Клинико-диагностическое значение показателей оксидативного стресса у больных генитальным эндометриозом 14. 01. 01 Акушерство и гинекология (мед науки)

На правах рукописи
ИОНОВА Русудан Магометовна
КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

ПОКАЗАТЕЛЕЙ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА
У БОЛЬНЫХ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ
14.01.01 – Акушерство и гинекология (мед.науки)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Гаспарян Сусанна Арташесовна,

кандидат биологических наук Бургова Евгения Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асият Зульчифовна

доктор медицинских наук Марченко Лариса Андреевна

Ведущая организация: ГУ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» МЗ Московской области
Защита состоится « ___ » _________ 2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.06 при ГОУ ВПО «МГМСУ» Минздравсоцразвития России по адресу: 127437, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20,стр.1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России по адресу: 127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а.

Автореферат разослан « ___ » ___________ 2011 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор М.М. Умаханова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема генитального эндометриоза (ГЭ) актуальна до настоящего времени в связи с высокой частотой его распространения, прогрессированием эндометриоидных гетеротопий за пределами полости матки, болевым синдромом, бесплодием и другими последствиями, отражающимися на качестве жизни больных при отсутствии патогенетических методов лечения (Манухин И.Б. и соавт., 2010; Berkes E. et al., 2010; Gupta S. et al., 2008; Gylfason J.T. et al., 2010; Fauconnier A., Chapron C., 2005; Hart R.J. et al., 2010; Kaatz J. et al., 2010; Koga K. et al., 2006; Shah D.K. et al., 2010).

Эндометриоз – мультифакторное заболевание, в развитии которого задействованы различные механизмы: генетические, иммунные, эндокринные, ангиогенные, ферментные, оксидативные и другие (Баранов В.С., 2004; Манухин И.Б. и соавт., 2010; Borghese B. et al., 2010; Laschke M.W. и Menger M.D., 2007; Lee B. et al., 2009; May K., Becker C.M., 2008; Osuga Y., 2008; Painter J.N. et al., 2011). Существуют различные трактовки патогенеза развития ГЭ. Основными гипотезами развития ГЭ являются: транспортировка тканей эндометрия путем ретроградного менструирования; трансформации мезотелия абдоминальной и тазовой брюшины (теория “целомической метаплазии”); проявления остатков эмбриональных тканей (эмбриологические клеточные гамартии), гипотезы вторичной системы Мюллерового протока (Адамян Л.В. и Кулаков В.И., 1998; Batt R.E. et al., 1999 и 2007; Donnez J. et al., 2002; Koninckx P.R. et al., 1999,а; Mai K.T. et al., 1999; Matsuura K. et al., 1999; Mok-Lin E.Y. et al., 2010; Redwine D.B., 2002; Sampson J. A., 1921, 1925, 1927, 1940). Тем не менее, это не объясняет полную картину патогенеза заболевания.

Исследования последних лет посвящены роли активных форм кислорода и оксидативного стресса в развитии ГЭ, в них подтверждаются высокий уровень сывороточных аутоантител к маркерам оксидативого стресса. (Bukulmez O. et al., 2008; Marini M.G. et al., 1997; Mayani A., 1997; G. Polak et al., 2001). Выявлено наличие корреляционной связи между нарушением структуры железотранспортного белка (ЖТБ) трансферрина (ТФ) и дефектом его связи с рецепторами при ГЭ (Л.В. Адамян и соавт., 2007). Обнаружена высокая концентрация нетрансферринсвязанного железа (НТСЖ) в тканях, окружающих очаги ЭГ на фоне снижения концентрации общего пула свободного железа, как в тканях, так и в цитозоле. При этом дефект связывания ТФ с рецепторами приводит к образованию конгломератов белка, короткоцепочечных молекул и ионов двух- и трехвалентного железа вместо передачи ионов Fe³⁺ на ферритин. Такая форма железа не способствует нормальному его метаболизму в клетках эндометрия, что наблюдается в тканях больных с генетическими аномалиями обмена железа (R.C. Hider, 2002; R.W. Evans et al., 2008). В этих конгломератах повышается концентрация железа. Наряду с необходимыми для организма свойствами, ионы железа способны катализировать (посредством реакции Фентона) производство молекул и радикалов, содержащих кислород, таких, как супероксид-анион-радикал, перекись водорода, гидроксильный и пероксильный радикалы. Все эти производные объединяются под общим названием активных форм кислорода (АФК) и способны вызвать значительные деструктивные изменения в клетках и тканях. АФК участвуют в перекисном окислении липидных мембран, окисляют тиоловые группы переносчиков оксида азота, повреждают электронтранспортную цепь (ЭТЦ) митохондрий, вызывают мутации ДНК и нарушают антиоксидантную защиту организма. Следствием этих массивных цепных разветвленных реакций становится состояние организма, называемое «оксидативный стресс» (ОС). ОС сопровождает все реакции в организме, является последствием многих физических воздействий, как, например, лазерное и радиационное облучения. Для защиты от поражения ОС в организме существует антиоксидантная система, одним из звеньев которой являются система церулоплазмин/трансферрин (ЦП/ТФ) и тиоловые группы белков (А.Ф. Ванин, 1998; В.К. Казимирко, В.И. Мальцев, 2004; Н.П. Чеснокова, 2006; В.П. Скулачев, 2009; S. Defrère et al., 2006; J.C. Lousse et al., 2009).

Таким образом, несмотря на огромное количество исследований, посвященных различным аспектам эндометриоза, в том числе и патогенезу, роль оксидативного стресса и нарушение функции антиоксидантной системы организма при данном заболевании остаются невыясненными, поэтому научный интерес представляет комплексное клинико-экспериментальное изучение роли локального ОС и системной АОЗ организма в патогенезе развития ГЭ. Современные исследования позволяют по-новому взглянуть на роль в нем оксидативного стресса и необходимость разработки современных критериев ранней диагностики этого патологического процесса.

Цель работы - оптимизация ранней диагностики генитального эндометриоза на основе изучения проявлений оксидативного стресса и нарушений активности антиоксидантной системы

Задачи исследования:

1. Провести анализ преморбидного фона, сопутствующих заболеваний, менструальной и репродуктивной функции у больных генитальным эндометриозом.

2. Оценить действие антиоксидантов на очаги эндометриоза при экспериментальном моделировании на животных.

3. Выявить окисление электроннотранспортной цепи митохондрий (ЭТЦ) в очаге аденомиоза, как прямого подтверждения наличия окислительного стресса на локальном уровне.

4. Изучить соотношение концентрации активных центров церулоплазмина и трансферрина, концентрацию вакантных тиольных групп белков крови как показателей активности антиоксидантной системы организма на системном уровне.

5. Определить клиническое значение показателей оксидативного стресса в диагностике генитального эндометриоза.

Научная новизна.

Полученные в работе результаты показывают значение окисления ЭТЦ митохондрий в развитии аденомиоза, роль церулоплазмина и трансферрина в антиоксидантной защите организма на системном и локальном уровнях.

Определено значение маркеров оксидативного стресса для диагностики и прогнозирования рецидивирования генитального эндометриоза.

Доказана эффективность применения антиоксидантных средств (динитрозильный комплекс железа с глутатионом) в лечении экспериментального эндометриоза.

Практическая значимость

На основе полученных сведений предложен алгоритм диагностики генитального эндометриоза, включающий в себя исследование соотношения активных центров церулоплазмина и трансферрина, концентрации тиольных групп белков, окисления ЭТЦ митохондрий.

Исследование маркеров оксидативного стресса позволяет проводить раннюю диагностику и прогнозирование вероятности рецидива генитального эндометриоза после оперативного лечения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Генитальный эндометриоз развивается на фоне неблагоприятного преморбидного фона, нарушений менструальной и генеративной функции.

2. Применение антиоксидантов (динитрозильные комплексы железа с глутатионом) уменьшают размеры эндометриоидных цист у животных при экспериментальном моделировании эндометриоза и подтверждает роль оксидативного стресса в формировании этого процесса.

3. Окисление электроннотранспортной цепи митохондрий является прямым подтверждением наличия оксидативного стресса в очаге поражения.

4. Нарушение функции антиоксидантной системы при генитальном эндометриозе проявляется изменением соотношения церулоплазмина и трансферрина, снижением концентрации тиольных групп белков крови.

5.Совокупность диагностически значимых показателей окисления электронтранспортной цепи митохондрий, соотношения церулоплазмин/трансферрин, снижения вакантных тиольных групп белков крови является критерием диагностики и прогнозирования рецидива генитального эндометриоза.

Внедрение результатов исследования в практику

Основные результаты работы внедрены в практическую деятельность МУЗ «Городская клиническая больница № 4» г. Ставрополь, МУЗ «Клиническая поликлиника № 6» г. Ставрополь, педагогическую практику кафедры акушерства и гинекологии факультета последипломного и дополнительного образования ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 1 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки.

Апробация диссертации

Материалы и основные положения диссертации представленыы на XV международной конференции «Новые технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2007), VII международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2006), на ежегодной краевой конференции акушеров-гинекологов (Ставрополь, 2006), на Международном конгрессе по эндоскопии (Москва, 2008), на V национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2009), на Европейском обществе гинекологов (Париж, 2010), VI национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2010).

Апробация диссертации состоялась 23 января 2011 года на совместной конференции кафедры Акушерства и гинекологии института последипломного образования ГОУ ВПО «Ставропольской государственной медицинской академии» МинЗдравсоцразвития России.
Личный вклад автора

Автором лично было проведено обследование пациенток, включенных в исследование. В ходе сбора материала для диссертационной работы соискателем были освоены методики верификации диагноза, спектроскопии электронного парамагнитного резонанса; методика экспериментального моделирования эндометриоза на лабораторных животных (крысах) – аутотрансплантация фрагмента эндометрия с миометрием к поверхности брюшины передней брюшной стенки. Все исследования проводились соискателем лично с участием сотрудников соответствующих лабораторий.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: список сокращений, введение, аналитического обзора литературы (I глава), материалы и методы собственных исследований (II главы), результаты исследования и обсуждения (III и IV главы), выводы, практических рекомендации, список литературы. Список литературы включает 57 отечественных и 141 на иностранных источников. Работа содержит 21 таблицы и проиллюстрирована 14 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Для решения поставленных задач проведено обследование 126 больных с генитальным эндометриозом в возрасте от 24 до 55 лет (средний возраст 39,7±1,4 лет), составивших основную группу. Для определения показателей нормы обследованы 55 женщин, составившие контрольную группу в возрасте от 24 до 55 лет (средний возраст 30,5±1,0 лет). В исследование включались женщины сопоставимые по полу, возрасту, характеру гинекологической и соматической патологии.

Пациентки основной группы были разделены на 4 подгруппы: I подгруппа - 49 пациенток с диффузной формой аденомиоза II стадии; II подгруппа - 31 пациентка с диффузной формой аденомиоза III стадии; III подгруппа - 28 пациенток с эндометриомами II стадии; IV подгруппа - 18 пациенток с эндометриомами III стадии ( по классификации Научного центра Акушерства, гинекологии и перинаталогии РАМН). Контрольная группа была разделена на три подгруппы: V подгруппа - 30 практически здоровых женщин, не имеющие хронической соматической и гинекологической патологии; VI подгруппа - 12 пациенток с аномалиями развития внутренних половых органов; VII подгруппа - 13 пациенток с доброкачественными образованиями яичников.

Основанием для разделения послужили разные подходы к специальным исследованиям пациентов в сравниваемых подгруппах наблюдения.

Проведен детальный анализ семейного анамнеза, гинекологической и соматической патологии, менструальной и генеративной функции.

Комплексное обследование включало общий и гинекологический осмотр, лабораторные исследования: общий анализ крови и мочи, биохимические и гемастазиологические параметры крови, определение уровня онкомаркеров СА-125, СА 19-9, СЕА. Всем больным проводилось, ультразвуковое сканирование органов малого таза, гистероскопия, лапароскопия или лапаротомия. После оперативного лечения проводилось патоморфологическое исследование операционного материала. Дополнительно исследовались отношение концентраций активных центров ферментов крови церулоплазмина и трансферрина, концентрация тиольных групп белков крови и окисления электронтранспортной цепи митохондрий в пораженной ткани. Исследования проводились в лаборатории физической химии биополимеров (руководитель проф. А.Ф. Ванин) института химической физики им. Семенова РАН, г. Москва. Сигналы ЭПР регистрировались на спектрометре фирмы «Брукер» (ФРГ) марки ECS-106, спектры ЭПР - на радиоспектрометрах «Radiopan» (Польша) и Brucer ECS – 106 (Германия) трехсантиметрового диапазона.

Экспериментальный ЭМ моделировали у крыс-самок линии Вистар (разводки питомника «Столбовая») весом 160-180 граммов, находящихся в фазе проэструса, аутотрансплантацией (эндометрием внутрь перитонеума) одного фрагмента эндометрия с миометрием (2×2 мм) к поверхности брюшины передней брюшной стенки. Все эксперименты проводили в соответствии с требованиями Женевской Конвенции “International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals” (Geneva, 1990). Для моделирования ЭМ была выбрана модификация операции, описанная в статье (Vernon MW et al., 2000). Животным (8 особей) опытной группы внутрибрюшинно вводилось 40 мкг динитрозильного комплекса железа с глутатионом Животные контрольной группы (6 особей) в те же сроки получали в физраствор в количестве 0,5 мл. Результаты оценивались по данным патоморфологического исследования.

Статистическая обработка полученных данных включала вычисление выборочного среднего (М), стандартного отклонения (SD), размаха варьирования (Min-Max), медианы. Для оценки достоверности различий средних по выборкам в случае соответствия эмпирического распределения нормальному использовался параметрический q-критерий Ньюмена-Кейлса. В остальных случаях – использован непараметрический U критерий Манна-Уитни. Различия категориальных переменных оценивалась на основе анализа таблиц сопряженности с помощью точного критерия Фишера и χ²- критерия Пирсона.

Достоверность разницы пары выборочных средних оценивалась по t критерию Стьюдента. В случае множественных сравнений пар средних использовался его аналог q-критерий Ньюмена-Кейлса. Для анализа достоверности различий качественных признаков (таблицы сопряженности) во всех случаях применялся χ² критерий Пирсона и, в случае таблиц 2∙2 – точный критерий Фишера. Достоверными считались различия при уровне значимости 5% (р < 0,05). В тексте диссертации статистическое описание признаков во всех случаях осуществлялось по правилу М ±SD.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ проведенного исследования показал, что основными причинами, побудившими больных обратиться за медицинской помощью были дисменорея, нарушение менструального цикла по типу полименореи, пред- и постменструальные кровянистые выделения из половых путей, диспареуния, хроническая тазовая боль различной интенсивности, бесплодие. Наиболее частыми жалобами больных были: постоянные боли внизу живота, не связанные с менструальным циклом в 78,8% случаев в I-II подгруппах и в 84,8% случаев III-IV подгруппах. Боли внизу живота, усиливающиеся во время менструации, выявлены у 78,8% случаев в I-II подгруппах и 92,8% случаев в III-IV подгруппах. В 62,5% случаев I-II подгруппах и в 36,9% случаев в III-IV подгруппах отмечена диспареуния. Бесплодие отмечено в 50% случаев в I-II подгруппах и 28,5% случаев в III-IV подгруппах, что сопоставимо с исследованиями Баскакова В.П., Цвелева Ю.В., РухлядаН.Н., 2002,David E. Beck, Patricia L. Roberts, John L. Rombeau, Michael J. Stamos and Steven D. Wexner, 2009.

Большинство пациентов основной группы имели отягощенную наследственность в виде новообразований половых органов у близких родственниц – в 52,3% случаев наблюдений, опухолей экстрагенитальной локализации в 10,3% случаев. В этой группе в 20,6% случаев их ближайшие родственницы получали лечение по поводу лейомиомы матки; эндометриоза различной локализации - в 34,1% случаев, причем достоверных различий частоты встречаемости этого патологического процесса не было выявлено, что согласуется с данными Barlow DH , Kennedy S.,2005.

Одновременно с набором пациентов в группы наблюдения был поставлен эксперимент in vivo, на 24 крысах линии Vistar alb. Экспериментальный эндометроз (ЭЭ) моделировался индуцированием эндометриоидных кист путем интраперитонеальной аутотрансплантации имплантов из слизистого слоя маточных рогов. Целью эксперимента стала оценка влияния оксидативного стресса на течение эндометриоидного процесса, эффективности и безопасности применения антиоксидантов для лечения эндометриоза. Все животные были разделены на основную и контрольную группу. Основная группа – 8 крыс с ЭЭ получали внутрибрюшинно препарат динитрозильного комплекса железа с глутатионом («Опытный завод Кардиологического Центра РАМН», Россия); контрольная группа – 6 крыс, не получавших лечения ЭЭ. Общая продолжительность эксперимента составила 45 суток. Результат эксперимента оценивался по результатам морфологического и гистологического исследования. Через 14 дней после операции при вскрытии у животных отмечали наличие эндометриоидных цист: кистозные образования на поверхности париетальной брюшины в области аутоимплантации лоскута-импланта слизистой оболочки маточных рогов - овальные или круглые образования, напоминающие кисты, со слизистым содержимым и размерами от 7.0 до 45.7 мм³. Результаты измерения показали, что в основной группе применение динитрозильного комплекса железа с глутатионом для лечения экспериментального ЭМ, достоверно снижает объем цист в 1,85 раза.

Гистологически очаг был представлен двумя компонентами – стромальным и гландулярным, с мелкими железами с узким округлой формы просветом, выстланными кубическим или цилиндрическим эпителием (эпителий в фазах покоя или пролиферации). Во всех случаях наблюдения отмечалась слабовыраженная воспалительная инфильтрация стромы эндометрия. На границе с аутотрансплантатом в тканях передней брюшной стенки были выявлены крупные очаги лейкоцитарной инфильтрации с примесью макрофагов и лимфоцитов, что указывает на развитие хронического воспаления, однако оно не переходило на аутотрансплантат и очаги деструкции в нем не выявлялись.

Полученные нами результаты являются подтверждением роли оксидативного стресса в формировании и прогрессировании эндометриоза и хорошим показателем для применяемого лекарственного средства в качестве антиоксиданта.

Таким образом, нами подтверждена рабочая гипотеза о том, что ингибирование локального оксидативного стресса сопровождается снижением способности эндометриальных аутотрансплантов к приживлению на париетальной брюшине и формированию эндометриоидподобных кист на экспериментальной модели генитального эндометриоза.

В настоящее время наибольшую трудность представляет диагностика эндометриоза на ранних стадиях развития болезни, когда заболевание не сказывается на физическом состоянии и активности больных.

Анализ становления менструального цикла показал, что у большинства пациенток менархе наступило в возрасте от 12 до 14 лет (в среднем в13,2±0,3 лет), при этом достоверных различий между возрастом появления первой менструации у пациенток основной и контрольной групп не выявлено (р>0,05). Статистически значимой связи между возрастом менархе и клиническим вариантом эндометриоза нами не выявлено, что не противоречит данным Адамян Л.В. и соавторы, 2006; Дамиров М.М., 2004.

Дисменорея значительно чаще отмечалась у пациенток I-II подгрупп - в 89% случаев, гиперполименореей страдали 91,3% и 52,1% пациенток I-II подгрупп и III-IV соответственно (р<0,05). Пред- и постменструальные скудные (мажущиеся) кровянистые выделения наблюдались во всех подгруппах основной группы практически с одинаковой частотой - в 25% случаев наблюдения. Полименорея отмечена в 85% случаев в I-II подгруппе и в 42,8% случаев в III-IV подгруппе. В 96,2% случаев I-II подгруппы и в 96,7% случаев III-IV подгруппы менструации были регулярными, что говорит о разнообразии и сочетанности клинических симптомов. Полученные данные сопоставимы с исследованиями Кулакова В.И., Адамян Л.В., Андреевой Е.Н, 2006.

Сравнительный анализ нарушений генеративной функции выявил зависимость степени ГЭ от паритета родов и абортов, что является дополнительным неблагоприятным фактором для развития генитального эндометриоза.

При бимануальном исследовании отмечалась значительная вариабельность размеров матки и придатков. Увеличение размеров матки, соответствующее 5-6 недельной беременности, выявлено у 14,7% обследуемых больных основной группы и у 62,5% контрольной. В 32,4% случаев основной группы матка соответствовала размерам 7-8 недельной беременности, 8-10 нед. – в 41,2 % случаев , 10-12 нед. беременности в 2,9% случаев наблюдения. При бимануальном и ректовагинальном исследовании у пациентов III и IV подгруппы определялись опухолевидные образования тугоэластичной консистенции в области придатков матки с обеих сторон – в 37% случаев и в 63% случаев с одной стороны. Образования располагались кзади от матки, подвижность их была ограничена.

При УЗ исследовании отмечена асимметрия стенок матки. Преимущественное увеличение одной из стенок матки выявлено в 100% случаев I-II подгруппы и в 2,2% случае III-IV подгруппы. Утолщение передней стенки было отмечено в 23,8% случаев I подгруппы и в 2,2% случае во II подгруппе. Утолщение задней стенки было отмечено в 76% случаев I подгруппы. В I-II подгруппах размеры яичников практически не превышали нормативных показателей, у больных III-IV подгруппы на эхограмме определялись круглые или овальные одно- и двусторонние образования повышенной и средней эхогенности размерами от 3 до 7 см. На эхограмме пациенток с III-IV определялся двойной контур в 71,7% случаев, в 32,6% случаев отмечалась повышенная эхогенность и в 67,4% случаев – средняя эхогенность образований. Визуализация неизмененной части яичников была затруднена и возможна только в 8,7% случаях с III-IV подгруппах. Содержимое кист в 87% случаев было однородным и представляло собой мелкодисперсную взвесь, а в 4,3% случаев III-IV подгруппы определялись плотные гиперэхогенные включения, что согласуется с данными Л.В. Адамян, Е.Н. Андреевой (1999).

Таким образом, анализ клинической картины генитального эндометриоза выявил особенности клинических проявлений патологического процесса, оказывавших отрицательное влияние на качество жизни пациенток.

Анализ параклинических исследований показал, что уровень гемоглобина в сыворотке крови у пациентов основной группы достоверно ниже по сравнению с контрольной группой. Показатели СОЭ во всех случаях в I-II и III-IV подгруппах не имели достоверных различий, однако, этот показатель статистически значимо выше в основной группе, чем в контрольной (р<0,05). Уровень глюкозы крови в основной и контрольной группах также не превышал значений нормы. Статистически значимых различий между уровнями АСТ, АЛТ, общего холестерина и глюкозы между пациентами в основной и контрольной группах не выявлено.

Результаты микроскопического исследования мазков из влагалища и цервикального канала отмечались в пределах нормы.

Исследование показателей ЛГ, ФСГ, тестостерона, пролактина, ТТГ, СТ4 во всех группах наблюдения не выявило статистических различий, они отмечались в пределах нормы. Стаистически достоверное повышение уровня эстрадиола отмечено только в подгруппах с эндометриомами (III - IV подгруппы). Наиболее низкий уровень прогестерона был отмечен в подгруппах с аденомиозом (I-II подгруппы), и, тем не менее, он отмечался в пределах нормативных значений.

Анализ показателей онкомаркеров показал, что уровни СА – 19-9 и РЭА во всех группах наблюдения отмечались в пределах нормы и не имели достоверных различий. Информативно значимым показателем явился СА-125, который в основной группе был статистически значимо выше, чем в контрольной. Кроме этого, в подгруппах с эндометриомами яичников (III-IV подгруппы) он был достоверно выше, чем в подгруппах с аденомиозом (I-II подгруппы) (р<0,05). Полученные нами данные согласуются с данным Адамян и соавт.(2006), отмечавших что уровень СА-125, СЕА, СА 19-9 у больных генитальным эндометриозом может быть повышенным, причем у больных с эндометриомами эти показатели значительно выше, чем при аденомиозе.

Анализ результатов патоморфологического исследования оперативного материала в основной группе показал, что в большинстве случаев наблюдения патологических процессов эндометрия выявлено не было. Гиперпластические процессы были диагностированы только в 12,2% случаев в подгруппах с аденомиозом (в I-II подгруппах). При проведении оперативного лечения в подгруппах с эндометриомами (в III-IV подгруппе) были отмечены характерные патоморфологические признаки: одно- или многокамерные образования, с плотной толстой стенкой и шоколадным содержимым. Гистологическое исследование полученного материала в основной группе наблюдения характеризовалось структурно-функциональными тканевыми реакциями: железы, окруженные цитогенной стромой, обилие сосудов в строме, кровоизлияние, большое количество гемосидерина и ксантомные клетки.

Изучение проявлений оксидативного стресса выявило окисление центров в митохондриальной цепи транспорта электрона в ткани миометрия у больных с АМ. Исследования показали, что индекс окисления дыхательной цепи митохондрий (R), вычисленный как отношение дифференциальных интенсивностей сигналов с g-фактором 2,00 (свободные радикалы семихинонного типа, СР) и с g-фактором 1, 94 (железосерные центры N-1b и S-1, ЖСЦ) является показателем ОС. Показателем окисления цепи является уменьшение интенсивности сигнала, увеличение (за счет увеличения амплитуды убисемихинонного сигнала) интенсивности сигнала СР (g=2,00) или оба эти процесса одновременно. Приняв полученную при исследовании здоровой ткани миометрия (реконструктивная пластика матки) величину индекса за единицу, можно оценить степень окисления дыхательной цепи при разных стадиях развития эндометриоза.

Рис. 1. Спектры ЭПР ткани миометрия (2-5 мм от центра основного очага эндометриозного воспаления) с соответствующими указанному номеру компонентами сигнала Mn²⁺ в решетке MgO. Стрелкой указано направление магнитного потока

Рис. 2. Спектр ЭПР ткани миометрия из очага аденомиозного поражения. В – направление магнитного потока.

Таблица 1

Величины средних дифференциальных интенсивностей (усл. ед.) и индексов окисления электротранспортной цепи

Группы

наблюдения

Средней

интенсивности СР

Средней

интенсивности

ЖСЦ

R нормирован.

I-II подгруппа

2,79±0,83

0,51±0,18

5,41±0,69*

1,16±0,13

VI подгруппа

2,23±0,14

0,69±0,28

4,67±0,79

1,00±0,17

Примечание: * – p < 0,05 – в сравнении с контрольной группой.

Сдвиг в сторону окисления ЭТЦ в ткани миометрия больных I - II подгруппы обусловлено снижением интенсивности сигнала ЖСЦ (рис. 1). Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что индекс окисления электронтранспортной цепи митоходрий у больных с аденомиозом достоверно выше, чем в контрольной группе. Таким образом, при аденомиозе 2-3 степени в тканях, окружающих очаг поражения, наблюдается значительное, достоверно превышающее показатель в контрольной группе, повреждение ЭТЦ в митохондриях ткани миометрия.

Ткань, находящаяся в центре очага, содержит инактивированные митохондрии и большое количество нитрозил-гемовых соединений (рис. 2). Сигнал ЭПР такого рода соединений по интенсивности превосходит все сигналы с g = 1,94 и g = 2,00 и делает невозможным исследование той малой части ЖСЦ и СР, входящих в ЭТЦ, которые, возможно, сохранились неприкосновенными. Наши данные согласуются с данными литературы Бургова Е.Н., Прошина И.В., Абубакирова А.М., Ванин А.Ф.1986; Ленинджер А., 1974.

Приведенные в таблице 2 результаты показывают, что увеличение показателей СОЭ, зависящие от перекисного окисления липидов мембран эритроцитов, в I и II подгруппе достоверно выше, что служит еще одним аргументом в пользу гипотезы о свободнорадикальном характере протекания генитального эндометриоза и превалировании ОС в его течении. Полученные нами данные согласуются с исследованиями Агарвал и Аламанени (2004), Zeller (1987).

Сотношение концентраций активных форм церулоплазмин/трансферрин в группе больных было достоверно выше, чем в контрольной, при этом различия между результатами в первой и второй подгруппах были статистически незначимы. Полученные нами результаты не противоречат исследованиям Агарвал А. и Аламанени, 2004, Zeller 2007. Нарушение антиоксидантной системы церулоплазмин/трансферрин влечет за собой возрастание в крови концентрации активной (одновалентной) формы церулоплазмина и снижение активной (трехвалентной) формы трансферрина (рис. 3).
Таблица 2

Показатели гемоглобина, СОЭ и отношения ЦП/ТФ

Группа наблюдений	Гемоглобин, г/л	СОЭ,мм/ч	Отношение ЦП/ТФ	Концентрация тиольных групп белков (нмоль/л)
I подгруппа	111,9±8,5 *	12,0±2 *	2,4±0,3 *	22,0 ±1,5*
II подгруппа	97,3±4,8 *	15,1±3,*	3,3±0,3 **	20,8±1,3*
III подгруппа	121,0±7,4*	15,4±3,*	2,3±0,3 *	24.4±1.7*
IV подгруппа	118,1±5,2	18,6±2,*	3,3±0.4 **	21.2±1.5 *
V подгруппа	124,9±8,4	6,6±2,3	1,1± 0,2,	32.4±2.9*
VI подгруппа	122,6±10,4	7,4±2,3	1,3±0,4	31,5±3,7 *
VII подгруппа	121,5±9,5	8,4±2,5	0,85±0,17	31.2±1,5*

Примечание: * – р<0,001 – достоверность различий в сравнении с контрольной группой, n – количество наблюдений, ** - достоверность различий в сравнении с I и III подгруппой.

Рис. 3. Характерные спектры ЭПР церулоплазмина крови пациенток контрольной (C ) и группы с аденомиозом(D).

Рис. 4. Спектры ЭПР трансферрина пациенток контрольной (C ) и группы с аденомиозом(D).

Для определения концентрации свободных тиольных групп в белках крови, мы использовали способность белков к связыванию оксида азота в виде динитрозильных комплексов. В крови происходила реакция присоединения этих комплексов к вакантным тиольным группам белков крови. Такие соединения при оксидативном стрессе образуются быстро и способны существовать длительное время. Конечный продукт является парамагнитным и может быть зафиксирован методом ЭПР. Концентрация белковых ДНКЖ определялась путем сравнения с дифференциальной интенсивностью сигнала стандартного образца белкового (альбуминового) ДНКЖ.

Рис. 5. Распределение ширин сигналов по группам.

При ЭПР-исследовании было выявлено, что разность средних значений ширины сигналов по группам исследования статистически не значима и практически совпадает. Это свидетельствует о том, что все вакантные тиоловые группы в белках крови прореагировали, не регистрируются низкомолекулярных формы, и сравниваются в группах концентрации одних и тех же соединений – высокомолекулярных, что согласуется с мнением S. Gupta et al.; A. Van Langendonkt et al.; LW Jackson et al., 2005.

Таким образом, подводя итоги данного исследования, можно заключить, что мы определили проявления оксидативного стресса у больных генитальным эндометриозом различной локализации.

Наше исследование показало несомненную связь как широко используемых в клинической практике показателей - гемоглобин и СОЭ, так и относительно редко используемых – отношение ЦП/ТФ, концентрации вакантных тиольных групп, окисление электронтранспортной цепи митохондрий, с наличием и прогрессированием окислительного стресса. Повышение отношения церулоплазмин/трансферрин в основной группе по сравнению с контрольной показывает снижение активности одного из важных звеньев антиоксидантной защиты. Уровень антиоксидантной защиты организма, обеспечиваемый эндогенными тиолами и церулоплазмином у пациенток с эндометриозом значительно снижен, что наглядно показывает наличие оксидативного стресса и снижение антиоксидантной защиты организма при генитальном эндометриозе. По мере прогрессирования заболевания оксидативный стресс нарастает, а активность антиоксидантной системы организма снижается.

Полученные нами данные подтверждают значение оксидативного стресса в развитии и прогрессировании генитального эндометриоза, перспективность и правомочность использования показателей ОС в диагностике этого заболевания.

Таким образом, клиническая картина генитального эндометриоза характеризуется следующими особенностями:

- наличием отягощенной наследственности, неблагоприятным преморбидным фоном: высокой частотой перенесенных заболеваний и сопутствующей соматической патологии;

- нарушением менструального цикла различного характера, болевым синдромом, снижением генеративной функции;

- проявлением оксидативного стресса в ткани миометрия, выражающемся в окислении электронтранспортной цепи митохондрий.

- снижением антиоксидантной защиты организма, что подтверждается повышением в крови соотношения активных форм церулоплазмина/трансферрина, снижением концентрации свободных тиоловых групп белков, снижением уровня гемоглобина и повышением СОЭ.
ВЫВОДЫ

Отягощенный семейный и гинекологический анамнез, нарушения менструальной и генеративной функции у женщин репродуктивного возраста являются одним из предрасполагающих факторов развития генитального эндометриоза.

2. Применение антиоксидантов (ДНКЖ с глутатионом) в экспериментальном моделировании эндометриоза на животных вызывает уменьшение цист в 1,85 раза. Полученные результаты являются подтверждением рабочей гипотезы об ингибировании локального оксидативного стресса, которое сопровождается снижением способности эндометриальных аутотрансплантов к приживлению на париетальной брюшине и подтверждает роль оксидативного стресса в развитии генитального эндометриоза у человека.

3. При аденомиозе выявляется окисление электроннотранспортной цепи митохондрий, являющееся маркером окислительного стресса, и усугубляется в соответствии со степенью тяжести, стадией и длительностью заболевания нарастающее в зависимости от стадии процесса.

4. Показателем нарушения антиоксидантной системы является нарастающее достоверное увеличение соотношения активных форм церулоплазмина и трансферрина и достоверное снижение концентрации вакантных тиольных белков крови по мере прогрессирования заболевания.

5. Диагностически значимыми критериями распространения и рецидивирования генитального эндометриоза являются снижение уровня гемоглобина, увеличение СОЭ, повышение уровня СА-125, нарастание окисления электроннотранспортной цепи митохондрий, увеличение соотношения ЦП/ТФ в 2,5 раза и снижение концентрации вакантных тиольных групп белков в 1,6 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В диагностике генитального эндометриоза необходимо тщательное изучение семейного анамнеза, менструальной, генеративной и репродуктивной функции,
Определение и мониторирование показателей гемоглобина, СОЭ, СА – 125 могут быть рекомендованы в качестве неспецифических маркеров оксидативного стресса у пациентов для выделения в группу риска развития генитального эндометриоза.
Определение нарушений фунционирования антиоксидантной защиты организма – повышение соотношения активных форм ЦП/ТФ в 2,5 раза и снижение концентрации тиольных групп белков в 1,6 раза свидетельствует о прогрессировании или рецидивировании заболевания.
Алгоритм обследования пациентов с риском развития или рецидивированием генитального эндометриоза должен быть дополнен маркерами оксидативного стресса

Применение антиоксидантов позволит повысить эффективность консервативной терапии больных генитальным эндометриозом при подготовке к оперативному лечению.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Ионова Р.М., Гаспарян С.А., Чепрасова Г.П., Бургова Е.Н., Ванин А.Ф., Адамян Л.В. Нарушения функции эндометрия и миометрия при генитальной форе эндометриоза, вызванные окислительным стрессом. // Материалы международной конференции «Биоантиоксидант».- Москва.- 2006. – С.146-147.
2. Чепрасова Г.П., Ионова Р.М., Гаспарян С.А., ,Бургова Е.Н., Микоян В.Д., Ванин А.Ф. Окисление тиольных групп белков крови при эндометриозе как проявление оксидативного и нитрозативного стрессов.// Материалы международной конференции «Биоантиоксидант».- Москва.- 2006. – С.275-276.
Гаспарян С.А., Ионова Р.М., Чепрасова Г.П., Бургова Е.Н., Ванин А.Ф., Адамян Л.В. Системные нарушения функции эндометрия и миометрия при генитальной форме эндоетриоза, вызванные окислительным стрессом.// Сборник научных трудов XV Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Крым, Ялта-Гурзуф.- 2007.- С.441- 442.

4. Л.В.Адамян, Е.Н. Бургова, В.Д. Микоян, А.Ф. Ванин, Р.М. Ионова, Г.П. Чепрасова С.А.Гаспарян. Нарушение электронно-транспортной цепи как проявление оксидативного стресса при эндометриозе. // Проблемы репродукции.-.2007.- №5. – С.103-107.

5. Ионова Р. М., Гаспарян С.А.,Чепрасова Г.П., Бургова Е.Н., Ванин А.Ф., Адамян Л.В.. Окислительный стресс нарушает функции эндометрия и миометрия при генитальной форме эндометриоза. // Материалы научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск.- 2009. С.187-190.

6. Бургова Е.Н., Гаспарян С.А., Чепрасова Г.П., Ионова Р.М., Сереженков В.А., Микоян В.Д., Ванин А.Ф., Адамян Л.В..Эндометри оз:нарушение антиоксидантной защиты и ее коррекция мексикором.// Материалы международной конференции «Биоантиоксидант».- Москва.- 2010. – С.67-68.

7. Ionova RM , Mynbaev OA Eliseeva My, Burgova EN, Serezhenkov VA,

Vanin AF. The engraftment and transplant cyst formation disruption in the

rat endometriosis model is associated with reactive oxygen species inhibition. (Нарушение формирования очагов эндометриоза у крыс связано с воздействием на реактивные формы кислорода). Albert Netter meetings and 10th Meeting Days of the French Society of Maison de la Chimie, Paris (France). 13-16 Oct 2010.