Лекція №1. Транспорт речовин через мембрани

Трансмембранна передача сигналів
Лекція №1.

Транспорт речовин через мембрани

1. Проникність біомембран

Будучи відкритою термодинамічною системою клітка постійно обмінюється речовиною з навколишнім середовищем. Цей обмін можливий завдяки такій властивості біомембран, як проникність.

Вся життєдіяльність організмів пов'язана із цією здатністю: розподіл речовин між кліткою й тихорєцькою рідиною, генерація біопотенціалу й ін.

Вивчення проникності має величезне значення для медицини (фармакологія, токсикологія)...

2. Рушійні сили перенесення речовини через мембрану.

Електрохімічний потенціал. Переміщення речовин у клітку й з її в навколишнє середовище може здійснюватися багатьма способами. Залежно від того, чим представлене джерело енергії для перенесення речовин, що є рушійною силою переміщення, всі види перенесення можна розділити на пасивний й активний транспорт.
Види активного та пасивного транспорту:

Малі незаряджені молекули можуть проходити через ліпідний подвійний шар, тоді як заряджені навіть невеликі проникають тільки при наявності каналообразуючих білків або білків переносників.

Схема роботи транспортних систем

(класифікація способів перенесення через мембрану за напрямком)

Пасивний транспорт речовин

Проста дифузія. Основним механізмом пасивного транспорту речовин, обумовленим наявністю концентраційного градієнта, є дифузія.

Пасивний транспорт речовин завжди здійснюється за рахунок енергії, сконцентрованої в якому-небудь градієнті, при цьому енергія метаболічних процесів безпосередньо на перенесення не витрачається. Пасивний транспорт відбувається по напрямку градієнта, тобто від більше високого енергетичного рівня до більше низького. У результаті цього градієнт зменшується, якщо немає процесів, що забезпечують його підтримка.

Часто в клітках одночасно є кілька градієнтів, які накладаються один на одного - суперпозиція градієнтів. У такому випадку перенесення речовини буде визначатися результуючих всіх градієнтів.

Основними градієнтами, властивим живим організмам є: концентраційні або хімічні, електричні, осмотичні й градієнт гідростатичного тиску рідини.

Дифузія- мимовільний процес проникнення речовини з області більшої в область меншої його концентрації в результаті теплового хаотичного руху молекул.

Відповідно до закону Фіка, швидкість дифузії - кількість речовини в молях, що дифундує в 1 часі через дану площу.

- градієнт концентрації (хімічний градієнт), тобто зміна концентрації речовини, що доводиться на одиницю довжину, у напрямку дифузії.

знак «-» показує, що напрямок дифузії від більшої концентрації до меншого.

Д - коефіцієнт дифузії дорівнює кількості речовини, що дифундує в 1 часі через 1 поверхні при градієнті концентрації рівному 1.

Д залежить від t⁰, Q=1,4/

Якщо молекули, що дифундують, рухаються без утворення комплексу з іншими молекулами, то така дифузія називається простій.

Тому що концентраційний градієнт клітинної мембрани визначити важко, те для опису дифузії через них, використають більше просте рівняння. (Коллендер і Берлунд).

З₁, З₂ – концентрації речовини по різні сторони молекули

Р - коефіцієнт проникності (аналогічний коефіцієнту дифузії), тобто кількість речовини, що проникає через одиницю поверхні мембрани за одиницю часу, за умови, що різниця концентрацій дорівнює 1.

На відміну від Д, що залежить від природи речовини, а Р залежить ще й від властивостей мембрани й від її функціонального стану.

Перехід молекул з водної фази в рідку супроводжується розривом водневих зв'язків. Виявлено кореляцію між числом шкідливих зв'язків і проникністю. Для води проникність залишається аномально високої.

У цей час припускають існування двох шляхів для переміщення води й малих гідрофільних молекул через мембрану.

Одна з них - гідрофільний - молекули проходять через пари, сформовані інтегральними білками мембран.

Другий шлях - пов'язаний з виникненням лабільних структурних дефектів в вуглеводної області мембрани в результаті теплових флуктуацій.

Ці рухливі структурні дефекти в вуглеводної області мембрани, можуть бути шляхами переміщення як Н₂О, так й інших малих гідрофільних молекул, вони названі кинками (кинки).

Можливі шляхи переміщення через мембрану.

для Н₂О;
для малих гідрофільних молекул.

Проникнення часток, що мають електричним зарядом, через клітинну мембрану залежить не тільки від концентраційного градієнта, але й від електричного.

У зв'язку із цим перенесення іонів може здійснюватися в напрямку, протилежному концентраційному градієнту, при наявності протилежно спрямованого електричного градієнта. Сукупність концентраційного й електричного градієнтів називається електрохімічним градієнтом.

Пасивний транспорт іонів через мембрану завжди відбувається по електрохімічному градієнті.

Лекція №2.

Активний опосередкований транспорт

Отже для всіх процесів опосередкованого перенесення через біомембрани характерні три особливості - субстратна специфічність, здатність до насичення й чутливість до інгібіторів.

Використовуючи інший критерій, ці процеси можна розділити на два класи - активне й пасивне опосередковане перенесення. Якщо процес залежить від джерела метаболічної енергії - активний.

Таке перенесення придушується при блокуванні гліколізу або подиху. Наприклад, фторидами, йодацетатом, арсенатами, ціанідами або при роз'єднанні окисного фосфорилювання 2,4-динитрофенолом.

В еритроцитах підтримується в нормі висока внутрішньоклітинна [К*], тоді як іони Na⁺ й K⁺ по обох сторони мембрани вирівнюється.

Системи, що залежать від метаболічної енергії, провадять роботу, тобто переносять речовини проти градієнта.

У той же час, системи пасивного опосередкованого перенесення не придушуються при блокуванні джерел метаболіної енергії.

Ще один критерій заснований на спрямованості процесу активного перенесення, що складає в тім, що субстрати переміщаються через мембрану тільки в одному напрямку.

Наприклад, активне перенесення для іонів Na⁺ тільки назовні, ДО⁺ тільки усередину.

У цьому відмінність активного опосередкованого перенесення від пасивного, котрий може здійснюватися в обох напрямках залежно від відносних концентрацій по різні сторони мембран.

Цікаво, що в тих випадках, коли енергія по тимі або інших причинах не надходить, деякі системи активного перенесення в клітках здійснюють також пасивне перенесення своїх субстратів через мембрану залежно від відносних концентрацій.

Обмінна дифузія

Зовнішня мембрана мітохондрій порівняно добре проникна для більшості розчинених низькомолекулярних з'єднань, внутрішня мембрана проникна тільки для Н₂ПРО, невеликих нейтральних молекул, таких наприклад, як сечовина й гліцерин, ефірних кислот з коротким ланцюгом.

Внутрішня мембрана непроникна для катіонів Na⁺, ДО⁺, Mg⁺⁺, для аніонів Cl^-, NO₃^-, для цукрів (як сахароза), для більшості амінокислот. Вона непроникна й для NAD⁺, NADP⁺, NAD H, NADP H, для нуклеозид-5’ моно, ди й трифосфатов, а також для СоА і його ефірів. У такий спосіб ці з'єднання мітохондрій фізично й функціонально відділені від цитоплазми.

Виявлено, що внутрішня мембрана містить трохи перлиаз, що здійснюють перенесення специфічних метаболітів через мембрану. Такі переносники нагадують ферменти, оскільки вони мають специфічність стосовно транспортують веществам, що, здатні насичуватися при досить високих концентраціях і піддані специфічному інгібуванні.

У мітохондріях печінки пацюків були ідентифіковані переносники для АДФ й АТФ, для фосфату, а також для деяких проміжних продуктів циклу трикарбонових кислот.

Найбільше добре вивчений переносник внутрішньої мембрани мітохондрій, що здійснює перенесення АДФ й АТФ - з'єднань, які не можуть проникати крізь мембрану шляхом простої дифузії.

Існування такого переносника було передвіщено на підставі даних, отриманих при вивченні інгібітору атрактилозида (токсичного глікозида).

Атрактилозид придушує окисні фосфорилирование АТФ, доданого в середовище, у якій перебувають ізольовані мітохондрії.

На відміну від інших інгібіторів окисного фосфорилирования, таких як олиголицин, атрактилозид не інгубує окисне фосфорилювання внутришньомітохондриального АДФ. Цей факт привів до висновку, що атрактилозид інгубує не сам процес ок. фосфорилювання, а перенесення АДФ й АТФ через мітохондриальну мембрану, здійснюваний специфічним переносником. Подальші дослідження показали, що цей переносник може забезпечити надходження молекули АДФ усередину мітохондрії тільки за умови, що з мітохондрії одночасно виходить молекула АТФ. Такий процес заміни однієї молекули на іншу, одержав назву обмінної дифузії.

Переносник функціонує таким чином, що одна молекула АТФ, що утвориться як кінцевий продукт ок. фосфорилювання, виходить із мітохондрії в обмін на молекулу АДФ, що надходить ззовні, що потім фосфорилюється в мітохондрії.

Існує певний пул аденозинфосфатів цитоплазматичного і внутрішньомітохондриальний.

Адф-атф-переносник має дуже високу спорідненість стосовно АДФ й АТФ, здатний насичуватися й характеризується винятково високим ступенем специфічності, він не забезпечує зокрема перенесення інших нуклеозидфосфатів, таких як ГТФ, ГДФ і ЦТФ, ЦДФ.

У такий спосіб він має різноманітні властивості, характерними для ферментів: однак на відміну від ферментів, каталізуючих гомогенні реакції, цей специфічний переносник забезпечує одночасно два процеси - надходження АДФ і висновок АТФ.

Інша система перенесення, відповідальна за обмінне перенесення фосфатних і гидроксилних іонів через внутрішню мембрану, інгубується ртутним прекаратом мерсалілом.

Не виключено, що системи, що забезпечують перенесення Рi й АДФ, функціонально зв'язані один з одним.

Перенесення деяких дикарбонових і трикарбонових кислот, що є проміжними продуктами циклу Кребса, також здійснюється специфічними переносниками. Два таких переносники були ідентифіковані Чеппелом.

Один з них здатний переносити сукцинат і малат, але не може транспортувати інші дикарбоновые кислоти, зокрема: флумарат, аксалоацетат, α-кетоглутарат. Цей переносник інгубується Н-бутилмлонатом.

Інший переносник, що здійснює перенесення трикарбонових кислот - ізоцитрата й цитрату або цис-акснитата - вимагає одночасної присутності фосфату й малата.

Таким чином, що утворилися молекули АТР - Рi й АДР повинні проникнути усередину мітохондрії. Реакції циклу Кребса, электронпереносна ланцюг й окисне фосфорилювання відбуваються усередині мітохондрій. Що утворився АТР повинен вийти з мітохондрії в цитаплазму, де витрачається як джерело енергії.

Внутрішньомітохондриальний пул АДР й АТР відділений від цитоплазматичного, але між ними відбувається еквівалентний обмін, здійснюваний переносником, чутливим до атрактилозиду.

Така роздільна локалізація проміжних продуктів відіграє важливу роль як кошти регулювання й інтеграції, по-перше гліколізу й подиху, а по-друге, тих анаболічних шляхів, складовою частиною яких є цикл трикарбонових кислот.

Лекція №3.

Передача сигналів у біосенсорах.

ДО 1962 р. Кларк пристосував "кисневий електрод" для визначення концентрації глюкози в крові. Для цього він оточив кисневий датчик шаром гелю, що містить биокатализатор (фермент глюкозооксидазу), і напівпроникної диализной мембраною, що дозволяє глюкозі дифундувати до датчика, але перешкоджаючому виходу ферменту з електрода. Ця мембрана не пропускала також ферменти, які могли б зруйнувати биокатализатор. Чим більше глюкози надходить у пристрій, тим більше кисню утвориться під дією ферменту. Дані по кисні перетворяться безпосередньо в дані по концентрації глюкози.

Пристрій Кларка не одержало широкого поширення в практичній медицині. Його точність сильно залежала від швидкості дифузії кисню й глюкози, але ця швидкість могла змінюватися й у результаті зміни концентрації кисню в крові хворого, і в результаті утворення згустку на поверхні датчика. Проте, цей пристрій послужило концептуальною базою для наступних робіт Кларка й інших дослідників: розробки біологічної системи, чутливої до певної сполуки, фізичного "провідника", що перетворить хімічні зміни у вимірювані, і мембран, що розділяють елементи сенсора й отделяющих їх від зовнішнього середовища.

Наступний важливий крок у розвитку биосенсоров був зроблений в 1969 р. Джорджем Ж.Гибо з Університету шт. Луизиана в Новому Орлеані. Гибо створив систему для визначення сечовини в тканевых рідинах по уреазе - ферменті, що перетворює сечовину у двоокис вуглецю й амоній. Убудований у систему електрод реєстрував зміни концентрації іонів амонію. Биосенсор Гибо ознаменував собою новий етап, оскільки винахідник використав потенциометрическое детектирование, що одержало з тих пор широке поширення.

Я
кщо датчик Кларка вимірював струм, що протікає через електрод, то потенциометрический датчик реєструє зміна напруги, необхідне для підтримки струму на нульовому рівні. Електрод не споживає продуктів реакції, що робить його менш чутливим до змін зовнішнього середовища. Крім того, потенциометрический метод реєстрації має логарифмічну шкалу відгуку, що дозволяє відслідковувати 100-кратні зміни концентрації аналізованої речовини.

ЗА ДЕСЯТИЛІТТЯ, що пройшли із часу появи цих електрохімічних методів, у биосенсорах було використано близько 100 різних ферментів. Дослідники, однак, зрозуміли, що індивідуальні ферменти - це не єдині підходящі биокатализаторы. Як показав недавно Шарри А. Рехниц із Гавайського університету, препарати тканин можуть забезпечити комплексні послідовності реакцій, що формують відгук на вплив амінокислот і інших біологічно важливих молекул. Рехниц використав м'якоть банана для визначення змісту дофамина, зерна кукурудзи для пирувата, листи огірків для цистеина, цукровий буряк для тирозину, печінка кролика для гуаніну й стовчені в порошок м'язи кролика для аденозинмонофосфата.

Рехниц не зупинився на досягнутому у використанні частин біологічних систем: один з його сенсорів містить у собі антеннулы, або дрібні сенсорні органи, блакитного мэрилендского краба, відсічені таким чином, що б їхні нервові закінчення можна було б з'єднати з електродами. Заснована на цих антеннулах система здатна вимірювати концентрації багатьох отрут і токсинів навколишнього середовища.

Сенсор на основі антеннул краба й подібні з ними системи представляють можливість зрозуміти їхню інформаційно-передавальну структуру й створити більше прості сенсори, що включають ті ж самі молекули. Такі сенсори володіють також перевагами узагальненої рецепції: якщо ферменти й антитіла мають чудова властивість виявляти індивідуальні сполуки, те інші биомолекулы можуть виявитися більше корисними у виявленні представників широкого класу хімічних сполук. Ричард Ф.Тэйлор з фірми Arthur D. Little, Inc. створив, наприклад, сенсор на основі мембранних рецепторів ацетилхоліну, що передають інформацію від нервових волокон м'язам. Цей пристрій може визначати присутність декількох різних нервово-паралітичних газів.

Одним із ключових факторів, що сприяли виходу биосенсоров з лабораторій у повсякденне життя, став розвиток технології, загалом кажучи, не пов'язаної з розробкою биосенсоров, а саме методів стабілізації биомолекул і прикріплення їх до поверхні без втрати активності. (Нарізати банани в постелі хворого, щоб вимірювати зміст дофамина - справа непрактичне.) Багато хто з підходів, використовуваних для зв'язування ферментів або антитіл з поверхнями в лабораторних тестах і біохімічних виробничих процесах, можуть застосовуватися й для приєднання молекул до биосенсорам.

Витяг білків з їхнього внутрішньоклітинного оточення може приводити до руйнування їхньої структури й підвищенню сприйнятливості до хімічного "атакам", але технічні прийоми, спрямовані на зв'язування білків із субстратом, сприяють і стабілізації цих білків. Хімічні зв'язки, що втримують молекулу білка в бусинках полімерів, можуть "зшивати" ділянки молекул білка таким чином, щоб перешкоджати його розгортанню й збільшувати резистентність до ферментативної деградації. У результаті биосенсоры можуть зберігатися в сухий або у зволоженій формі протягом тижнів або місяців, а в ряді випадків вони не гублять активності навіть після року зберігання.

Широкі можливості для вдосконалення биосенсоров були надані й мембранні технології. Зараз вдається конструювати мембрани для поділу розчинених речовин по розмірі молекул, заряду або розчинності. Одна із широко використовуваних лабораторних тест-систем включає не менш напівдюжини мембранних шарів, кожний з яких має різні властивості й містить різні реагенти. Останні досягнення у вивченні властивостей ліпідних бислоев, аналогічних бислойным поверхневим мембранам кліток, уможливили включення рецепторних білків із клітинних мембран (таких як рецептори ацетилхоліну) у биосенсоры в умовах, що імітують природне оточення рецепторів.

ХОЧА ВІДКРИТТЯ в області біотехнології безсумнівно сприяли поліпшенню биосенсоров, але все-таки дешев і доступними їх зробила напівпровідникова промисловість. На початку 1970-х років Джеймс Б. Энгелл зі Станфордского університету й Кенселл Д. Вайз із Мичиганского університету створили множинні мініатюрні електроди на кремнієвих кристалах, за допомогою яких стало можливим проводити електрохімічні виміри тканин нервової системи. Йири Йаната з Університету Итаки покрив затвор польового транзистора замінником антитіл конканавалином А (Кона) і одержав детектор, названий CHEMFET. Подальші дослідження привели до розробки загальної технології включення хімічних компонентів і інтегральних схем у єдину систему.

Перший детектор глюкози Кларка був біля сантиметра в діаметрі: в останнє десятиліття технологія виробництва інтегральних схем дозволила створити мініатюрні сенсорні електроди діаметром усього трохи сотих часток міліметра. Пристрою, власне кажучи подібні із принтерами комп'ютерів, здатні наносити реагенти й мембрани на кінчики таких електродів строго впорядкованим образом. Такі промислові методи дозволяють штампувати тисячі й навіть мільйони ідентичних сенсорів з дуже низькою собівартістю.

Биосенсоры і їхнього застосування
Вимірювана речовина	Біологічний сенсор	Фізичний сенсор
Бензо(а)пирен	Антитіло до бензо(а)пирену	Флуориметр на оптичному волокні
Креатинин	Креатининиминогидролаза	Полевой транзистор
Этанол	NADH і дегидрогеназа	Окислювально-відновний електрод
-Глобулін	Антитіло до -глобуліну	Поляризоване світло
Лидокаин	Антитіло до лидокаину й комплексу ферроцен-лидокаин	Кисневий електрод
Нервнопаралитический газ	Рецептор ацетилхоліну	Вимір провідності
Паратион	Антитіло до паратиону	Пьезокристалл
Пеніцилін	-лактамаза	Термістор
Тестостерон	Ферменти биолюминисценции: дегидрогеназа й люцифераза	Флуориметр на оптичному волокні
Теофиллин	Антитіло до теофиллину	Поверхневий резонанс на ефекті плазмона
Вітамін B₁₂	Бактерії Escherichia coli	Кисневий електрод

Завдяки цьому медичні працівники можуть дозволити собі викидати сенсори після їхнього однократного використання щоб уникнути переносу інфекції.

Нові дешеві сенсори стали воістину благом для діабетиків, яким потрібно кілька разів у день визначати рівень цукру в крові. Одна з таких систем, розроблена на основі досліджень Энтони П. Ф. Тэрнера із Гренфильдского технологічного інституту в Англії, включаєте себе комбінацію сенсора з підсилювачем на інтегральній схемі й дисплеєм на рідких кристалах, причому весь пристрій по своїх розмірах не більше авторучки. Фермент сенсора, як і у вихідному детекторі Кларка, перетворює глюкозу в глюконовую кислоту, але далі "посередник", яким служить ферроцен, повертає фермент у реакционноспособное стан, а сам реактивируется під впливом електродного струму. Пристрій не споживає ніяких реагентів і здатний функціонувати протягом тривалого часу.

Вибір хімічно чутливих електродів усе більше розширюється, і медики можуть тепер використати ферментативні реакції зухвалі зміни тільки концентрації кисню або рн. Биосенсоры для декількох різних речовин вдається розмістити на одному кристалі. Лікар міг би ввести катетер з таким кристалом у вену хворого й здійснювати постійне спостереження хімічного складу крові або інших факторів власне кажучи в такий же спосіб, як це зараз робиться відносно частоти пульсу, тиску крові й функцій мозку.

У ТОЙ ЧАС як одні дослідники були зайняті мініатюризацією електронних биосенсоров, інші розробляли принципово нові системи, що базуються на оптичних сенсорах. Швидкий розвиток промисловості напівпровідників і засобів зв'язку привело до створення выcoкoэффeктивныx оптичecкиx световодов, пристроїв для переробки оптичних сигналів, інтегральних систем розщеплення пучків світла й хвильових фільтрів, мініатюрних монохроматичних джерел світла, таких як светоизлучающие діоди й твердотельные лазери. В 1969 р. Джеральд Г. Вурек і Роберт Бауман з Національних інститутів здоров'я продемонстрували один з перших оптоволоконных сенсорів для клінічних аналізів: колориметр, що вимірює зв'язування барвника" із бруньковими канальцами. Оптичні волокна можуть служити й станційними спектрофотометрами, що вимірюють спектри відбиття або поглинання в рідинах, флуориметрами, що реєструють вторинну емісію світла з певною довжиною хвилі, або турбидиметрами для виміру прозорості.

Є три основних типи оптоволоконных сенсорів. До першого ставляться пристрої, аналогічні електронним биосенсорам, що реєструють зміни не електричних, а оптичних властивостей речовини. До двох інших типів ставляться пристрої зі зникаючою хвилею й з поверхневим плазмоном, у яких використаються особливі властивості поширення світла по оптичних волокнах.

Оптичні сенсори першого типу включають осередок, оточений напівпроникною мембраною, реагенти, що розташовуються усередині мембрани або пов'язані з її внутрішньою поверхнею, световоды для висвітлення осередку, і детектори, що вимірюють зміну оптичних властивостей. У більшості випадків та сама оптична нитка служить і для висвітлення осередку, і для вловлювання минаючого або відбитого світла.
Перелік навчальної лiтератури

Костюк П.Г., Зима В.Л., Магура И.С., Мірошниченко М. С., Шуба М.Ф. Біофізика.- К., Обереги, 2001. 544 с.

Рубин А.Б. Биофизика.- М., Высшая школа, 2001. Кн. 1 и 2.

Медична і біологічна фізика, т.1-2/ Під ред. О.В. Чалого. – К. : 1999-2000.

Волькенштейн М.В. Биофизика – М., 1988.

Костюк П.Г., Гродзинский Д.Л., Зима В.Л. и др. Биофизика – Киев, 1988.

Фрайфелдер Физическая биохимия – М., 1987.

Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия – М., 1984.

Самолов В.О. Медицинская биофизика. – Л. : Изд-во ВМА, !986.

Чорна В.І., Недзвецький В.С. Лабораторний практикум із загального курсу біофізики. Дніпропетровськ, ДДУ, 1997. – 44 с.

Індивідуальні завдання

Пасивні електричні явища у біоструктурах
Міграція та трансформація енергії у фотоакцепторних системах.
Принципові схеми оптоволоконних біосенсорів.
Молекулярні компоненти специфічної ланки біосенсорів.