Перейти на главную страницу
Лукманова
Гульнур Ишмурзовна
идентификация штамма Echinococcus granulosus И Генетические факторы риска гидатидозного эхинококкоза на Южном Урале
03.00.19 – паразитология
автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Викторова Татьяна Викторовна
Чебышев Николай Васильевич
доктор медицинских наук, профессор
Токмалаев Анатолий Карпович
доктор медицинских наук, профессор
Довгалев Анатолий Семенович
институт микробиологии и паразитологии
Роспотребнадзора (г. Ростов-на-Дону)
Защита состоится « 23 » октября 2008 г. в «1400» часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.12 при ГОУ ВПО «Московская медицинская академия имени И. М. Сеченова Росздрава». Адрес: 119992, Москва, ул. М. Трубецкая, д. 8, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский просп., д. 49).
Автореферат разослан «____» сентября 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат медицинских наук Фролова Александра Александровна
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Высокий уровень заболеваемости эхинококкозом является серьезной экологической и медико-социальной проблемой для многих стран с разными природно-климатическими и социально экономическими условиями [Daneshbod Y., 2004; Oudni M. et al., 2004; Hashemitabar G.R. et al., 2005; Sapkas G.S. et al., 2006; Varcasia A. et al., 2007], в том числе и для ряда регионов Российской Федерации, к которым относится и Южный Урал [Бессонов А.С., 2001]. За последние пять лет показатель заболеваемости эхинококкозом в России увеличился в 3 раза, при этом в структуре заболевших 14,4% составляли дети, что свидетельствует об интенсивности передачи инвазии и неэффективности проводимых мероприятий [Онищенко Г.Г., 2006]. В Республике Башкортостан за последние десять лет количество детей и подростков, больных эхинококкозом, возросло в 5 раз [Гумеров А.А. и др., 2006; Шангареева Р.Х. и др., 2006]. Эти факты диктуют необходимость разработки новых подходов в профилактике эхинококкозов.
Важнейшим звеном в решении проблемы является типирование таксономической принадлежности возбудителя заболевания. Немаловажное значение в эпидемиологии и эпизоотологии эхинококкозов имеют биологические отличия изолятов Echinococcus из разных паразитарных систем [Коваленко Ф.П., 1998; Thompson R.C., McManus D.P., 2002]. Использование методов молекулярной биологии позволило дифференцировать десять внутривидовых вариантов (штаммов, генотипов, биоваров) E. granulosus: G1 – «общий, домашних овец»; G2 – «тасманийских овец»; G3 – «буйволов»; G4 – «лошадей»; G5 – «крупного рогатого скота»; G6 – «верблюдов»; G7 – «свиней»; G8 – «северных оленей»; G9 – «человека»; G10 – «Fennoscandian cervid» [Bowles J. et al., 1992; 1995; Bowles J., McManus D.P. 1993; Scott J.C. et al. 1997; McManus D.P., 2002; Kamenetzky L. et al., 2002; Lavikainen A. et al. 2003]. Важная биолого-эпидемиологическая особенность штаммов E. granulosus – их неодинаковая инвазивность для человека [Ястреб В.Б., Скворцова Ф.К., 1990; McManus D.P. et al., 1994; Bart J. et al., 2006]. Большинство исследователей считают человека наиболее восприимчивым к овечьему штамму с генотипом G1 [McManus D.P. et al., 1994; Thompson R.C., McManus D.P., 2002; Dinkel A. et al., 2004; Bart J. et al., 2006]. Хотя описаны случаи инвазии и другими штаммами, например, в Аргентине у 42% больных гидатидозным эхинококкозом людей были идентифицированы штаммы G2, G5 и G6 [Naidich A. et al., 2006]. В литературе не описано ни одного случая инвазии человека E. equinus (штамм G4). Биологическая сущность этих явлений пока только начинает изучаться.
Определение у E. granulosus внутривидового полиморфизма имеет огромное практическое значение для совершенствования мероприятий по снижению уровня заболеваемости эхинококкозом [McManus D.P., Thompson R.C., 2003]. В настоящее время во многих странах ученые ведут поиск эффективных диагностических тестов и профилактических вакцин против ларвальных цестодозов, в том числе эхинококковых гидатидозов, для разработки которых необходимо типирование штаммовой принадлежности и определение популяционной индивидуальности возбудителя [Озерецковская Н.Н., 2001; Одоевская И.М., 2007; Arend A.C. et al., 2004; Carmena D. et al., 2006; Muzulin P.M. et al., 2007]. В Республике Башкортостан подобные исследования ранее не проводились. Очевидно, что для характеристики эпидемиологической ситуации в Южно-Уральском регионе необходимо располагать данными о структуре популяций E. granulosus.
Определенные трудности в профилактике гидатидозного эхинококкоза создает недостаточность сведений об индивидуальной восприимчивости человека к штаммам E. granulosus. Считается, что клиническая реализация эхинококковой инвазии происходит менее чем у 1% людей [Тумольская Н.И., 1992]. Известны случаи бессимптомного течения эхинококковой болезни или со слабо выраженными симптомами, которые заканчивались полным выздоровлением [Журавец А.К., 2004].
К числу наиболее актуальных аспектов проблемы эхинококкозов относятся вопросы выявления факторов, влияющих на развитие заболевания, причин возникновения осложнений и рецидивов [Тумольская Н.И., 1992]. Мало изучены механизмы, обусловливающие локализацию эхинококковой кисты в организме человека [Zahawi H.M. et al., 1999].
В последнее время сформулирована концепция, согласно которой характер течения и исход паразитарных заболеваний зависит от предрасполагающих факторов, многие из которых генетически детерминированы [Cooper P.J. et al., 2003; Quinnell R.J., 2003]. В некоторых случаях описывают врожденную, генетически обусловленную, резистентность человека к инвазии гельминтами [Антонов М.М. и др., 2004]. Одним из методов анализа роли генетических факторов в возникновении и развитии заболеваний является исследование ассоциаций с генетическими маркерами, что позволяет определять группы риска, обосновывать индивидуальную профилактику и превентивную терапию [Баранов В.С. и др., 2000]. В этой связи поиск генов-кандидатов индивидуальной восприимчивости человека к эхинококкозу представляется актуальной задачей, которая позволит глубже проникнуть в фундаментальные механизмы патогенеза этой болезни, и будет способствовать совершенствованию профилактических мероприятий.
Идентифицировать таксономическую принадлежность возбудителя эхинококкоза и разработать алгоритм прогнозирования повышенного риска заболевания у детского населения Республики Башкортостан на основании выявления молекулярно-генетических маркеров индивидуальной предрасположенности.
Впервые проведен комплексный анализ таксономической принадлежности возбудителя и восприимчивости к заболеванию населения в очаге гидатидозного эхинококкоза на Южном Урале.
Проведены исследования генотипа и проанализирован нуклеотидный полиморфизм таксономически значимого маркерного фрагмента митохондриального гена CO1 у изолятов E. granulosus. На основании полученных результатов установлено, что на территории Южного Урала возбудитель гидатидозного эхинококкоза у населения принадлежит штамму G1 «общий, домашних овец».
Определены условия для амплификации и последующего рестрикционного анализа маркерных фрагментов ДНК гена CO1 для идентификации генотипа G1 у изолятов E. granulosus.
Изучен полиморфизм генов комплекса гистосовместимости (HLA DRB1*, DQB1*) у больных эхинококкозом детей в Башкортостане. Установлена ассоциация специфичностей *03 гена DRB1 и *02 гена DQB1 с высокой степенью риска развития осложнений.
Выявлены маркеры повышенного риска эхинококкоза у детского населения Республики Башкортостан среди полиморфных вариантов генов ферментов детоксикации ксенобиотиков и антиоксидантной защиты. Установлена ассоциация полиморфной аллели G и генотипа *AG гена CYP1А1 с предрасположенностью к заболеванию. Определена ассоциация делеции гена GSTM1 с развитием сочетанного эхинококкоза.
Впервые показано, что генетическое тестирование лиц из эндемичных очагов эхинококкоза позволит выделять группы риска, прогнозировать течение заболевания.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Научно обоснован и предложен комплексный подход к характеристике синантропного очага эхинококкоза, основанный на определении генетической структуры популяции E. granulosus и скрининге полиморфизма генов-кандидатов восприимчивости к заболеванию у человека.
Разработаны и предложены методические основы оценки индивидуальной предрасположенности к гидатидозному эхинококкозу, которые базируются на результатах молекулярно-генетического тестирования маркеров риска.
Предложен и апробирован способ получения маркерных фрагментов ДНК митохондриального гена CO1 и модифицирован метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для идентификации генотипа G1 E. granulosus.
Материалы диссертации использованы при подготовке:
2.2. Способ прогнозирования рецидивов эхинококкоза / Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Лукманова Л.И., Мурзабаев Х.Х., Викторова Т.В. (Патент РФ №2313275);
2.3. Способ прогнозирования развития клинической формы цистного эхинококкоза у детей / Лукманова Г.И., Гумеров А.А., Викторова Т.В., Нартайлаков М.А., Комиссарова М.А., Лукманова Л.И. (Патент РФ №2324940);
2.4. Способ идентификации возбудителя цистного эхинококкоза в биологическом образце (Положительное решение о выдаче патента на изобретение №2006144980).
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Национальном конгрессе «Болезни органов дыхания» (С.-Петербург, 2003); IV Международной конференции «Современные проблемы общей, медицинской и ветеринарной паразитологии» (Витебск, 2004); VII Международной конференции «Циклы» (Ставрополь, 2005); IV Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Интеграция России в Евросоюз» (Уфа, 2005); конференции ВИГИС «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 2005); Республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины и здравоохранения» (Уфа, 2006); II региональной научно-практической конференции Приволжского Федерального округа «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском Федеральном округе» (Казань, 2006); Всероссийской научной конференции «Теоретические и практические вопросы паразитологии» (Кемерово, 2006); Республиканской научно-практической юбилейной конференции (Уфа, 2006); V Республиканской научно-практической конференции «Достижения и перспективы развития современной паразитологии» (Витебск, 2006); Х Международной научной конференции «Здоровье семьи ХХ1 век» (Бангкок, 2006); конференции ВИГИС «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 2007); на заседаниях кафедры биологии БГМУ, 2002- 2008.
Результаты диссертационной работы опубликованы в 27 научных изданиях, в том числе 2 монографии и 10 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских диссертаций. Получено 3 патента РФ на изобретение.
Диссертация изложена на 230 страницах машинописного текста, иллюстрирована 48 рисунками и 20 таблицами. Состоит из введения, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы (176 отечественных и 173 зарубежных публикаций) и приложения.
Автор выражает глубокую благодарность заслуженному деятелю науки РФ, д.м.н., профессору А.А. Гумерову, сотрудникам клиники кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии БГМУ за помощь в сборе материала. Автор выражает глубокую признательность заместителю директора по науке, д.м.н., профессору М.М. Туйгунову, сотрудникам лаборатории ФГУП НПО «Микроген» филиал «Иммунопрепарат» МЗ СР РФ, за помощь оказанную при постановке молекулярно-генетических методов. Автор выражает благодарность заведующей лаборатории молекулярной генетики человека Института биохимии и генетики УНЦ РАН д.б.н., профессору Э.К. Хуснутдиновой, в.н.с. И.М. Хидиятовой за помощь в работе.
Материал для морфологических и молекулярно-генетических исследований изолятов Echinococcus получали от материнских эхинококковых пузырей (ларвоцист), выделенных во время оперативного вмешательства у пациентов, поступавших в клинику кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава» на базе детской республиканской клинической больницы в 2000-2006 гг., и один экземпляр был получен из Абзелиловского района (Зауралье) от естественно инвазированного убойного крупного рогатого скота (трехгодовалой коровы). Для проведения работы была собрана коллекция из 65 ларвоцист эхинококка. Среди них: 37 – полученные от пациентов, оперированных по поводу эхинококкоза печени и один образец - из печени коровы; 25 – полученные от пациентов с эхинококкозом легких; по одному образцу получено от детей с эхинококкозом селезенки, головного мозга, щитовидной железы. Морфология ларвоцист была изучена согласно рекомендациям В.Б. Ястреб (1986), В.Б. Ястреб, Ф.К. Скворцовой (1990); Н.И. Перчун (2002).
Материалом для молекулярно-генетических исследований служили образцы ДНК, выделенные из клеток герминативной оболочки и протосколексов. Депротеинизацию и осаждение ДНК осуществляли стандартным фенол-хлороформным методом [Sambrook J. et al., 1987]. В качестве маркерного гена для идентификации биоваров эхинококка использовали митохондриальный ген CO1, кодирующий субъединицу 1 цитохром-с-оксидазы (CO1). Для получения таксономически значимых фрагментов гена CO1 E. granulosus применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК по J. Bowles et al., 1992. ПЦР проводили на четырехканальном термоциклере «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология», Россия). Присутствие продуктов амплификации анализировали электрофоретическим разделением смеси в 10% ПААГ, после окрашивания гелей бромистым этидием, с последующей визуализацией в УФ-свете на трансиллюминаторе (“Vilber Lourmat” TCP-20M). В качестве маркера молекулярных масс использовали фрагменты ДНК плазмиды pUC 19/MSpI («СибЭнзим», Россия). Секвенирование ДНК ферментативным дидезокси-методом Сэнгера [Senger F. et al., 1977] проведили на автоматическом секвенаторе ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer, Applied Biosystems (USA) согласно условий рекомендованных производителем.
Анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR, Inc. (США). Нуклеотидные последовательности для сравнительного анализа были взяты из опубликованных статей, получены из банка нуклеотидных последовательностей NCBI, посредством Интернета в обновляемых версиях GenBank. Для сравнительного анализа полиморфизма гена CO1 E. granulosus использовали известные последовательности нуклеотидов: G1 - Acc. No U50464; G1A – AF458871, G1B – AF458872, G1C – AF458873, G1D – AF458874, G1E – AF458875, G2 - M84662; G3 - M84663; G4 - M84664; G5 - М84665; G6 - М84666; G7 - М84667, G8 – М84668, G9 М84669, G10 – AF525457. Консенсусная последовательность была построена с помощью программы SeqMan «DNASTAR» (США). Выравнивание сиквенсов проводили методом ClustalW (Slow/Accurate, IUB) с помощью программы MegAlign «DNASTAR» (США). Для сравнительного анализа полученных при секвенировании нуклеотидных последовательностей с последовательностями, зарегистрированными в GenBank, использовали поисковую систему ´Basic Local Alignment Search Tool´ (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
ПЦР-ПДРФ анализ (Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) проводили с учетом рекомендаций описанных в лабораторном регламенте «Способ выявления внутривидового ДНК-полиморфизма E. granulosus с помощью рестрикционного анализа продуктов ПЦР» [Никулина Н.А., и соавт., 2003].
Материал для молекулярно-генетического исследования полиморфизма генов больных гидатидозным эхинококкозом собран в 2000-2007 годах от детей, поступивших на оперативное лечение по поводу эхинококкоза в клинику кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии ГОУ ВПО «БГМУ Росздрава». В качестве контроля аналогичные исследования проведены в группе здоровых и серонегативных в отношении эхинококкоза лиц. Группы обследованных пациентов и контроля были сопоставимы по возрасту, полу, этнической принадлежности и месту жительства.
Объектом молекулярно-генетических исследований служили образцы ДНК, полученные из периферической венозной крови. Опытная группа состояла из 112 пациентов. Среди них 102 (91,1%) ребенка проживают в сельской местности, 10 (8,9%) являются жителями городов Республики Башкортостан. Возраст пациентов варьировал от 3 до 16 лет. Мальчиков было 55 (49,1%), девочек - 57 (51,9%). Контрольная группа состояла из 108 детей в возрасте от 5 до 16 лет. Мальчиков было 51 (47,2%), девочек - 57 (52,8%).
Образцы ДНК получали с использованием набора PROTRANS (фирмы «PROTRANS», Германия), а также ДНК выделяли методом фенольно-хлороформной экстракции по C.C. Mathew, (1984). В дальнейшем полученную ДНК использовали в качестве матрицы полимеразной цепной реакции для амплификации нужного фрагмента.
Типирование специфичностей HLA локусов DRB1*, DQB1* осуществляли при помощи ПЦР-анализа, с применением стандартного набора реагентов HLA DRB1*, DQB1* и полного комплекта оборудования фирмы «PROTRANS» (Германия), а также набора реагентов ООО «Био-Рад лаборатория» (Россия). Идентифицированные специфичности HLA генов DRB1, DQB1 классифицировали согласно общепринятой в мире номенклатуре [Bodmer J.G. et al., 1995]. Антигены HLA- А и В, класса 1 определяли путем типирования в стандартном микролимфоцитотоксическом тесте с использованием гистотипирующей панели антисывороток HLA (ЗАО Межрегиональный центр «Гиссанс», Россия) методом Terasaki [Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б., 2000]. Групповую принадлежность крови систем AB0 Rh-фактор изучали, используя стандартные сыворотки («Гематолог», Россия) в простой реакции [Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б., 2000].
Полиморфизм Ile462Val (A2455G) 7 экзона гена CYP1A1 исследовался методом ПЦР-ПДРФ анализа [El-Zein R. et al., 1997]. Полиморфизм N/del гена GSTM1 был изучен методом ПЦР-анализа [Ivaschenko T.E. et al., 2002]. ПЦР проводили на четырехканальном термоциклере «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология», Россия). Присутствие продуктов амплификации и рестрикции анализировали электрофоретическим разделением смеси в 10% ПААГ, после окрашивания гелей бромистым этидием, с последующей визуализацией в УФ-свете на трансиллюминаторе (“Vilber Lourmat” TCP-20M).
Математическую обработку результатов исследования проводили на ПЭВМ IBM PENTIUM с использованием пакетов статистических программ: STATISTICA v. 6.0; “Rows and Collumns” (RxC – статистика) [Roff P., Bentzen P., 1989], Microsoft Excel v.2000.
Разницу в распределении частот генотипов и аллелей генов между группами рассчитывали с использованием критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.
Для количественной оценки относительного риска заболевания по конкретному аллелю или генотипу вычисляли показатель отношения шансов (odds ratio - OR). Для этого использовали формулу, предложенную Бландом [Bland J.M., Altman D.G., 2000]. OR>1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с аллелем или генотипом («фактор риска»), OR<1 - как отрицательную ассоциацию («фактор устойчивости»), OR=1 считали отсутствием ассоциации.
25 12 2014
3 стр.
Фгу федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии мзср РФ
12 10 2014
1 стр.
25 12 2014
3 стр.
Урале, впоследствии юриста. Ранние годы жизни провел в Оренбуржье, на Южном Урале, в Средней Азии. С 1931 жил в Москве. В годы Великой Отечественной войны был эвакуирован в Казахст
25 12 2014
1 стр.
Девясил высокий (Inula helenium L.) на Южном Урале: популяционная структура и вопросы охраны
02 09 2014
1 стр.
Тема: «Медицинская паразитология, ее значение в обеспечении здоровья населения. Предмет медицинская паразитология. Основные понятия, цели и задачи медицинской паразитологии на совр
24 09 2014
1 стр.
Способствовать формированию исторических понятий общего представления о религиозных верованиях народов Южного Урала X – XIII в в
16 12 2014
1 стр.
Общие сведения: название этого камня еще известно как "змеевик", которое дано по цвету, напоминающему цвет змеиной кожи. Месторождения серпентиновых пород обнаружены на Среднем и Ю
10 10 2014
1 стр.