На правах рукописи
Складнева Евгения Юрьевна

Морфофункциональные особенности лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных в постнатальном онтогенезе, при уролитиазе и лимфотропной коррекции

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Красноярск – 2012

Работа выполнена на кафедре морфологии и физиологии животных Сельскохозяйственного института ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет имени Н.Ф. Катанова»

Научный консультант:	доктор ветеринарных наук, профессор Чумаков Виктор Юрьевич
Официальные оппоненты:	доктор ветеринарных наук, профессор Ильина Ольга Петровна
	доктор ветеринарных наук, профессор Дроздова Людмила Ивановна
	доктор ветеринарных наук, профессор Байматов Валерий Нурмухаметович
Ведущая организация:	ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина»

Защита диссертации состоится «21» марта 2012 г. в 10⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета ДМ 220.037.07 при ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» по адресу: 660049, г. Красноярск, проспект Мира, 90. тел/факс: 8(391) 227-36-09

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет»

Автореферат разослан «_____»________2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.Г. Турицына

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Внедрение в клиническую практику методов лимфокоррекции потребовало от специалистов глубокого изучения морфологии лимфатической системы в норме и при различных патологических процессах.

Кроме того, не менее важным является и поиск морфологических критериев целесообразности проведения прямой управляемой и непрямой (лимфотропной) эндолимфатической лекарственной терапии (Выренков Ю.Е., 1997, 2000, 2001; Алехина С.П. с соавт., 2003; Кучма С.Н., 2009). В связи с этим, в последние годы появился повышенный интерес исследователей к изучению функциональной морфологии лимфатического русла, как организменной системы, занимающей одно из центральных положений в развитии иммунологических реакций организма на внедрение генетически чужеродного материала (Сапин М.Р., Борзяк Э.И., 1982; Бородин Ю.И., Григорьев В.Н., 1986; Castenholtz А., 1990; Сапин М.Р., 1992, 1999; Бородин Ю.И. с соавт., 1990, 2008; Гаряева Н.А. с соавт., 2008; Райт Д., Эддис Б., Леонг Э., 2008; Петренко В.М., 2010).

Имеющиеся в отечественных и зарубежных литературных источниках сведения, касающиеся морфологии интраорганного лимфатического русла мочевыделительной системы домашних животных в постнатальном онтогенезе носят довольно фрагментарный характер и не дают полного представления о детальном строении лимфатического региона данного органа.

По сведениям И.М. Самородовой (2009), D.F. Senior (2009, 2011) уролитиаз является одной из самых частых причин обращения владельцев домашних кошек и собак в ветеринарные клиники. Кроме того, его принято относить к трудноизлечимым и периодически рецидивирующим патологиям.

Известно, что при мочекаменной болезни в мочевом пузыре развиваются патологические изменения, вызванные наличием инородных тел в полости мочевого пузыря и связанными с этим острым или хроническим воспалением, вторичным инфицированием и обструкцией мочевыводящих путей. В свою очередь, обструкция мочевыводящих путей приводит к чрезмерному переполнению и перерастяжению стенок мочевого пузыря, а также к ишемии и застойным явлениям как в кровеносном, ток и в лимфатическом руслах, что не может не повлиять на морфологию последнего. В настоящее время установлено, что лимфатическая система мочевыводящих путей, вместе с интерстициальной тканью является вторым звеном почечной реабсорбции (Кокорин В.В. с соавт., 2002; McGregor J.C. et al., 2007; Houdouin V. et al., 2007). Нарушение этой функции может значительно усугубить отечность и гипоксию тканей стенки мочевого пузыря при уролитиазе и в дальнейшем способствовать развитию склеротических изменений в стенке органа, что необходимо учитывать при проведении лечебных мероприятий. Несмотря на вышеизложенное, в отечественной и зарубежной литературе практически отсутствуют сведения о структурных и функциональных изменениях лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных при уролитиазе.

Одним из путей коррекции при воспалительных процессах органов мочевыделения является воздействие на функциональное состояние лимфатической системы, заключающееся в усилении ее дренажной функции и потенцировании барьерной функции регионарных лимфатических узлов (Макарова Т.П. с соавт., 2000; Кокорин В.В. с соавт., 2002; Алехина С.П. с соавт., 2003; Кучма С.Н., 2008), а также рациональная антимикробная терапия. Однако, в настоящее время, большинство ассоциативных групп микроорганизмов устойчивы к применяемым антибиотикам, что требует использования сочетаний лекарственных средств разных групп, использования препаратов широкого спектра действия, а также разработки новых нетрадиционных путей подведения их к патологическому очагу с учетом роли лимфатической системы в патогенезе болезни.

По сведениям И. Яремы и В. Евдокимова (2002), фармакокинетические исследования эндолимфатической терапии антибиотиками разных групп в эксперименте демонстрируют преимущества этого метода по сравнению с традиционными путями введения, в том числе с точки зрения нормализации иммунного статуса за счет снижения общей курсовой дозы антибиотиков, а также их положительного влияния на процессы первичного иммунного ответа в очаге воспаления. Одним из механизмов такого положительного влияния служит способность лимфоцитов удерживать на поверхности своей мембраны молекулы антибиотика и в процессе рециркуляции из лимфатического узла переносить его в зону воспалительного процесса.

К сожалению, несмотря на доказанную высокую эффективность и безопасность применения эндолимфатической и лимфотропной терапии в гуманитарной медицине, в ветеринарии они пока еще не нашли столь широкого применения. Вероятно, это связано с недостатком доступных и подробно описанных методик.

Цель исследования: изучить видовые и возрастные морфофункциональные особенности лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных в постнатальном онтогенезе, при спонтанном уролитиазе и в условиях лимфотропной коррекции.

Задачи исследования:

1. 
   Исследовать макро-, микро- и ультраструктуру интраорганного лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных на различных этапах постнатального онтогенеза;
   
2. 
   Изучить топографию и структуру экстраорганного лимфатического русла мочевыделительной системы домашних плотоядных в постнатальном онтогенезе;
   
3. 
   Определить возрастные и локальные изменения депонирующих свойств и структурных основ моторной функции лимфангионов лимфатических сосудов и капсулы регионарных лимфоузлов мочевого пузыря домашних плотоядных;
   
4. 
   Определить особенности морфологических изменений лимфатического русла мочевого пузыря происходящих при спонтанном уролитиазе с различными формами течения;
   
5. 
   Определить оптимальные, морфофункционально обоснованные зоны для выполнения лимфотропных инъекций и разработать методику лимфотропной терапии уролитиаза у домашних плотоядных;
   
6. 
   Выявить особенности течения уролитиаза у домашних плотоядных на фоне применения классической и разработанной нами лимфотропной терапии и описать морфофункциональные изменения лимфатического русла мочевого пузыря в результате ее применения.
   

Научная новизна. Впервые лимфатическое русло мочевого пузыря домашних плотоядных было изучено с позиции лимфангиона, как структурно-функциональной единицы лимфатических сосудов. Кроме того, выявлены видовые и возрастные особенности морфологии и топографии лимфатических сосудов и регионарных лимфатических узлов мочевого пузыря собак и кошек в условиях физиологической нормы и при различных формах и течении спонтанного уролитиаза. Впервые исследованы морфологические основы транспорта лимфы мочевого пузыря домашних плотоядных, изучена конструкция стенки лимфатических сосудов и соединительнотканной стромы регионарных лимфатических узлов в постнатальном онтогенезе, при уролитиазе и в условиях лимфотропной коррекции. Установлена взаимосвязь миоцитов лимфатических сосудов и капсулы лимфатических узлов, определены разнообразные варианты миоархитектоники всех частей лимфангиона. В работе приводятся подробное описание авторской методики лимфотропной антибиотикотерапии уролитиаза у домашних плотоядных и доказательства ее положительного влияния в составе комплексной терапии на течение уролитиаза и структурно-функциональное состояние мочевого пузыря и его лимфатического русла.

Новизна проведенных исследований подтверждена Патентом РФ на изобретение № 2342121 от 27.12.2008г. «Способ непрямой эндолимфатической антибиотикотерапии при уролитиазе у самцов домашних плотоядных» и положительным решением о выдаче патента РФ на изобретение «Способ лимфотропной антибиотикотерапии при воспалительных процессах органов мочевыделения у самок домашних плотоядных» от 30.05.2011.

Теоретическая и практическая значимость работы. Проделанная работа значительно дополняет, уточняет и обогащает имеющиеся данные о морфологии лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных в постнатальном онтогенезе, при уролитиазе и в условиях лимфотропной коррекции и дает возможность исследователям по-новому рассмотреть все физиологические процессы, происходящие в органах мочевыделения. Кроме того, полученные результаты позволяют расширить представления о путях распространения болезнетворных агентов из мочевого пузыря по организму собак и кошек, что должно помочь клиницистам, терапевтам и эпизоотологам в проведении диагностических и лечебных мероприятий.

Новейшие сведения о морфологии лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных в норме, постнатальном онтогенезе и при уролитиазе будут служить основой для разработки эффективных методов диагностики, терапии и профилактики мочекаменной болезни и сопутствующих осложнений.

На основании теоретических исследований были определены морфофункционально обоснованные зоны для выполнения лимфотропных инъекций при патологиях органов тазовой полости у домашних плотоядных, а также разработана методика лимфотропной антибиотикотерапии уролитиаза у домашних плотоядных. Внедрение разработанной методики лимфотропной терапии в ветеринарную практику позволит сократить затраты на медикаменты (как минимум в два раза), сократить сроки выздоровления животных, повысить эффективность лекарственных препаратов, а также значительно снизить их токсичность за счет сокращения разовой и суточной дозы и увеличения интервалов между введениями препаратов.

Материалы диссертационной работы легли в основу трех научно-практических рекомендаций: 1) «Лимфотропная терапия уролитиаза у домашних плотоядных», одобренных и принятых к внедрению ГНУ «Научно-исследовательский институт аграрных проблем Хакасии» СО Россельхозакадемии (протокол №7 от 30.05.2011г.); 2) «Терапия уролитиаза у домашних плотоядных», одобренных и принятых к внедрению ГНУ «Научно-исследовательский институт аграрных проблем Хакасии» СО Россельхозакадемии (протокол №7 от 30.05.2011г.); 3) «Использование препаратов традиционной китайской медицины в лечении и профилактике уролитиаза у домашних плотоядных» одобренных и принятых к внедрению управлением государственной ветеринарной инспекции Республики Хакасия (протокол №2 от 3.11.12.2009г.).

Результаты исследований используются в практической работе Абаканских, Усть-Абаканских, Черногорских и Минусинских ветеринарных станций и клиник, ГКУ РХ «Хакасская ветеринарная лаборатория», ГКУ РХ «Центр живой природы», кинологических служб МВД и УФСИН РФ по Республике Хакасия и Красноярскому краю, кинологического отдела Хакасской таможни, питомника служебного собаководства «Аргус» ООО АПК «Мавр», Хакасских республиканских кинологических и фелинологических клубов, научных исследованиях ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии Сибирского отделения РАМН, а также в учебном процессе и научных исследованиях Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина, Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана, Санкт-Петербургской и Уральской государственных академий ветеринарной медицины; Нижегородской, Уральской и Вятской государственных сельскохозяйственных академий; Омского, Красноярского, Гродненского, Кубанского и Дальневосточного государственных аграрных университетов, Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р. Филиппова, Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева, Национальном университете биоресурсов и природопользования Украины «Крымский агротехнологический университет».

Диссертация выполнена в рамках плановых научных работ кафедры морфологии и физиологии животных Хакасского государственного университета имени Н.Ф. Катанова (№ государственной регистрации 01.9.80.007521).

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. 
   Морфофункциональные особенности структурных элементов интра- и экстраорганного лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных в постнатальном онтогенезе;
   
2. 
   Локальные и возрастные изменения депонирующих и структурных основ моторных свойств лимфангионов и капсулы лимфатических узлов мочевого пузыря домашних плотоядных;
   
3. 
   Структурно-функциональные особенности лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных при спонтанном уролитиазе с острой и хронической обструкцией уретры;
   
4. 
   Лимфотропная терапия уролитиаза у домашних плотоядных и клинико-морфологическое обоснование ее эффективности в сравнении с традиционным лечением.
   

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены: на ежегодных научно-практических конференциях "Катановские чтения" (Абакан, 2004-2010), международных электронных научных конференциях «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (2004), «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (2004), «Технологии 2007» (2007), «Новые медицинские технологии» (2007), «Медицинские технологии» (2008), «Клинико-эпидемиологические проблемы ревматологии, гастроэнтерологии, кардиологии, нефрологии, неврологии и инфектологии» (2008), II международной научно-практической конференции «Современные научные достижения – 2007» (Днепропетровск, 2007), международной конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной биологии» (Новосибирск, 2008), международной научно-практической конференции «Проблемы развития АПК Саяно-Алтая» (Абакан, 2008), III международной конференции «Вопросы интеграции традиционной китайской и европейской медицины в России» (Новосибирск, 2010), V международной электронной научно-практической конференции «Наука и современность – 2010», Республиканском молодежном конвенте Инновационная Хакасия» (Абакан, 2010), XIV международной конференции «Экология Южной Сибири и сопредельных территорий» (Абакан, 2010, 2011), II виртуальной 3D конференции "Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных" (Казань, 2011), Всероссийской научно-практической конференции «Современные тенденции и перспективы развития агропромышленного комплекса Сибири» (Абакан, 2011).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 50 научных работ, в том числе 14 – в ведущих научных журналах и изданиях, перечень которых утвержден Высшей аттестационной комиссией РФ, 2 монографии, 3 научно-методических рекомендации, получен патент на изобретение «Способ непрямой эндолимфатической антибиотикотерапии при уролитиазе у самцов домашних плотоядных», а также положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение «Способ лимфотропной антибиотикотерапии при воспалительных процессах органов мочевыделения у самок домашних плотоядных».

Личный вклад. Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В проведении исследований с использованием электронной микроскопии практическую и консультационную помощь оказывали сотрудники лаборатории ультраструктурных исследований НИИКЭЛ СО РАМН доктор биологических наук, профессор Бгатова Н.П. и младший научный сотрудник кандидат биологических наук Скуридина Е.Г.

Объем и структура диссертации. Работа включает введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, библиографический список и приложения. Диссертация изложена на 350 страницах компьютерного набора, содержит 53 таблицы, 169 рисунков (в том числе 141 макро- и микрофотографии и 25 диаграмм). Список литературы включает 431 работу, в том числе 109 на иностранных языках.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнялась на кафедре морфологии и физиологии Сельскохозяйственного института ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет имени Н.Ф. Катанова, а также на базе ветеринарных клиник города Абакана республики Хакасия.

Исследования состояли из трех основных этапов:

- исследование лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных в постнатальном онтогенезе;

- анализ клинических проявлений и морфологических изменений лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных при спонтанном уролитиазе;

- выявление особенностей течения и структурных изменений лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных в условиях лимфотропной терапии и традиционной медикаментозной коррекции.

В соответствии с поставленными задачами на всех этапах работы проводились комплексные морфологические исследования, а в условиях спонтанного уролитиаза и его коррекции еще и клинические, ультразвуковые и лабораторные исследования.

С целью изучения структурных особенностей лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных в постнатальном онтогенезе, исследования проводились на аутопсийном и биопсийном материале, полученном от здоровых беспородных собак и кошек обоего пола. Живая масса взрослых кошек составляла 3-5 кг, взрослых собак – 5-10 кг.

Лимфатическое русло мочевого пузыря собак в постнатальном онтогенезе изучалось на 272 животных пяти возрастных групп: новорожденные (1-7 дней), периодов отъема (1-2 мес.), полового созревания (6-8 мес), физиологической зрелости (2-6 лет), выраженных старческих изменений (8-13 лет) в соответствии с классификацией, предложенной С.И Архангельским (1965). Возраст животных определяли со слов владельцев и уточняли по зубной формуле (Белов А.Д. с соавт., 1990).

Особенности лимфатического русла мочевого пузыря кошек в постнатальном онтогенезе изучались на 300 животных пяти возрастных групп: новорожденные (1-3 дня), периодов отъема (1-1,5 мес.), полового созревания (6-8 мес.), функциональной зрелости (1,5-6 лет), и выраженных старческих изменений (старше 9 лет). Классификация возрастных периодов кошек производилась согласно методике, предложенной рядом авторов: А.С. Батуев (1983); С.А. Козей (1984); О.Б. Башлак (1994); Н.Н. Тятенкова (1998); Г.П. Дюльгер (2004).

Клинический статус и морфологические изменения лимфатического русла мочевого пузыря домашних плотоядных при спонтанном уролитиазе изучались нами на животных 6 групп (205 собак и 294 кошки): 1) собаки и кошки на первые сутки острой задержки мочи при уролитиазе с полной обструкцией уретры; 2) домашние плотоядные с уролитиазом на вторые сутки острой задержки мочи; 3) собаки и кошки на третьи сутки острой задержки мочи при уролитиазе с полной обструкцией уретры; 4) собаки и кошки на четвертые сутки острой задержки мочи при уролитиазе с полной обструкцией уретры; 5) домашние плотоядные с уролитиазом, сопровождающимся хроническим циститом; 6) собаки и кошки с длительно протекающим уролитиазом, сопровождающимся цистопатией.

Для изучения особенностей течения уролитиаза у домашних плотоядных на фоне применения классической и лимфотропной антибактериальной терапии по принципу аналогов отобрали 192 беспородных нестерильных самца домашних плотоядных (96 кобелей и 96 котов) в возрасте от 2 до 6 лет (среднего возраста). Живая масса котов составляла 3-6 кг, вес собак колебался на уровне 5-10 кг. У всех животных был диагностирован струвитный уролитиаз с интравезикальной локализацией многочисленных мелких конкрементов с размерами не превышающими 3 мм у котов и 6 мм у кобелей и хронический цистит в стадию обострения. Диагноз был поставлен на основании анамнеза, результатов клинического исследования, лабораторных исследований мочи и крови и результатов ультразвукового и рентгенологического исследования.

Для выявления эффективности разрабатываемой методики лимфотротпной антибиотикотерапии уролитиаза за животными всех групп проводились ежедневные клинические наблюдения, а также ультразвуковое исследование органов брюшной полости, клинический и биохимический анализ крови и мочи по общепринятым методикам при поступлении, на 3-и, 5-е, 7-е, 10-е, 14-е и 30-е сутки. Кроме того, после проведения терапии в течение 12 месяцев проводились регулярные клинические осмотры и обследования всех участвующих в эксперименте животных на наличие рецидивов. Некоторым пациентам на 5-е, 14-е и 30-е сутки выполнили лапаратомию и биопсию стенки мочевого пузыря для проведения морфологических исследований.

С момента поступления на лечение, животных всех групп переводили на стандартные готовые рационы Hills Prescription Diet Canin s/d (для собак) и Feline s/d (для кошек) и поение кипяченой водой вволю. Владельцам собак опытной и контрольной группы было рекомендовано не менее чем трехразовое выгуливание их питомцев.

Животных опытных групп лечили с применением авторской методики лимфотропной антибиотикотерапии. Собакам и кошкам контрольных групп антибиотик вводился внутримышечно в стандартной дозировке и с обычной кратностью.

Антимикробную терапию во всех случаях дополняли симптоматическим лечением, заключающемся в проведении дезинтоксикационной терапии, назначении спазмолитиков, катетеризации мочевого пузыря и ежедневных инстилляций в его полость 0,5% раствора имозимазы (урофера) в качестве литолитического компонента.

Архитектонику лимфатического русла мочевого пузыря собак и кошек изучали после его визуализации методом внутритканевой (интерстициальной) инъекции видоизмененной синей массой Герота (Gerota D., 1896), сажей газовой, 0,5% раствором метиленовой сини и 50% раствором черной и синей туши.

Препарирование производили при помощи глазных скальпелей, ножниц, хирургических и анатомических пинцетов, препаровальных игл. Микропрепарирование проводилось под бинокулярной лупой "МБС-2".

Для выявления архитектоники мелких лимфатических сосудов и капиллярного лимфатического русла, а также выяснения взаимоотношений между лимфатическими и кровеносными капиллярами и сосудами в мочевом пузыре пользовались методом просветления стенки органа по упрощенным методикам по В.Ю.Чумакову (2003), Т.С. Сетекову, С.А. Абдыкеримову и Р.К. Садырову (1988). При исследовании просветленных препаратов обращали внимание на форму и размер лимфатических капилляров и их петель. Все измерения производились при помощи окуляр-микрометра МОВ-1-15× на микроскопе МБИ-15.

Гистологический материал заливался в парафиновые блоки по методикам, описанным в руководствах Б. Ромейс (1954), В.Г. Елисеевым с соавт. (1967), Г.А. Меркуловым (1969), О.В. Волковой и Ю.К. Елецким (1982).

Из полученных блоков готовились продольные, поперечные и тангенциальные срезы толщиной от 3 до 7 мкм на микротоме «МЗП-01 ТЕХНОМ». Готовые срезы окрашивались пикрофуксином по Ван-Гизон, гематоксилином по Верхгофу, гематоксилин-эозином, орсеином по методу Унны-Тенцера, азаном по Гейденгайну и импрегнировались серебром.

Полученные гистологические препараты изучались под световым микроскопом Micros MC 300.

При макроморфометрическом исследовании лимфатических узлов производились вычисления отношения коркового вещества к мозговому (индекс К/М – по Ю.И. Бородину, 1969) и отношения площади мякотных тяжей к площади мозговых синусов (индекс МТ/МС).

Для детального изучения архитектоники, гистотопографии и количества гладкомышечных и соединительнотканных элементов стенки лимфангионов интра- и экстраорганных лимфатических сосудов и капсулы регионарных лимфоузлов из них изготавливались окрашенные галлоцианином и орсеином тотальные препараты при помощи безинъекционной методики, предложенной А.В. Борисовым (1973). На полученных препаратах определяли ориентацию миоцитов и производили подсчет их количества с помощью окулярной сетки С.Б. Стефанова (1974) в поле зрения микроскопа при окуляре 7 и объективе 40.

Для электронномикроскопического исследования отбирались кусочки лимфатических сосудов, узлов и слизистой оболочки мочевого пузыря собак и кошек размером 1х1мм, сразу после эвтаназии животного, а также биопсийный материал, полученный во время хирургических операций. Непосредственно после забора материал фиксировался в 1% растворе четырехокиси осмия на фосфатном буфере с добавлением 4,5% сахарозы (рН=7,2), дегидрировался в этиловых спиртах возрастающей концентрации и заключался в эпон. После этого на ультрамикротоме LKB-8800 получали полутонкие (толщина 1мкм) и ультратонкие (толщина 35-45нм) срезы. Полутонкие срезы окрашивали толлуидиновым синим, заключали в полистерол и изучали под световым микроскопом. Ультратонкие срезы контрастировали в насыщенном водном растворе уранилацетата, окрашивали цитратом свинца по Рейнолдсу и изучали в электронном микроскопе JOEL-1010 при ускоряющем напряжении 100кВ.

Данные, полученные при исследовании, заносились в документы первичного учета, зарисовывались и фотографировались фотоаппаратом «Nikon Coolpix P100». Микрообъекты фотографировались с помощью микрофотонасадки «МФН 12».

Название анатомических и гистологических структур и образований приведены в соответствии с 4-й редакцией Международной ветеринарной анатомической номенклатуры (Зеленевский Н.В., 2003) и 3-й редакцией Международной гистологической номенклатуры (Семченко В.В., Самусев Р.П., 1999).

Клинический осмотр включал термометрию, определение общего состояния, наличия и степени интоксикации и обезвоживания, пальпацию области почек и мочевого пузыря для определения их величины, степени наполнения и болезненности, осмотр наружных половых органов, степени их развития.

С помощью ультразвукового исследования устанавливали факт наличия, размеры, количество, характер и локализацию конкрементов, а также степень структурного поражения органов брюшной и тазовой полостей. Для ультразвукового исследования органов мочевыделения использовали ультразвуковой сканер Mindray DP-1100Plus с электронным конвексным датчиком 35C50EB с частотой 2.0/3.5/6.0МГц. Исследования выполнялись согласно методикам, изложенным в руководствах Ф. Барра (2006), В. Иванова (2007), П. Манниона (2008), Е.В. Бушаровой (2008) и С.Ф. Мелешкова (2002, 2003, 2007-2009).

Рентгенологическое исследование органов мочевыделения проводили по стандартным методикам, изложенным в руководствах М. Хан Конни, Д. Херд Черил (2006) с учетом рекомендаций Г.А. Зедгенидзе, В.А. Куликова, Ю.С. Мардынского (1984) и Д. Чью, Т. Баффингтона, П. Бартеса (1999) рентгеновским аппаратом SY-HF-110 с рентгеновской трубкой компании TOSHIBA.

Полученные сведения о размерах, количестве и локализации конкрементов использовались при выборе метода лечения (консервативный или оперативный), а также для выбора оптимального операционного доступа при хирургическом вмешательстве.

Лабораторные исследования морфологического и биохимического состава крови выполнялись согласно общепринятым в клинической практике методикам, изложенным в руководствах В.Е. Предтеченского (1964), М. Уилларда с соавт. (2004), М.А. Медведевой (2009) с учетом рекомендаций Е. Бажибиной и А. Коробова (2004).

Среди параметров учитывали количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, содержание гемоглобина в периферической крови, скорость оседания эритроцитов, выводили лейкограмму.

Для биохимических исследований из цельной крови без добавления стабилизаторов и консервантов получали сыворотку и исследовали на полуавтоматическом биохимическом анализаторе-полуавтомате BioChem SA.

В сыворотке крови определяли содержание общего белка, мочевины, креатинина, кальция, фосфора и магния.

Лабораторные исследования мочи проводили согласно общепринятым методикам, изложенным в руководствах Л.А. Даниловой (2003), М. Уилларда с соавт. (2004) и С.В. Середы с соавт. (2009).

При исследовании мочи определяли ее макроскопичиеские показатели (цвет, прозрачность, запах), удельный вес, проводили химический анализ и микроскопию осадка центрифугированной мочи для выявления и дифференциации кристаллов, эритроцитов, лейкоцитов, цилиндров, эпителиоцитов, бактерий, грибов и др.

Анализ физико-химических свойств мочи осуществлялся на полуавтоматическом переносном уриноанализаторе CL-50 с помощью специализированных тест-полосок UrineRS H10 и включал в себя определение содержания в ней глюкозы, билирубина, кетонов, удельного веса, скрытой крови, pH, белка, уробилиногена, нитритов и лейкоцитов.

Общий анализ мочи дополняли микроскопией осадка, полученного при центрифугировании. При микроскопии нативных препаратов, полученных из осадка мочи определяли наличие, количество, размеры и вид эпителиальных клеток, цилиндров, кристаллов, лейкоцитов, эритроцитов.

Для дифферециальной диагностики выявленных в осадке мочевых кристаллов проводили микрохимический анализ осадка по методикам В.Я. Краевского (1976).

Для выявления в моче микроорганизмов мазки из центрифугата мочи высушивали и окрашивали по методу Романовского-Гимзе и просматривали под иммерсией при увеличении 10×90.

Математико-статистический анализ проводили в соответствии с правилами получения репрезентативных выборок генеральных совокупностей для биологических объектов (Автандилов Г.Г., Яблучанский Н.И., Губенко В.Г., 1981; Автандилов Г.Г., 1990; Лакин Г.Ф., 1990). Все расчеты были выполнены при помощи персонального компьютера с использованием пакета прикладных программ электронной таблицы Microsoft Excel 7,0 и Statistica 6. Для каждого показателя вычисляли среднее арифметическое и его ошибку. Достоверность отличий оценивали по t–критерию Стьюдента. Различие считали достоверным при вероятности 95% (Р<0,05).