На правах рукописи

Юшкова Елена Ильинична
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМИНОВОГО КОМПЛЕКСА РАЗЛИЧНОГО ПРИСХОЖДЕНИЯ

И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ

03.01.05 – физиология и биохимия растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Воронеж - 2010
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Орловском государственном аграрном университете», ГНУ ВНИИЗБК РАСХН.

Научный консультант:	доктор биологических наук, профессор Павловская Нинель Ефимовна
Официальные оппоненты:	доктор биологических наук, профессор Попов Василий Николаевич доктор биологических наук, профессор Корнеева Ольга Сергеевна доктор биологических наук, профессор Заякин Владимир Васильевич
Ведущая организация:	ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сельского хозяйства и торфа СО РАСХН

Защита диссертации состоится «2» ноября 2010 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Россия, г. Воронеж, Университетская площадь – 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Автореферат разослан « » сентября 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Л.И. Брехова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Основной частью гумуса являются гумусовые кислоты (гуминовые кислоты, фульвокислоты, гиматомелановые кислоты). Гумусовые кислоты аккумуляторы органического вещества почвы – аминокислот, углеводов, пигментов, биологически активных веществ. Кроме того, в гумусовых кислотах концентрируются ценные неорганические компоненты – элементы минерального питания (азот, фосфор, калий), а также микроэлементы (железо, цинк, медь, марганец, бор, молибден и т.д.) (Кононова М.М., 1963; Александрова Л.Н., 1980; Орлов Д.С., 1990; Горовая А.И., Орлов Д.С., 1995). Многочисленными исследованиями установлено стимулирующее действие гуминовых веществ, особенно гуминовых кислот и их солей, на рост и развитие растений, повышение их устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды, стимулирование прорастания семян, повышение продуктивности крупного рогатого скота и птицы.

Гуминовые кислоты, являясь составной частью объектов природного происхождения, находят самостоятельное применение в медицинской практике, фармации, косметологии. Создание оригинальных фармакотерапевтических препаратов с биостимулирующими и репаративными свойствами, средств для косметологии на основе гуминовых и гуминоподобных веществ, остается актуальным направлением исследований (Филов В.И., Беркович А.М., 2000; Солдаткина М.Н., 2006; Федько И.В., Гостищева М.В., Исматова Р.Р., 2005).

Особого внимания заслуживают адаптогенные свойства гуминовых веществ, обусловленные их способностью связывать радионуклиды, ионы тяжелых металлов, разрушать пестициды по истечении срока их действия, облегчать и ускорять процесс детоксикации культурных растений.

Спецификой гуминовых веществ является их вероятностный характер, обусловленный особенностями образования в результате естественного отбора устойчивых структур. Как следствие, к фундаментальным свойствам гуминовых веществ относятся нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперсность. В связи с этим понятие молекулы для гуминовых веществ трансформируется в молекулярный ансамбль. Поэтому к ним не применим традиционных способ описания строения органических соединений, характеризующий количество атомов в молекуле, число и типы связей между ними.

Привлечение новейших физико-химических методов исследования гумусовых кислот, выделенных из различных природных объектов, дает возможность охарактеризовать их качественно и количественно. Полученные данные могут быть привлечены для объяснения строения и функций гумусовых кислот и, в связи с этим, механизмов их влияния на растительные и животные ткани, а также, причины изменения иммунного статуса организмов.

Исследования должны идти по пути поисков экологически безопасных биоактивных препаратов, способных влиять на фитоимунные процессы. Изучение механизмов формирования защитных и ростостимулирующих свойств у сельскохозяйственных растений под действием гуминовых препаратов позволит дать научное обоснование практического использования новых средств защиты. Однако, следует отметить, что ранее проведенные исследования осуществлялись в различных условиях и на образцах, полученных из различных природных объектов. Это в значительной степени осложняет сопоставление результатов и сравнение физико-химических свойств и физиолого-биохимической активности препаратов на основе гумусовых кислот (Алтунин Д.А., и др., 2000; Ищенко А.Ф., 2004; Кулик А.Ф., Горовая А.И., 1980; Шевелуха В.С., 1990).

Для получения гуминовых препаратов необходимо наличие биогумуса – первоисточника биологически активных веществ. Однако производство и практическое использование вермикомпостов осуществляется во многих случаях без достаточного научно-технического обеспечения, без надлежащего агрохимического и санитарно-гигиенического контроля. Кроме того, состав и физико-химические свойства гумусовых веществ имеют решающее значение для стандартизации различных видов вермикомпостов. Вместе с тем, до сих пор не разработан регламент получения вермикомпостов и критерии степени их зрелости.

Указанная ситуация определяет актуальность постановки систематических исследований по изучению состава, строения и свойств гуминовых веществ, входящих в состав биогумуса.

Цель исследования - изучить биологическую активность гуминового комплекса различного происхождения и выяснить разнообразные аспекты его действия на рост и развитие сельскохозяйственных растений.

В работе были поставлены следующие основные задачи:

- получить биогумус из разных видов компостов;

- исследовать вермикомпосты, полученные из разных субстратов, и определить интенсивность и механизмы гумификации;

- методами ВЭЖХ и сканирующей микроколориметрии провести анализ степени гумификации;

- используя гель-хроматографические методы, определить молекулярные массы белков биогумуса и жирнокислотный состав в исследованных препаратах;

- адаптировать существующие или разработать новые методики анализа для получения достоверных данных о составе, физико-химических и биологических характеристиках вермикомпостов;

- выделить и фракционировать гумусовые кислоты, исследовать их физико-химические свойства;

- провести сравнительное исследование гумусовых кислот, полученных из вермикомпостов различного происхождения;

- исследовать препараты гуминового комплекса разного срока созревания с помощью метода C¹³ ЯМР спектроскопии для идентификации и количественного определения функциональных групп и молекулярных фрагментов;

- выделить биологически активные вещества вермикомпоста и испытать их действие на устойчивость к биоте и хозяйственно-ценные показатели сельскохозяйственных культур;

- в полевых и лабораторных условиях выявить биологическую активность и сортоспецифичность препарата гуминового комплекса для разработки биологически активных фитоиммуномодуляторов.

Научная новизна.

Работа является комплексным исследованием, посвященным разработке методологии анализа органических объектов нерегулярного строения и анализу полученной информации, позволяющей прогнозировать их свойства.

Установлено влияние сроков созревания и природы субстрата для оценки агрономических, физико-химических и физиолого-биохимических характеристик вермикомпостов.

Разработаны методики выделения гумусовых кислот и их фракционирования. Впервые разработана и применена оптимизированная одноступенчатая методика извлечения гумусовых кислот, позволившая значительно сократить время экстракции.

Для хроматографической характеристики фульвокислот впервые разработан и применен метод ВЭЖХ в обращенных фазах.

Для исследования термодинамических характеристик комплекса гумусовых веществ и гуминовых кислот разработан и применен метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.

Исследована антиоксидантная система гороха при обработке препаратом гуминового комплекса. Усовершенствована тест диагностика иммунизирующих и стимулирующих свойств биологически активных веществ.

Исследована возможность использования препарата гуминового комплекса для индуцирования устойчивости сельскохозяйственных растений к болезням и вредителям и повышения продуктивности.

Практическая значимость работы.

Получены разносторонние характеристики вермикомпостов, на основе различных субстратов, которые могут быть использованы с целью оценки степени завершенности процесса гумификации.

Данные, полученные при изучении химического, микробиологического состава и ферментативной активности вермикомпостов существенно дополняют представления о закономерностях трансформации органического вещества при участии вермикультуры.

Результаты исследований видового состава микробиологических сообществ вермикомпостов могут быть использованы для разработки рекомендаций санитарно-микологического контроля соответствующих производств.

Разработан комплекс методик анализа гумусовых кислот, включающий в себя: определение элементарного состава в расчете на безводную беззольную пробу; условия получения количественных ¹³С ЯМР спектров; гель-хроматографическое определение молекулярных масс. Комплекс данных методик может быть внедрен в практику лабораторий химико-аналитического профиля.

Выделен гуминовый комплекс, обладающий иммунокорректирующим действием на растения, на основе которого возможно создание новых эффективных экологически безопасных средств защиты растений.

Существенный практический выход имеют данные о механизме фитогормонального действия гуминового комплекса, позволяющие диагностировать комплексную устойчивость сортообразцов к патогенам. Метод биотестирования (применения тест-систем) может служить в качестве метки в иммуноферментном анализе и предшествовать испытанию препаратов в полевых условиях.

Представлены рекомендации и разработан регламент применения гуминового комплекса при культивировании сельскохозяйственных культур.

Материалы исследования используются в учебном процессе кафедры общей, биологической, фармацевтической химии и фармакогнозии МИ ОГУ и кафедр физиологии и биохимии растений, биотехнологии и кормопроизводства ОГАУ при чтении курсов «Биотехнология», «Экология и охрана природы», «Физиология растений»; при выполнении дипломных проектов и кандидатских диссертационных работ.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2004), Втором съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004), Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы современной химии в исследованиях молодых ученых» (Астрахань, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы химии и методики ее преподавания» (Нижний Новгород, 2006, 2009), VI, VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика – 2006» (Самара, 2006) «Экоаналитика – 2009» (Йошкар-Ола, 2009), II Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием (к юбилею академика Ю.А. Золотова) (Краснодар, 2007), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (к юбилею профессора О.Г. Ларионова) (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Инновационные технологии обеспечения безопасности питания и окружающей среды» (Оренбург, 2007), I, II Международной научно-практической конференции «Вермикультивирование и вермикомпостирование как основа экологического земледелия в XXI веке: проблемы, перспективы достижения» (Минск, Белоруссия, 2007, 2010), 55, 56 Всероссийской научно-практической конференции химиков с международным участием «Актуальные проблемы модернизации химического и естественнонаучного образования» (С-Петербург, 2008, 2009), Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология. Биомедицинская инженерная и технология современных социальных практик» (Курск, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 работ, в том числе коллективная монография.

Декларация личного участия автора. Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в формировании направления, активном участии во всех этапах исследования, постановке конкретных задач и их экспериментальном решении, интерпретации и обсуждении экспериментальных данных.

Положения, выносимые на защиту:

1. 
   Предложенная методология анализа гумусовых кислот методами ВЭЖХ и сканирующей микрокалориметрии позволяют контролировать процесс гумификации.
   
2. 
   Существуют корреляционные зависимости между структурно-групповым, молекулярно-массовым составом гумусовых кислот и источником происхождения (субстратом), периодом, а также временем вермикомпостирования, подтверждающиеся методами элементарного анализа, спектроскопии ЯМР на ядрах ¹³С, эксклюзионной хроматографии.
   
3. 
   Химическая структура и биохимические эффекты могут различаться в зависимости от способов извлечения, очистки и фракционирования препаратов; прогнозирование особенностей их свойств по общим элементам структуры возможно путем экспериментального анализа.
   
4. 
   Природные компоненты препарата гуминового комплекса обладают иммуномоделирующими свойствами и могут служить основой для создания новых средств защиты растений.
   
5. 
   Ферменты антиоксидантной системы клеток: супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза являются диагностическим тестом на выявление биологической активности и подбор эффективных концентраций препаратов.
   
6. 
   Полученный препарат гуминового комплекса усиливает пероксидазозависимый иммунитет и повышает продуктивность сельскохозяйственных культур.
   

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 356 страницах машинописного текста, содержит 121 рисунок, 39 таблиц и состоит из введения, 6 глав, заключения, основных выводов и списка литературы, приложения. Список цитируемой литературы включает 430 наименований, из которых 150 зарубежные.

Настоящая работа представляет собой часть плановых научно-исследовательских работ Орловского государственного университета, Орловского государственного аграрного университета. Исследования проводились также в сотрудничестве с Всероссийским научно- исследовательским институтом зернобобовых и крупяных культур РАСХН в рамках программы ГНЦ «Разработка методов повышения иммунных свойств, диагностики и интегрированных систем защиты зернобобовых и крупяных культур от болезней и вредителей»; институтом биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обосновывается актуальность исследования, его практическая и теоретическая значимость; сформулированы цель и основные задачи работы; намечены пути их реализации.

ГЛАВА 1. Общая характеристика и методы исследования гуминовых веществ различных природных объектов (литературный обзор)

В главе представлен свод основных работ, посвященных общей характеристике биогумуса и гуминовых веществ; рассмотрению состава, функций гуминовых веществ в почвенных экосистемах; физиолого-биохимической характеристике и применению их в медицине. Поскольку основной составной частью гуминовых веществ являются гумусовые кислоты, то особое внимание уделено способам выделения, исследованию состава и свойств гумусовых кислот. Анализ литературных данных дает возможность охарактеризовать качественно и количественно с использованием новейших физико-химических методов исследования гумусовые кислоты, выделенные из различных природных объектов.

ГЛАВА 2. методики получения препаратов биогумуса и гумусовых кислот.

ОБЪЕКТЫ и Методы исследования

Биогумус как основа для получения биологически активных веществ произведен в результате жизнедеятельности элитной промышленной линии дождевых (компостных) червей Владимирский гибрид «Старатель». Выращивали червей на различных субстратах (компосты: конский, свиной, птичий; осадок сточных вод). Для исследований получены образцы биогумуса разного периода созревания: с января по апрель – «зимний»- образец, с апреля по октябрь – «летний» - образец; разного срока созревания (1,5 месяца компостирования, 3 месяца, 6 месяцев).

Агрохимические и микробиологические характеристики биогумуса проводили по следующим методикам: определение фосфора и калия по Кирсанову в модификации ЦИНАО, количество аммиачного и нитратного азота в почве методом Корнфильда (Радов А.С. и др., 1985); содержание золы, концентрацию водородных ионов в субстратах и биогумусе по Петербургскому А.В. (1968); аммонифицирующую активность и содержание нитратов по Радову А.С. (1985). Чистые культуры микроорганизмов выращивали на среде Чапека. Целлюлозоразрушающую активность определяли модифицированным методом Кристенсена (Ежов Г.И., 1981).

следующая страница>