буллезного дерматоза, но и антигены ряда других структур органов и тканей. Наличие такого широкого спектра антител к различным антигенам-мишеням объясняет тяжесть и разнообразие клинических проявлений болезни, например, в частности при паранеопластической пузырчатке.
   
3. 
   Установлен факт участия ранних компонентов комплемента как в местах локализации антител, так и вне зоны антигенов-мишеней. При этом С4d как наиболее стойкий компонент комплемента может служить дополнительным маркером гуморального ответа в оценке патологического процесса.
   
4. 
   Наличие симптома Никольского (механическая отслойка эпидермиса) как одного из первых «инструментов» в диагностике аутоиммунной пузырчатки (71,9%) в случаях буллезного пемфигоида (3,4%) и приобретенного буллезного эпидермолиза (66,7%) обуловлено вовлечением в патологических процесс системы десмосомального аппарата.
   
5. 
   Получена с помощью моноклональных и поликлональных антител к ряду антигенов кожи (кадгериновый комплекс, десмосомальный протеин, цитокератин 5, коллаген IV типа, белковый комплекс основного вещества lamina densa, антигены главного комплекса гистосовместимости) дополнительная молекулярно-биологическая характеристика изменений в коже при аутоиммунных буллезных дерматозах. Это позволило оценить глубину происходящих иммунопатологических процессов, эффективность проводимой терапии, а в ряде случаев получить дополнительный диагностический способ при дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.
   

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

• 
  Разработан алгоритм включения методов дифференциальной диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов: клинические проявления с определением симптома Никольского; цитологический метод с выявлением акантолитических клеток (клетки Тцанка); гистологический метод с определением уровня образования пузыря; иммунологический и иммуногистохимический методы исследования с определением наличия в сыворотке крови больных аутоантител и фиксированных иммунных комплексов в тканях; определение степени экспрессии ряда белковых компонентов в тканях.
  

• 
  Для дополнительной характеристики иммунопатологического процесса при аутоиммунных буллезных дерматозах использован молекулярно-биологический подход с применением антител к антигенам тканевых структур кожи.
  

• 
  Впервые детально изучена значимость вовлечения циркулирующих аутоантител, фиксированных иммунных комплексов и ранних компонентов комплемента и их взаимосвязь с особенностями клинического течения ряда аутоиммунных буллезных дерматозов.
  

• 
  Впервые проведена оценка клинической специфичности и патогенеза симптома Никольского у больных, страдающих различными аутоиммунными буллезными дерматозами, включая аутоиммунную пузырчатку, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз.
  

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предлагаемый комплекс иммунологических и иммуноморфологических исследований для получения дополнительных сведений о патологических процессах, происходящих при аутоиммунных буллезных дерматозах, с целью установления и/или уточнения их диагноза будет способствовать назначению адекватной терапии (с учетом патогенетических механизмов) и оценки степени ее эффективности.

ВНЕДРЕНИЕ РАБОТЫ

Результаты работы внедрены в практику отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, на кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ, на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М.Сеченова, Московского областного кожно-венерологического диспансера. Опубликованы: монография «Меченые антитела в нормальной и патологической морфологии» (М., 2000); медицинская технология «Метод стабилизации растворимых иммунных комплексов в биоптатах кожи больных буллезными дерматозами» (Москва, 2008 г.). Получен патент № 2097768 на изобретение «Способ диагностики пузырчатки» от 27.11.1997 г. Получено решение о выдаче патента на изобретение № 2008108389/15 (009070) «Способ диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов» от 27.10.2008. В ФИПС подана заявка № 2008144767 на изобретение «Способ прогнозирования возможности изменения клинической формы пузырчатки» от 13.11.2008.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Диссертация апробирована на научной конференции сотрудников отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии, кафедры дерматовенерологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, кафедры кожных и венерических болезней ФППО ММА им. И.М. Сеченова. Материалы диссертации доложены на VII Российском съезде дерматовенерологов (Россия, Казань, 1996 г.), VIII, IX и X Всероссийском съезде дерматовенерологов (Россия, Москва, 2001, 2005 и 2008 г.г.), научно-практической конференции, посвященной 75-летию ЦНИКВИ (Россия, Москва, 1996 г.), научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматоонкологии. Новые лекарственные препараты в практике дерматовенерологии» (Россия, Москва, 2002 г.), IV международной конференции «Экспериментальная и клиническая медицина» (Грузия, Тбилиси, 2002 г.), Первом Российском конгрессе дерматовенерологов (Россия, Санкт-Петербург, 2003 г.), конференции, посвященной памяти Машкиллейсона Асафа Львовича (Россия, Москва, 2004, 2008 г.г.), научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи» (Россия, Москва, 2006 г.), VI-VII научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика» (Россия, Москва, 2006 и 2008 г.г.), XIII-XIV-XV Российском национальном конгрессе «Человека и лекарство» (Россия, Москва, 2006, 2007 и 2008 г.г.), научно-практических конференциях «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии» (Россия, Москва, 2007 и 2008 г.г.), II Форуме Национального Альянса дерматологов и косметологов (Россия, Ростов-на-Дону, 2008 г.), I Международном Форуме медицины и красоты (Россия, Москва, 2008 г.).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 56 печатных работ, в том числе 1 монография.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 357 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 85 рисунками, заключающими в себе 231 микрофотографию.

Библиографический указатель включает 125 отечественных и 831 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ра­бо­та вы­пол­не­на на ос­но­ва­нии кли­ни­че­ско­го об­сле­до­ва­ния и изу­че­ния био­псий­но­го ма­те­риа­ла боль­ных аутоиммунными буллезными дерматозами. За период с 1992 по 2006 год установлен первичный диагноз буллезного дерматоза аутоиммунного происхождения 267 больным, из них 164 боль­ным диагносцирована аутоиммунная пузырчатка (вульгарная, вегетирующая, листовидная, себорейная, паранеопластическая), 89 боль­ным - бул­лез­ный пем­фи­гои­д, 5 больным - линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз и 9 больным - приобретенный буллезный эпидермолиз. Об­сле­до­ва­ние боль­ных про­во­ди­лось в от­де­ле­нии дер­ма­то­ве­не­ро­ло­гии и дер­ма­то­он­ко­ло­гии ГУ МО­НИ­КИ (Мо­с­ков­ский об­ла­ст­ной на­уч­но-ис­сле­до­ва­тель­ский кли­ни­че­ский ин­сти­тут) им. И.М.Владимирского, в Мо­с­ков­ском об­ла­ст­ном кож­но-ве­не­ро­ло­ги­че­ском дис­пан­се­ре (МОКВД) и ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий (лаборатория трансплантационной иммунологии).

В ка­ж­дом слу­чае ди­аг­ноз за­бо­ле­ва­ния ста­вил­ся на ос­но­ва­нии анам­не­сти­че­ских све­де­ний, кли­ни­че­ской кар­ти­ны с определением симптома Никольского, ре­зуль­та­тов ци­то­ло­ги­че­ско­го, па­то­мор­фо­ло­ги­че­ско­го, им­му­но­ло­ги­че­ско­го и им­му­но­мор­фо­ло­ги­че­ско­го ис­сле­до­ва­ний.

Ци­то­ло­ги­че­ское и патоморфологическое ис­сле­до­ва­ния про­водились в ла­бо­ра­то­рии МОКВД и в отделении патоморфологии ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, соответственно. Иммунологические и иммуноморфологические исследования проведены лично автором на базе лаборатории трансплантационной иммунологии ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий (с 1988 по 2004 год заведующая, к.б.н. Баранова Ф.С.; в настоящее время заведуюший, к.м.н. Абрамов В.Ю.).

Метод определения симптома Никольского и оценка его чувствительности, специфичности и прогностической ценности для постановки клинического диагноза. Симптом Никольского вызывался стандартным способом [Глухенький Б.Т., С.А.Грандо, 1990]. При этом использовали две его модификации: «прямой» и «краевой» (маргинальный). В первом случае отслойка верхних слоев эпидермиса возникала на видимо «здоровой» коже при легком скользящем трении пальцем по ней. Во втором – при потягивании за обрывок покрышки пузыря отслойка эпителия происходила за пределы зоны поражения в виде постепенно суживающейся ленты по направлению к видимо здоровой коже. Необходимо отметить, что у всех обследуемых 267 больных симптом Никольского определялся в активной стадии патологического процесса до назначения глюкокортикостероидной и иммуносупрессивной терапии.

С целью определения специфичности, чувствительности и прогностической ценности симптома Никольского в диагностике пузырчатки учитывался ряд параметров, ранее предложенных S.Uzun и М. Durdu [Uzun S., Durdu M., 2006] - 1) чувствительность (истинно положительный/ (истинно положительный + ложноотрицательный); 2) специфичность (истинно отрицательный/истинно отрицательный + ложноположительный); 3) положительная прогностическая ценность (истинно положительный/ истинно положительный + ложноположительный) и 4) отрицательная прогностическая ценность (истинная отрицательная/(истинно отрицательная + ложноотрицательная).

Истинно положительным результат признавался при положительном симптоме Никольского у больных аутоиммунной пузырчаткой; ложноположительным - при положительном симптоме Никольского у больных буллезным пемфигоидом, линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом и приобретенным буллезным эпидермолизом; истинно отрицательным результат - при отрицательном симптоме Никольского у больных с буллезным пемфигоидом, линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом и приобретенным буллезным эпидермолизом; ложноотрицательным - у больных пузырчаткой с отрицательным симптомом Никольского.

Ме­тод вы­яв­ле­ния цир­ку­ли­рую­щих ау­то­ан­ти­тел. Ме­тод непрямой иммунофлюоресценции при ис­сле­до­ва­нии цир­ку­ли­рую­щих в кро­ви боль­ных ау­то­ан­ти­тел был ис­поль­зо­ван в при­ня­той фор­ме [Белецкая Л.В., Данилова Т.А., 1977; Beutner E.H., Jordon R.E., 1964]. При изу­че­нии цир­ку­ли­рую­щих в кро­ви ан­ти­тел крио­стат­ные сре­зы го­то­ви­ли из тка­ней ко­жи че­ло­ве­ка и ря­да ви­дов ла­бо­ра­тор­ных жи­вот­ных (мы­ши, кры­сы, кро­ли­ки, обезь­я­ны), так как ау­то­ан­ти­те­ла при акан­то­ли­ти­че­ской пу­зыр­чат­ке и бул­лез­ном пем­фи­гои­де на­прав­ле­ны к тка­нес­пе­ци­фи­че­ским ан­ти­ге­нам, имею­щим­ся в ор­га­нах боль­шин­ст­ва ви­дов жи­вот­ных клас­са мле­ко­пи­таю­щих [Koch H., Schaller J., Haustein U.F., 1992]. Раз­ли­чия в ре­ак­ци­ях на сре­зах тка­ней раз­ных ви­дов жи­вот­ных но­си­ли лишь ко­ли­че­ст­вен­ный ха­рак­тер. Наи­бо­лее чув­ст­ви­тель­ны­ми в на­ших опы­тах ока­за­лись тка­ни гу­бы кры­сы и пи­ще­во­да кро­ли­ка. Крио­стат­ные не­фик­си­ро­ван­ные сре­зы тол­щи­ной 5 мкм тща­тель­но про­мы­ва­ли физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), рН 7,0-7,4, в те­че­ние 10 мин, за­тем сре­зы сна­ча­ла об­ра­ба­ты­ва­ли ис­сле­дуе­мой (про­ме­жу­точ­ной) не­ме­чен­ной сы­во­рот­кой. Эту сы­во­рот­ку при­ме­ня­ли в мак­си­маль­но боль­шом чис­ле раз­ве­де­ний. Учи­ты­ва­ли са­мое боль­шое раз­ве­де­ние, ко­то­рое да­ва­ло чет­кую по­ло­жи­тель­ную ре­ак­цию. Об­ра­бот­ку сре­зов про­во­ди­ли во влаж­ной ка­ме­ре при ком­нат­ной тем­пе­ра­ту­ре в те­че­ние 45-60 мин. Да­лее сре­зы про­мы­ва­ли в те­че­ние 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,4), об­ра­ба­ты­ва­ли ме­че­ной сы­во­рот­кой про­тив иммуноглобулина (Ig) че­ло­ве­ка клас­са G в те­че­ние 30 мин, вновь про­мы­ва­ли 3-5 мин PBS и за­клю­ча­ли под по­кров­ное стек­ло в 60% ней­траль­ный гли­це­рин. Од­но­вре­мен­но ста­ви­ли по­ло­жи­тель­ный и от­ри­ца­тель­ный кон­тро­ли. В ка­че­ст­ве от­ри­ца­тель­но­го кон­тро­ля ис­поль­зо­ва­ли нор­маль­ную сы­во­рот­ку (че­ло­ве­ка или жи­вот­но­го) в тех же раз­ве­де­ни­ях и ин­ку­би­ро­ва­ли на сре­зе столь­ко же вре­ме­ни, как и ис­пы­туе­мую сы­во­рот­ку, со­дер­жа­щую ан­ти­те­ла. В ка­че­ст­ве по­ло­жи­тель­но­го кон­тро­ля ис­поль­зо­ва­ли сы­во­рот­ку, со­дер­жа­щую ан­ти­те­ла про­тив изу­чае­мо­го ан­ти­ге­на.

Пер­вич­ная об­ра­бот­ка био­псий­но­го ма­те­риа­ла. Под ме­ст­ной ане­сте­зи­ей 2,0% рас­тво­ром но­во­каи­на про­во­ди­лась био­псия ко­жи (из по­ра­жен­ных и кли­ни­че­ски не­по­ра­жен­ных уча­ст­ков) раз­ме­ром 0,3 х 0,5 см. Ку­соч­ки тка­ней ко­жи за­мо­ра­жи­ва­ли при минус 20˚С. Сре­зы тол­щи­ной 4-5 мкм го­то­ви­ли в крио­ста­те (минус 20˚С) и ис­поль­зо­ва­ли часть се­рий­ных сре­зов в не­фик­си­ро­ван­ном ви­де. Часть крио­стат­ных се­рий­ных сре­зов, фик­си­ро­ван­ных 96˚ эта­но­лом, ок­ра­ши­ва­ли ге­ма­ток­си­ли­ном и эо­зи­ном с це­лью мор­фо­ло­ги­че­ско­го кон­тро­ля.