Chronic lymphocytic leukemia: novel prognostic factors and their relevance for risk-adopted therapeutic strategies

Хронический лимфолейкоз: современные прогностические факторы и риск-адаптированные стратегии
Marco Montillo, Terry Hamblin, Michael Hallek, Emil Montserrat, Enrica Morra
(aвторы из Италии, Великобритании, Германии, Испании)
Haematologica 2005; 90:391-399
Перевод к.м.н. Даниленко А.А., ГУ МРНЦ РАМН (Обнинск)
В течение последнего десятилетия в понимании хроническогого лимфолейкоза (ХЛЛ) достигнуты значительные успехи. С точки зрения клинической перспективы значение новых знаний заключается в их способности влиять на выбор терапии. Много лет назад было установлено, что немедленное начало терапии при ранних стадиях заболевания не дает никаких преимуществ перед тактикой наблюдения и ожидания прогрессирования¹. Эта стратегия базировалась на результатах неэффективной терапии хлорбутином больных, не стратифицированных согласно современным прогностическим маркерам. Оценка прогноза больных ХЛЛ претерпела революционные изменения. Так, было показано, что, кроме классических клинических параметров, некоторые биологические особенности также коррелируют с прогнозом и могут повысить прогностическую ценность систем клинического стадирования Rai и Binet ^{2, 3}. Клинические классификации, внедренные около 30 лет назад, эффективны относительно сортирования пациентов на большие прогностические группы, обеспечивая информацию как для выбора терапии, так и для проведения клинических исследований с возможностью сравнения пациентов с одинаковым прогнозом. Тем не менее, эти системы не способны точно предсказать течение заболевания индивидуального пациента без включения новых знаний о молекулярной патологии ХЛЛ.
Новые прогностические факторы ХЛЛ
Аберрации генома
Цитогенетика является одним из самых мощных прогностических инструментов у больных острыми лейкозами. Цитогенетические исследования больных ХЛЛ не применялись широко вплоть до недавнего времени. Обычные группирующие методики у больных ХЛЛ затруднены из-за низкого митотического индекса и субоптимального качества метафазы опухолевых клеток. Внедрение метода исследования интерфазы – FISH – значительно повысило чувствительность цитогенетических исследований. FISH имеет два преимущества по сравнению с обычными цитогенетическими методами: 1) позволяет определять специфические повреждения хромосом неделящихся клеток, что было бы исключено при анализе метафазы, и 2) делает возможным определить потерю хромосомного материала до ста килобаз; потеря таких размеров находится далеко за пределами разрешающей способности группирующих методов. С помощью FISH нарушения могут быть обнаружены у 80% больных при использовании 4-пробной панели для определения трисомии 12q13 и делеции 13q14, 17p13 и 11q22-23. Еще у 10% больных могут быть делеция 6q21, транслокация 14q32, и частичная трисомия 3q или 8q. Частота этих цитогенетических повреждений, определенная в большом исследовании, была следующей: 13q, 36%; трисомия 12q, 14%; 11q-, 17%; 17p-, 7%; другие повреждения, 8%; отсутствие определяемых повреждений, 18% ⁴. В работе Dohner ⁴ и последнем исследовании MRC (неопубликованные данные), в которых получены схожие кривые, могла быть переоценена частота негативных хромосомных нарушений из-за неизбежного «фона» отбора больных, возникшего в связи с участием в исследовании Dohner других центров, а в работе MRC – из-за исключения не нуждавшихся в терапии больных. В серии Bournemouth, состоявшей из не отобранных больных, большинство из которых не нуждалось в терапии, частота нарушений 11q и 17p была ниже (неопубликованные данные).

Вышеупомянутое прогностическое значение цитогенетических факторов имеет отношение к ХЛЛ: медиана выживаемости больных с 13q- составляет 133 мес., пациентов с трисомией 12q – 114 мес., у пациентов с неопределяемыми отклонениями – 111 мес., с 11q- -

- 79 мес., и, наконец, с 17p- - 32 мес.
Серологические параметры.
Некоторые серологические параметры, такие, как β2-микроглобулин (β2-MG), тимидиновая киназа (ТК), и растворимый CD23 являются независимыми прогностическими факторами, имеющими важное значение вслед за обычным стадированием заболевания ^5-7. β2-MG является внеклеточным протеином, нековалентно связанным с а-цепью большого комплекса гистосовместимости (МНС) класса 1, определяемого в сыворотке. Β2-MG связан с плохим прогнозом при первичном диагностировании, и с повышенными его значениями у больных с короткой выживаемостью ⁵. Оцененный в контексте с другими прогностическими параметрами, β2-MG , по-видимому, имеет самостоятельное прогностическое значение ⁸.

Активность сывороточной ТК (s-ТК) у больных ХЛЛ, возможно, связана с количеством делящихся опухолевых клеток, отражая опухолевую массу и уровень клеточной пролиферации. Способность уровня s-ТК определять подгруппы пациентов с ранним ХЛЛ и высоким риском быстрого прогрессирования кажется особенно полезным. По результатам CCL1-исследования Германской Группы Изучения ХЛЛ уровень s-TK оказался среди 4-х наилучших параметров, предсказывающих короткий период безрецидивной выживаемости ⁶.

CD23 является функциональной молекулой на поверхности В-ХЛЛ клеток. Повышенный сывороточный уровень ее расщепленной формы (sСD23) означает худший прогноз ⁷. Тем не менее, это не утверждено в качестве независимого прогностического признака. Значимость некоторых серологических маркеров в настоящее время ограничена из-за недостатка стандартных методов их оценки, использования разных лабораторных методик в различных сериях, отсутствия оценок в проспективных исследованиях. Представляется привлекательным включить разные серологические маркеры, каждый из которых вносит свой вклад в определение прогноза, в прогностические модели, подразумевая, что их совместное использование, объединяющее различные биологические аспекты ХЛЛ, позволит получать большую, чем при отдельном применении, информацию ⁹. Опубликовано несколько исследований по уровням LDH при ХЛЛ. Некоторыми авторами не получено различия в активности LDH опухолевых и нормальных В-клеток ¹⁰. Одной из групп предложен биологический индекс, объединяющий уровни LDH и β2-MG, имеющий, по всей видимости, прогностическое значение ¹¹.
Мутационный статус генов иммуноглобулина и суррогатные маркеры.
В 1999 г. две группы исследователей показали, что у пациентов с иммунофенотипом клеток памяти наличие мутированных генов иммуноглобулина (IGVH) связано с наиболее благоприятным течением и малой вероятностью прогрессирования заболевания, в то время как отсутствие этих мутаций сопряжено с высоким риском прогрессирования и короткой выживаемостью ^{12, 13}. В серии Hamblin et al. медиана выживаемости больных без мутации гена составила 8 лет, в то время как с наличием IGVH – 25 лет.

Хотя существует тенденция появления негативных изменений кариотипа главным образом в подгруппе больных с не мутированным IGVH, эта связь не абсолютна, а отклонения кариотипа и статус мутации гена иммуноглобулина являются самостоятельными прогностическими факторами. Медиана выживаемости пациентов с не мутированными генами Ig и делециями 17р составляет всего около 3 лет ^{14, 15}. К сожалению, изучение IGVH трудно воспроизводимо в обычной лаборатории, поэтому этот аспект в настоящее время упускается у большинства больных ХЛЛ.

CD38 является белком мембраны, обозначающим клеточную активацию и созревание, и обладающим сигнальной активностью. Экспрессия CD38 связана с наличием атипичной морфологии неопластических клеток, наличием диффузной инфильтрации костного мозга, высоким периферическим лимфоцитозом и менее благоприятным прогнозом ¹⁶. В других исследованиях обнаружено частое совмещение наличия экспрессии CD38 и наличие мутационного статуса IGVH, хотя и не всегда, при этом CD38 может экспрессироваться периодически. CD38 в настоящее время рассматривается как независимый прогностический маркер с самостоятельной клинической значимостью ¹⁷.

В первом исследовании профиля экспрессии генов у больных ХЛЛ определена панель генов, в которой экспрессия небольших подгрупп генов, включая энкодирующих ZAP-70, IM1286077, и С-тип лектина, коррелировала со статусом мутации IGVH-генов ¹⁶.

ZAP-70 представляет собой энзим, в норме экспрессируемый в Т-лимфоцитах, и является критическим для активации Т-клеток антигеном. Обнаружение ZAP-70 в опухолевых

В-лимфоцитах явилось неожиданным. Недавние данные свидетельствуют о том, что экспрессия ZAP-70-протеина ограничена клетками с не мутированными IGVH-генами ¹². Иммунофлуоресцентный метод идентификации экспрессирующих ZAP-70 опухолевых клеток не до конца стандартизирован, что до сих пор не позволяет использовать его в клинической практике ²⁰. Недавно опубликовано американское исследование, сравнившее проточно-флуометрическое определение ZAP-70 и статус мутации IGVH в предопределении начала первичной терапии в большой серии пациентов ²¹. Хотя была выявлена одинаковая способность этих маркеров, все же расхождение составило 23%. Это различие оказалось выше установленного европейскими исследованиями ^{19, 20}, что может объясняться 50% преобладанием количества больных в американской серии, применением различных антител, что также может привести к расхождению результатов, более молодой американской популяцией (медиана возраста-55 лет) по сравнению с Barcellona-изучением (60 лет) или Bournemouth (67 лет). Хотя из результатов американского исследования вытекает, что наличие ZAP-70 требует начала терапии, представляется все же, что одновременное использование данных о ZAP-70 и статуса мутации IgVH является более информативным.

Применение новых прогностических факторов для принятия клинических решений: определение групп риска.
ХЛЛ является комплексным заболеванием с довольно различным исходом. Принято считать, что не все больные ХЛЛ умирают от этого заболевания. Тем не менее, согласно последним исследованиям, больные с прогрессированием заболевания умирают преимущественно от его осложнений, чаще всего инфекционных ²². Разработка таких новых прогностических факторов, как мутационный статус генов вариабильных тяжелых цепей иммуноглобулина, цитогенетика, экспрессия СВ38, ZAP-70, и некоторые серологические маркеры, позволяет проводить дальнейшее подразделение больных на группы риска. Так, прогрессирующие и вялотекущие формы заболевания могут быть определены более точно, чем это было возможно ранее с помощью классификаций Rai и Binet. Разумеется, стадия А системы Binet соответствует хорошей в прогностическом отношении группе, составляющей около 65% всех больных ХЛЛ. В процессе течения заболевания 25% умирают от связанных с ХЛЛ причин, 40% прогрессируют до стадии В и С, а 50% требуют немедленного начала терапии ²².

В недавнем исследовании, изучавшем статус мутации IgVH у 145 пациентов со стадией А системы Binet, медиана общей выживаемости (ОВ) и безрецидивной выживаемости (БВ) были значительно меньше у больных с отсутствием мутаций по сравнению с другими (97 мес. по сравнению с не достигшими, р=0,0017, и 42 против 156 мес., р=0,0001) ²³. Поэтому определение пациентов с не мутированным IgVH из находящихся на стадии «А» Binet (или индолентные формы по Rai) позволит дать основание для изучения преимуществ раннего начала терапии в рамках проспективных рандомизированных исследований. Далее, в этом же исследовании изучение мутационного статуса позволило подразделить больных со стадиями В и С на две подгруппы с разной выживаемостью (медиана ОВ - 78 против 120 мес. у больных с отсутствие и наличием мутации соответственно, р=0,002). Таким образом, раннее распознавание агрессивной части стадии А и индолентной – стадий В и С обеспечит возможность более рационального подхода к выбору терапевтической тактики.

Должны ли пациенты с ХЛЛ оцениваться в клинической практике?
Соотношение стадий заболевания с новыми прогностическими факторами оценивалось только в ретроспективных исследованиях. Прогностическое значение статуса мутации IgVH, аберрации генома и экспресиия CD38 в отношении общей выживаемости изучалось у пациентов сразу всех стадий ¹⁵. Как было отмечено, стратификация пациентов ХЛЛ на прогностические группы с использованием новых молекулярных маркеров имеет возрастающее значение, позволяя рационализировать терапевтическую стратегию. В преддверии разработки прогностического индекса, текущая прогностическая информация для выявленных впервые больных ХЛЛ включает в себя определение стадии, ЛДГ (LDH), CD38, sTDK, идентификация генетических аберраций с помощью FISH, изучение мутационного статуса IgVH, и ZAP-70.

Пациентам с хорошим общим статусом и неблагоприятными прогностическими факторами следует предлагать участие в клинических исследованиях.

Лечение больных ХЛЛ.
Разработка эффективных программ терапии перевело многие гемобластозы (болезнь Ходжкина, острые миелоидная и лимфоидная лейкемии, диффузная крупноклеточная лимфома), считавшиеся ранее неизлечимыми, в разряд излечиваемых заболеваний, по крайней мере в некоторых случаях. Терапевтической тактикой при ХЛЛ в течение многих лет было осуществление контроля лейкоцитоза и связанных с прогрессированием заболевания симптомов. С внедрением новых лекарственных препаратов и их комбинаций уровень терапевтической цели был поднят до достижения молекулярной ремиссии, особенно у не пожилых людей. Ликвидация минимальной остаточной опухоли, определяемой цепной реакцией полимеразы (PCR) или с помощью четырехцветной проточной цитофлюорометрии вскоре заменит или дополнит цели, намечаемые в клинических исследованиях. Все же паллиативная тактика остается для пожилых пациентов, агрессивная терапия заболевания которых весьма проблематична.
Хлорамбуцил
В качестве монотерапии первой линии наиболее часто применяется хлорбутин. Он назначается продолжительно или прерывисто. Цель терапии – паллиативная, поэтому критерии оценки эффективности отсутствуют. Часто назначается вместе с преднизолоном при прерывистой терапии. Выбор такого режима был основан на данных небольших исследований, но значительные клинические работы не установили какой-либо разницы относительно общей выживаемости. Более того, применение преднизолона повышало вероятность развития инфекционных осложнений. Более высокие дозы хлорбутина

(15 мг/день) представлялись более эффективными при одновременном возрастании токсичности. Высокие дозы хлорбутина обеспечивали лучший ответ и выживаемость, чем модифицированная схема СНОР ²⁵.

Комбинированная терапия

Комбинированная терапия основана на применении алкилирующих агентов (циклофосфан) и антрациклинов, и активно изучается в качестве начальной терапии. Эти комбинированные программы, СНОР, САР и СОР, были внедрены в связи с их активностью относительно зрелоклеточных лимфом. Несколько исследований было посвящено изучению преимущества этих схем перед монотерапией хлорбутином ± преднизолон. В результате полихимиотерапии приводила к лучшим ответам при неизменной общей выживаемости ^26,.27. Мета-анализ результатов лечения 2022 больных в 10-и центрах показал идентичную 5-летнюю выживаемость 48% в обеих группах ¹.

Аналоги пурина
С тех пор как хлорбутин стал основой лечения больных ХЛЛ, терапия не претерпевала изменений в течение многих десятилетий. Открытие активности аналогов пурина (флударбин, 2-хлородеоксиаденозин, пентостатин) обеспечило большой прорыв и позволило значительно поднять уровень терапевтической цели от паллиативного до заметного повышения величины ответов (частичная ремиссия) и исходов. Наиболее эффективным и часто изучаемым из них является флударабин. Этот препарат чаще обеспечивает достижение полной ремиссии и более продолжительный период до прогрессирования, чем хлорбутин и САР ^{28, 29}. В этих исследованиях миелосупрессия и инфекции являлись наиболее распространенными осложнениями терапии. Все же ни одно из этих исследований не выявило преимущества в общей выживаемости, а заболевание в конечном итоге прогрессировало у всех больных. Тем не менее, заключение, сделанное на основе этих рандомизированных работ, заключалось в констатации факта преимущества флударабина в качестве монохимиотерапии перед другими агентами в таком же режиме, и в необходимости применения флударабина в составе комбинированной терапии.
Комбинированные режимы на основе флударабина
С целью уменьшения уровня рецидивов и повышения частоты полных ремиссий исследовались комбинации флударабина с другими агентами. Несомненно, флударабин показал синергичность с некоторыми другими цитостатиками in vitro, например, с циклофосфаном, цитарабином, цисплатиной, и митоксантроном ³⁰. Поэтому изучалась комбинация флударабина с циклофосфаном и, недавно, флударабина с циклофосфаном и митоксантроном. Эти режимы обеспечили высокий уровень частичных ремиссий в одном исследовании и более высокую частоту полных ремиссий при сравнении с флударабином только; также был отмечен более продолжительный период до прогрессирования ^{31, 32}. У небольшой части пациентов эти режимы привели к отсутствию минимальной остаточной опухоли и увеличению продолжительности ремиссии по сравнению с теми, у кого остаточная опухоль обнаруживалась с помощью цепной реакции полимеразы.
Моноклональные антитела
Значительные успехи в разработке моноклональных антител повысили целевую гибель опухолевых клеток при приемлемой токсичности. Лимфомы и лейкемии особенно подходят для моноклональной терапии, экспрессируя множество антигенов, отсутствующих на других клетках. По этой причине моноклональная терапия представляется перспективной альтернативой цитостатической терапии рефрактерных случаев. Два моноклональных антитела показали обнадеживающие результаты: ритуксимаб, химерическое CD20-антитело, и алемтузумаб, CD52-антитело.

Пилотное клиническое исследование ритуксимаба показало низкий уровень ответов у больных лимфоцитарной лимфомой, аналогом ХЛЛ ³⁴. Другие работы подтвердили малую эффективность обычных доз (375 мг/м² - 4 еженедельных введения) ³⁵. Целью алемтузумаба является CD52, антиген, присутствующий у более 95% лимфоцитов человека на различных этапах дифференцировки, и широко представленный на клетках ХЛЛ. В пилотном исследовании алемтузумаб оценен у рефрактерных к флударабину пациентов, показав 33% уровень ответов, прекрасно работая в крови и костном мозге ³⁶. При применении алемтузумаба в качестве терапии первой линии уровень ответов сопоставим с таковым при использовании флударабина ³⁷. Реактивация цитомегаловируса (ЦМВ) была описана в большинстве документированных серий, поэтому определение ДНК ЦМВ в крови с помощью PCR стало рутинной. Превентивное назначение ганцикловира обычно успешно ³⁸.

Комбинация химиотерапии и иммунотерапии
Исследования in vitro показали сенсибилизирование ритуксимабом клеточных линий к цитотоксичности множества агентов, включая циклофосфан и флударабин ³⁹. Флударабин дизрегулирует CD55 и CD59, которые считаются комплиментарными белками защиты ⁴⁰. На основе этих наблюдений были проведены исследования комбинации ритуксимаба и флударабина. Группа CALGB сравнила одновременное применение этих агентов с их последовательным назначением (флударабин + ритуксимаб) ⁴¹. Более высокий уровень ответов отмечен в ветви одновременной комбинации.

В MD Аnderson Cancer Center были объединены флударабин, циклофосфан, и ритуксимаб.

Уровень ответов у 204 не леченных ранее пациентов составил 95% при 69% полных ⁴². Уровень и продолжительность полных ответов значительно превосходили таковые при комбинации флударабина и циклофосфана. Далее, около половины больных были

PCR-негативны на IgVH. Интригующим является изучение долговременных результатов терапии. Относительно комбинации флударабина и алемтузумаба имеются лишь данные по небольшим сериям больных с рецидивировавшим или рефрактерным ХЛЛ, свидетельствующие о высоком уровне ответов ^{43, 44}. Другой подход к комбинированию алемтузумаба с цитостатиками основан на концепции эффективности алемтузумаба в ликвидации минимальной остаточной опухоли у пациентов, у которых достигнут максимальный эффект с помощью флударабина. Предварительное исследование 9 пациентов дало обнадеживающие результаты, поскольку у всех, кроме одного, достигнута полная ремиссия, в 33% PCR-негативная на IgVH ⁴⁵. Эти результаты недавно подтверждены большими сериями ⁴⁶. Тем не менее, неясным остается, дает ли это преимущество в общей выживаемости. Другими требующими решения вопросами остаются применение алемтузумаба в качестве терапии первой линии, комбинированной терапии (одновременной и последовательной), поддерживающей терапии.

Трансплантация
Достижение статуса минимальной остаточной опухоли как результата лечения флударабином и комбинаций с его участием является основой для исследования дальнейшей консолидирующей терапии. Аутотрансплантация у больных ХЛЛ значительно возросла в объеме в последнее время. Тем не менее, флударабин, особенно в комбинации с другими агентами, значительно затрудняет забор стволовых клеток. С практической точки зрения необходим минимум трехмесячный перерыв между последним введением флударабина и забором стволовых клеток. В исследованиях проведения высокодозовой терапии и пересадки аутологичных стволовых клеток показан низкий уровень трансплант-зависимой смертности с одной стороны, и отсутствие плато кривой безрецидивной выживаемости – с другой ^47-50. Большой проблемой является заражение трансплантата лейкемическими клетками. Очевидно, что результат трансплантации тесно связан со статусом заболевания до трансплантации. Трансплантации, проведенные у больных с полной ремиссией, дают лучший результат, чем у больных с не полной ремиссией ^{47, 48,50}. Стойкость определяемой PCR минимальной остаточной опухоли, или трансформация ее негативного статуса в позитивный в периоде наблюдения практически означает рецидив ⁵¹. Несмотря на высокий уровень рецидивов, у некоторых больных улучшается выживаемость. В недавних исследованиях, изучавших влияние аутологичной трансплантации стволовых клеток у больных с отсутствием мутации IgVH, показано, что этот фактор остается индикатором плохого прогноза даже после трансплантации ⁵². Как бы то ни было, эффективность трансплантации все же превышает таковую от применения традиционных методов терапии ^{52, 23}.

Относительно излечивающего потенциала трансплантации, в проспективном пилотном исследовании MRC не леченных ранее больных ХЛЛ, применение флударабина с последующей трансплантацией обеспечило достижение молекулярной ремиссии у 70% из них ⁵⁰. К сожалению, эти молекулярные ремиссии были непродолжительными, а их потеря означала рецидив заболевания.

Несколько вопросов относительно трансплантации остаются открытыми: наилучший кондиционный режим, эффективность in vivo и in vitro очищения, оптимальность периода трансплантации. Необходимая соответствующая оценка влияния трансплантации на прогноз требует проспективных рандомизированных исследований, как, например, начато EBMT. Пересадка аллогенных стволовых клеток является подходом, принципиально отличающимся от аутологичной трансплантации в контексте индолентных заболеваний, к которым принадлежит ХЛЛ. В то время как токсичность и эффективность аутологичной трансплантации базируется исключительно на терапии цитостатиками, аллотрансплантация обеспечивает антилейкемический эффект за счет феномена «трансплантат-против-лейкемии». Этот эффект, как и его высокая токсичность, четко показаны во многих исследованиях. В общем, аллогенная трансплантация характеризуется как высокой, связанной с процедурой, смертностью, так и небольшой частотой рецидивов ^{51, 55, 56}. Тем не менее, молодые пациенты с рефрактерным заболеванием, выбор терапии которых достаточно мал, а толерантность к трансплантации высока, могут рассматриваться в качестве кандидатов на трансплантацию. Так как эффект «трансплантат-против-лейкемии», похоже, достаточен для эрадикации лейкемии, интенсивность кондиционирующих режимов может быть не так важна, как при других заболеваниях, особенно у пациентов с химиочувствительной опухолью. В настоящее время исследуется аллогенная трансплантация пониженной интенсивности (не миелоаблативная). При таком подходе от подготовительного режима ожидается не эрадикация заболевания, а обеспечение миелосупрессии в степени, достаточной для развития эффекта «трансплантат-против-лейкемии» ⁵⁷.
Заключение
В результате всех нововведений медиана выживаемости пациентов с ХЛЛ возросла

с 5-6 лет в опубликованных два десятилетия назад сериях до 10 лет в настоящее время. Все же, установление диагноза «ХЛЛ» оказывает значительное влияние на продолжительность жизни, особенно не пожилых пациентов ⁵⁹. Внедрение новых более точных прогностических факторов может способствовать проведению рандомизированных клинических исследований влияния раннего интенсивного лечения пациентов с небольшой опухолевой массой и плохими прогностическими признаками на увеличение сроков выживаемости. Более того, они могут влиять на выбор первичной и последующей терапии пациентов с генерализованным или рецидивирующим процессом.

Таким образом, следующие рекомендации основанной на рисках терапии обоснованы научными исследованиями:

1) оценка прогноза пациентов не ограничена более только определением стадий Binet или Rai, включая в себя определение биологических и генетических маркеров для повышения точности прогнозирования;
2) при выборе терапии следует принимать во внимание общее состояние пациента;
3) выбор терапии должен учитывать и возраст больных при тенденции к его снижению и повышению доли индолентных форм заболевания;
4) концепция отказа от терапии пациентов с начальными стадиями должна быть переоценена и исследована в связи с появлением новых терапевтических агентов.

References 1. CLL Trialist' Collaborative Group. Chemotherapeutic options in chronic lymphocytic leukemia: a meta-analysis of the randomised trials. J Natl Cancer Inst 1999;91:861-8. 2. Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975;46:219-34. 3. Binet JL, Auquier A, Dighiero G, Chastang C, Piguet H, Goasguen J, et al. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer 1981;48:198-206. 4. Döhner H, Stilgenbauer S, Benner A, Leupolt E, Krober A, Bullinger L, et al. Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukaemia. N Engl J Med 2000;343:1910-6. 5. Keating MJ, Lerner S, Kantarjian H, Freireich EJ, O'Brien S. The serum b2 microglobulin (b2M) level is more powerful than stage in predicting response and survival in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Blood 1998;86: 606a[Abstract 2412]. 6. Hallek L, Langenmayer I, Nerl C, Knauf W, Dietzfelbinger Hm, Adorf D, et al. Elevated serum thymidine kinase levels identify a subgroup at high risk of disease progression in early non-smoldering chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999;93:1732-7. 7. Sarfati M, Chevret S, Chastang C, Biron G, Stryckmans P, Delespesse G, et al.Prognostic importance of serum soluble CD23 level in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1996;88:4259-64. 8. Hallek M, Wanders L, Ostwald M, Busch R, Senekowittsch R, Stern S, et al. serum b2 microglobulin and serum thymidine kinase are independent predictors of progression-free survival in chronic lymphocytic leukemia and immunocytoma. Leuk Lymphoma 1996;22:439-47. 9. Leotard S, Chastang C, Travade P, Jaudon MC, Tournilhac O, Baudet S, Merle-Beral H. Prognostic relevance of a scoring system based on clinical and biological parameters in early chronic lymphocytic leukemia Hematology J 2000; 1:301-6. 10. Rambotti P, Davis S. Lactate dehydrogenase in normal and leukemic lymphocyte subpopulations: evidence for the presence of abnormal T cells and B cells in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1981;57:324-7. 11. Desablens B, Garidi R, Lamour C. Prognostic value of LDH and b2 microglobulin in B-CLL. Analysis of 275 patients. VII International Workshop on CLL1997;81a[Abstract]. 12. Damle RN, Wasil T, Fais F, Ghiotto F, Valetto A, Allen SL, et al. IgV gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94:1840-7. 13. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK. Unmutated Ig V(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999;94:1848-54. 14. Oscier DG, Gardiner AC, Mould SJ, Glide S, Davis ZA, Ibbotson RE, et al. Multivariate analysis of prognostic factors in CLL: Clinical stage, IGVH gene mutational status, and loss or mutation of the p53 gene are independent prognostic factors Blood 2002;100:1177-84. 15. Krober A, Seller T, Benner A, Bullinger L, Bruckle E, Lichter P, et al. VH mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002; 100:1410-6. 16. Ibrahim S, Keating M, Do KA, O’Brien S, Huh YO, Jilani I, et al. CD38 expression as an important prognostic factor in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood 2001;98:181-6. 17. Hamblin TJ, Orchard JA, Ibbotson RE, Davis Z, Thomas PW, Stevenson FK, Oscier DG. CD38 expression and immunoglobulin variable region mutations are independent prognostic variables in chronic lymphocytic leukemia, but CD38 expression may vary during the course of the disease. Blood 2002;99:1023-9. 18. Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, Simon R, Davis RE, Yu X, et al. Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med 2001;194:1625-38. 19. Crespo M, Bosch F, Villamor N, Belosillo B, Colomer D, Rozman M, et al. ZAP-70 expression as a surrogate for immunoglobulin-variable region mutations in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2003;348:1764-75. 20. Orchard JA, Ibbotson RE, Davis Z, Wiestner A, Rosenwald A, Thomas W, et al. ZAP-70 expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Lancet 2004;363:105-11. 21. Rassenti LZ, Huynh L, Toy TL, Chen L, Keating MJ, Gribben JG, et al. ZAP-70 compared with immunoglobulin heavy-chain gene mutation status as a predictor of disease progression in chronic lymphocytic leukemia. N Eng J Med 2004; 351:893-901. 22. Diehl LF, Karnell LH, Menck HR. The National Cancer data base report on age, gender, treatment, and outcomes of patients with chronic lymphocytic leukemia. Cancer 1999;86:2684-92. 23. Vasconcelos Y, Davi F, Levy V, Oppezzo P, Magnac C, Michel A, et al. Binet’s Staging System and VH genes are independent but complementary prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol 2003;21:3928-32. 24. Hallek M. Risk adapted management of chronic lymphocytic leukemia: update on the cooperative trials of the German Chronic Lymphocytic Leukemia Study Group. Haematologica 2003;88 Suppl 17:26-30. 25. Jaksic B, Brugiatelli M, Krc I, Losonczi H, Planinc-Peraica A, Kusec R, et al. High dose chlorambucil versus Binet's modified cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisone regimen in the treatment of patients with advanced B-cell chronic lymphocytic leukemia: results of an international multicenter randomized trial. International Society for Chemo-Immunotherapy, Vienna. Cancer 1997; 79:2107-14. 26. French Cooperative Group on Chronic Lymphocytic Leukemia. A randomized clinical trial of chlorambucil versus COP in stage B chronic lymphocytic leukemia. Blood 1990;75:1422-5. 27. Raphael B, Andersen JW, Silber R, Oken M, Moore D, Bennet J et al. Comparison of chlorambucil and prednisone versus cyclophosphamide, vincristine and prednisone as initial treatment for chronic lymphocytic leukemia: long-term follow-up of an Eastern Cooperative Oncology Group randomized clinical trial: J Clin Oncol 1991;9:770-6. 28. French Cooperative Group on CLL. Multicentre prospective randomised trial of fludarabine versus cyclophosphamide, doxorubicin, and prednisone (CAP) for treatment of advanced-stage chronic lymphocytic leukaemia. Lancet 1996;347:1432-8. 29. Rai KR, Peterson BL, Appelbaum FR, Kolitz J, Elias L, Shepherd L, et al. Fludarabine compared with chlorambucil as primary therapy for chronic lymphocytic leukaemia. N Engl J Med 2000;343:1750-7. 30. Plunkett W, Gandhi V. Nucleoside analogs: cellular pharmacology, mechanism of action and strategies for combination therapy; in: Nucleoside analogs in cancer therapy. by B Cheson, MJ Keating, W Plunkett, Editors. Marcel Dekker, Inc: New York. 1997. 31. O'Brien SM, Kantarjian HM, Cortes J, Beran M, Koller CA, Jiles FJ, et al. Results of the fludarabine and cyclophosphamide combination regimen in chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol 2001;19:1414-20. 32. Bosch F, Ferrer A, Lopez-Guillermo A, Gine E, Bellosillo B, Villamor N, et al. Fludarabine, cyclophosphamide and mitoxantrone in the treatment of resistant and relapsed chronic lymphocytic leukemia. Br J Haematol 2002;119:976-84. 33. Provan D, Bartlett-Pandite L, Zwicky C, Neuberg D, Maddocks A, Corradini P, et al. Eradication of polymerase chain reaction-detectable chronic lymphocytic leukemia cells is associated with improved outcome after bone marrow transplantation. Blood 1996;88:2228-35. 34. Mc Laughlin P, Grillo-Lopez AJ, Link BK, Levy R, Czuczman MS, Williams ME, et al. Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody therapy for relapsed indolent lymphoma: half of patients respond to a four-dose treatment program. J Clin Oncol 1998; 16:2825-33. 35. Huhn D, Von Schilling C, Wilhelm M, Ho AD, HalleK M, Kuse R, et al. Rituximab therapy of patients b-cell chronic lymphocytic leukemia.Blood 2001;98:1326-31. 36. Keating MJ, Flinn I, Jain V, Binet JL, Hilmen P, Byrd J, et al. Therapeutic role of alemtuzumab (Campath-1H) in patients who have failed fludarabine: results of a large international study. Blood 2002;99:3554-61. 37. Lundin J, Kimby E, Björkolm M, Broliden PA, Celsing F, Hjalmar V, et al. Phase II trial of subcutaneous anti-CD52 monoclonal antibody alemtuzumab (Campath-1H) as first-line treatment for patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL). Blood 2002; 100:768-73. 38. Moreton P, Hillmen P. Alemtuzumab in B-cell lymphoproliferative disorders. Semin Oncol 2003;30:493-501. 39. Demidem A, Lam T, Alas S, Hariharan K, Hanna N, Bonavida B. Chimeric anti-CD20 (IDEC-CDB8) monoclonal antibody sensitizes a B-cell lymphoma cell line to cell killing by cytotoxic drugs. Cancer Biother Radiopharm 1997; 12:177-86. 40. Golay J, Lazzari M, Facchinetti V, Bernasconi S, Borleri G, Barbui T, et al. CD20 levels determine the in vitro susceptibility to rituximab and complement of B-cell chronic lymphocytic leukemia: further regulation by CD55 and CD59. Blood 2001;98:3383-9. 41. Byrd JC, Peterson BL, Morrison VL, Park K, Jacobson R, Hoke E, et al. Randomized phase 2 study of fludarabine with concurrent versus sequential treatment with rituximab in symptomatic, untreated patients with chronic lymphocytic leukemia: results from Cancer and Leukemia Group B 9712 (CALGB 9712). Blood 2003;119:976-84. 42. Keating MJ, Manshouri T, O'Brien S, Wierda W, Kantajian H, Lerner S, et al. A high proportion of true complete remission can be obtained with a fludarabine, cyclophosphamide, rituximab combination (FCR) in chronic lymphocytic leukemia (CLL). J Clin Oncol 2003; 22:580[abstract 2289]. 43. Elter T, Borchmann P, Reiser M, Schulz H, Staib P, Schinkoethe A, et al. Development of a new, four weekly schedule (FluCam) with concomitant application of Campath-1H and fludarabine in patients with relapsed/refractory CLL. J Clin Oncol 2003;22:580[abstract 2331]. 44. Kennedy B, Rawstron A, Carter C, Ryan M, Speed K, Lucas G, Hillmen P, et al. Campath-1H and fludarabine in combination are highly active in refractory chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002;99:2245-7 45. Montillo M, Cafro AM, Tedeschi A, Brando B, Oreste P, Veronese S, et al. Safety and efficacy of subcutaneous campath-1H for treating residual disease in patients with chronic lymphocytic leukemia responding to fludarabine. Haematologica 2002;87:695-700. 46. Montillo M,Tedeschi A, Rossi V, Cafro AM, Cairoli R, Veronese S, et al. Alemtuzumab as consolidation after a response to fludarabine is effective to purge residual disease in patients with chronic lymphocytic leukemia. Blood 2004;104:140a[abstract 479]. 47. Dreger P, van Biezen A, Brand R, Esteve J, Gratwohl A, Kimby E, et al. Prognostic factors for survival after autologous stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukemia (CLL): the EBMT experience. Blood 2000; 96:482a[abstract 2071]. 48. Esteve J, Montserrat E, Dreger P, Meloni G, Pavletic S, Catovsky D, et al. Stem cell transplantation (SCT) for chronic lymphocytic leukemia (CLL): Blood 2001;98:482a[abstract 2013]. 49. Dreger P, von Neuhoff N, Sonnen R, Kuse R, Seyfarth B, Lorens G, et al. Efficacy and prognostic implications of early autologous stem cell transplantation for poor risk CLL. Blood 2000; 96:483a[abstract 2076]. 50. Milligan DW, Fernandes S, Dasgupta R, Davies FE, Matutes E, Fegan CD, et al. Autografting for younger patients with chronic lymphocytic leukemia is safe and achieves a high percentage of molecular responses.Results of the MRC Pilot Study. Blood 2005;105:397-404. 51. Esteve J, Villamor N, Colomer D, Montserrat E. Different clinical value of minimal residual disease after autologous and allogeneic stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukemia. Blood 2002;99:1873-4. 52. Ritgen M, Lange A, Stilgenbauer S, Dohner H, Bretscher C, Bosse H, et al. Unmutated immunoglobulin variable heavy-chain gene status remains an adverse prognostic factor after autologous stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukemia. Blood 2003; 101:2049-53. 53. Dreger P, Stilgenbauer S, Benner A, Ritgen M, Krober A, Kneba M, et al. The prognostic impact of autologous stem cell transplantation in patients with chronic lymphocytic leukemia: a risk-matched analysis based on the VH gene mutational status Blood 2004;103:2850-8. 54. Rondon G, Giralt S, Huh Y, Khouri I, Anderson B, Andreef M, Champlin R. Graft versus leukemia effect after allogeneic bone marrow transplantation for chronic lymphocytic leukemia. Bone Marrow Transplant 1996;18:669-72. 55. Michallet M, van Biezen G, Bandini E, Carreras JJ, Cornelissen P, Dreger H, et al. Allotransplants and autotransplants in chronic lymphocytic leukemia. Bone Marrow Transplant 1999;23 Supp1:S53[Abstract 170]. 56. Pavletic ZS, Arrowsmith ER, Bierman PJ, Goodman SA, Vose JM, Tarantolo SR, et al. Outcome of allogeneic stem cell transplantation for B cell chronic lymphocytic leukemia. Bone Marrow Transplant 2000;25:717-22. 57. Schetelig J, Thiede C, Bornhauser M, Schwerdfeger R, Kiehl M, Beyer J, et al. Evidence of graft-versus-leukemia effect in chronic lymphocytic leukemia after reduced–intensity conditioning and allogeneic stem-cell transplantation: the Cooperative German Transplant Study Group. J Clin Oncol 2003; 21:2747-53. 58. Dreger P, Brand R, Hansz J, Miligan D, Corradini P, Finke J, et al. Treatment-related mortality and graft-versus-leukemia activity after allogeneic stem cell transplantation for chronic lymphocytic leukemia using intensity-reduced conditioning. Leukemia 2003;17:841-8. 59. Gu Y, Strom SS, Lerner S, Keating MJ. The survival of CLL is improving: better treatment or referral bias? MD Anderson experience over two decades. Leuk Lymhoma 2003;44 Suppl 2:S41[abstract 70].