Методика проведения исследования клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Оглавление

Принцип метода.

Меры предосторожности.

Взятие и хранение образцов.

Обеззараживание.

Проведение анализа.

ЭТАП 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА.

Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для выделения (с указанием фирм-производителей / поставщиков)

Необходимые реактивы.

Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-АМ».

Порядок работы при использовании комплекта «ДНК-сорб-А».

ЭТАП 2. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР C ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ.

Дополнительные материалы и оборудование, требуемые для проведения ПЦР-анализа (с указанием фирм-производителей / поставщиков).

А. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP)

Б. Проведение ПЦР-амплификации с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» (при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT).

Учёт результатов.

А. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FEP.

А1. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «Джин».

А2. Учет результатов при использовании ПЦР-детектора «АЛА-1/4».

Б. Учет результатов при использовании наборов реагентов«АмплиСенс» вариант FRT.

Б1. Учет результатов при работе с прибором «Rotor-Gene 3000» или «RotorGene 6000».

Б2. Учет результатов при работе с прибором «iQ iCycler» («Bio-Rad», США)

Возможные ошибки при учете результатов, полученных при использовании прибора «IQ Icycler»
(модель 4) и меры по их устранению.

ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ВОЗБУДИТЕЛИ

Бактериальные инфекции:

· Chlamydia trachomatis

· Neisseria gonorrhoeae
· Mycoplasma genitalium
· Ureaplasma spp.
· U.parvum / U.urealyticum
· Mycoplasma hominis
· Gardnerella vaginalis
· Treponema pallidum

Вирусные инфекции - герпесвирусы:

· CMV
· HSV I, II

· HSV-typing

Грибковые инфекции:

· Candida albicans

Протозойные инфекции:

· Trichomonas vaginalis

 

ПРИНЦИП МЕТОДА

В предлагаемых наборов реагентовах для выявления ДНК возбудителя используется метод ПЦР-амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продукта реакции.

В основе гибридизационно-флуоресцентной (ГФ) детекции лежит принцип гибридизации флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате которой происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Присутствие такого зонда в реакционной смеси позволяет регистрировать накопление продуктов амплификации непосредственно в ходе полимеразной цепной реакции (детекция в режиме «реального времени», «Real-time PCR») или по ее окончании (детекция по «конечной точке», «End-point analysis») путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала. В обоих случаях детекция результатов ПЦР осуществляется без извлечения продуктов реакции из пробирок, что позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами ПЦР. Дополнительным преимуществом данной модификации метода ПЦР является возможность автоматизировать учет результатов анализа, снизить субъективизм в интерпретации результатов.

 

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Исследование разделяется на два этапа и проводится в двух помещениях (ЗОНАХ), согласно МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности».

В ЗОНЕ 1    проводится первичный разбор, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и выделение ДНК из клинического материала.

В ЗОНЕ 2    проводится подготовка пробирок для постановки ПЦР и проведение ПЦР и гибридизационно-флуоресцентной детекции.

 

Анализ результатов и введение готовых результатов в журнал проводится аккредитованным врачом-лаборантом.

1.      Необходимо строго соблюдать СП 1.2. 731–99 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами».

2.      Работать только в одноразовых перчатках, использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером. Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 0,2 %-ный раствор ДП-2Т.

3.      При работе с включенным трансиллюминатором пользоваться защитным экраном или специальной защитной маской.

4.      Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается переносить их из одного помещения в другое.

5.      Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать ультрафиолетовому облучению.

 

ВЗЯТИЕ И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ

Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (Москва, 2006 г.).

Для проведения анализа используется следующий клинический материал:

1. У женщин: соскобы (мазки) из цервикального канала, заднего свода влагалища, уретры, помещенные в 300 мкл транспортной среды, осадок клеток первой порции утренней мочи.

2. У мужчин – соскобы из уретры, помещенные в 300 мкл транспортной среды, осадок клеток первой порции утренней мочи, секрет предстательной железы – 300-500 мкл.

3. У детей – осадок клеток первой порции утренней мочи, мазок с конъюнктивы, помещенный в 300 мкл транспортной среды.

Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой-производителем наборов реагентов.

Хранить материал можно не более суток при температуре от 2 до 8 °С и в течение года при температуре не выше минус 68 °С (или ниже). Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Доставка проб осуществляется в специальном контейнере с охлаждающими элементами.

 

Для проведения исследования на наличие ДНК определенного микроорганизма анализируется следующий клинический материал:

· для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma spp., U.parvum / U.urealyticum, Mycoplasma hominis, Candida albicans и Gardnerella vaginalis - соскобы  (мазки) со слизистых оболочек урогенитального тракта, клеточный осадок мочи;

· для выявления ДНК Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae возможно также использовать мазки с конъюктивы, синовиальную жидкость;

· для выявления ДНК HSV I,II, HSV-typing - соскобы и мазки со слизистых оболочек урогенитального тракта, отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний);

· для выявления ДНК CMV - соскобы и мазки со слизистых оболочек урогенитального тракта, клеточный осадок мочи, слюна;

· для выявления ДНК Treponema pallidum – отделяемое (серозный экссудат) эрозивно-язвенных элементов, везикул, соскобы и мазки со слизистых оболочек урогенитального тракта.

При использовании секрета предстательной железы для анализа на наличие возбудителей ИППП (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis) для выделения ДНК рекомендуется использовать набор реагентов «ДНК-сорб-B».

следующая страница>