Морфологические закономерности дегенерации и адаптации сетчатки глаз при экспериментальных ретинопатиях, коррекция биофлавоноидами 03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология

На правах рукописи

Варакута Елена Юрьевна

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ДЕГЕНЕРАЦИИ И АДАПТАЦИИ СЕТЧАТКИ ГЛАЗ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РЕТИНОПАТИЯХ, КОРРЕКЦИЯ БИОФЛАВОНОИДАМИ

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Томск – 2008
Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Логвинов Сергей Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Семченко Валерий Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Суходоло Ирина Владимировна

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Дыгай Александр Михайлович
Ведущая организация ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Защита диссертации состоится "__"____________2008 г. в "__" час на заседании диссертационого совета Д 208.096.03 при ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2

С диссертацией можно ознакомиться в научно - медицинской библиотеке ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава

Автореферат разослан "___"_____________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Герасимов А.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ. Проблема комбинированного действия факторов среды на организм человека является одной из ключевых в биологии, медицине и экологии. Организм всегда находится под прессом действия комплекса факторов и зачастую трудно оценить приоритетность того или иного фактора в возникновении патологии [Ушаков И.Б., 2003]. Однако в настоящее время практически отсутствуют адекватные модели взаимодействия факторов, которые помимо теоретического, имели бы практическое значение для человека, что и послужило поводом для создания модели комбинированного влияния света и экспериментального сахарного диабета на сетчатку глаз.

Поражение органа зрения при сахарном диабете является актуальной проблемой в связи с ростом частоты диабетической ретинопатии, которая в настоящее время стала ведущей причиной необратимой слепоты [Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., 2000; Галстян Г.Р., 2002; Ei-Remessi A.B. et al., 2006]. Морфофункциональные изменения при стойкой гипергликемии касаются практически всех звеньев зрительного анализатора, однако, поражение сетчатки является основной причиной потери зрения [Можеренков В.П., Калинин А.П., 1991; Жабоедов Г.Д. и др., 2000; Нестеров А.П., 2000]. Начальные проявления диабетической ретинопатии возникают уже на ранних стадиях сахарного диабета, что подтверждается электронно-микроскопическими исследованиями базальной мембраны капилляров сетчатки [Anderson H.R. et al., 1995; Ljubimow A.W. et al., 1996; Li Q. et.al., 2002]. Экспериментально показано, что изменения касаются в большей степени сосудов микроциркуляторного русла сетчатки и характеризуются нарушениями гемодинамики, а также повреждением сосудистой оболочки глаз [Qaum T., Xu Q., Joussen A.M. et al., 2001; Cheung A.K.H., Fung M.K.L. Lo A.C.Y. et al., 2005; El-Remessy A.B., Al-Shabrawey M., Khalifa Y., 2006]. Также в некоторой степени страдают радиальные глиоциты, ассоциативные и ганглионарные нейроны сетчатки [Bensaoula T., Ottlecz A., 2001; Li Q. et al., 2002; Martin P.M. et al., 2004].

В литературе накоплено большое количество сообщений о повреждающем действии света на сетчатку глаз человека и животных. Как в клинике, так и на производстве нередки ситуации с потенциальной возможностью возникновения и развития фотодегенерации [Michels M. et al., 1990; Arafat A.F. et al., 1994; Bradham M.S. et al., 1995]. Имеются данные о появлении дегенеративных изменений на глазном дне у пациентов, слишком часто подвергавшихся офтальмоскопированию, нарушении сетчатки после глазных операций. [Bradham M.S. et al., 1995; Kohnen S., 2000; Kleinmann G., et al., 2002; Michael R., Wegener A., 2004; Dawson D.G. et al., 2005]. В эксперименте на белых крысах воздействие света высокой интенсивности вызывает деструктивные изменения всех элементов сетчатки глаза. Наблюдаются также гемодинамические расстройства, ультраструктурные нарушения эндотелиоцитов, базальной мембраны капилляров, что приводит к нарушению целостности гематоретинального барьера [Логвинов С.В. и др. 2003; Потапов А.В., 2006].

Общим в патогенезе диабетической ретинопатии и фотодегенерации сетчатки является нарушение микроциркуляции, а также индукция свободнорадикальных окислительных процессов [Островский М.А., 1994; Wolff S.P. et al., 1991; Baynes J.W., 1991; Kashiwagi A., Kikkawa R., 1991].

С точки зрения коррекции возможных нарушений сетчатки при указанных воздействиях вызывают интерес флавоноиды растительного происхождения. Это связано в первую очередь с выраженными антиоксидантными свойствами биофлавоноидов [Петров В.К. и др. 1996; Хазанов В.А. и др. 1999; Кондакова Н.В. и др., 1997; Теселкин Ю.О., 2003]. В Томском НИИ фармакологии СО РАМН предложены препараты: асковертин - смесь диквертина с аскорбиновой кислотой (патент РФ № 2150282, приоритет от 06.11.1998 г.) и каровертин – смесь диквертина, аскорбиновой кислоты и бета-каротина. Диквертин (дигидрокверцетин, таксифолин, 3,3,3,4,5,7-пентагидроксифлавон) относится к флавоноидам растительного происхождения [Плотников М.Б. и др., 1999; Плотников М.Б. и др. 2005]. В литературе имеются сведения о выраженных церебропротекторных свойствах асковертина. Он обладает антиоксидантным и атигипоксическим действием, влияет на тонус сосудов, нормализует мозговую гемодинамику, улучшает реологические свойства крови [Плотников М.Б. и др., 2005]. Имеются сведения, что флавоноиды диквертин и танакан повышают активность ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы и каталазы, тем самым, способствуя замедлению прогрессирования пролиферативной диабетической ретинопатии и улучшению электрофизиологических показателей сетчатки [Балаболкин М.И. и др., 2003]. Известно также, что витамин С способен усиливать антиоксидантные свойства флавоноидов, в частности, диквертина [Middleton E., Kandaswami C., 1992; Бобырева Л.Е., 1998; Плотников М.Б. и др., 2005]. Указанные свойства препаратов дают основание предполагать о возможности их использования для патогенетической коррекции фотоповреждения сетчатки на фоне аллоксанового диабета. Вместе с тем в доступной литературе отсутствуют сведения о модифицирующем влиянии данных биофлавоноидов на структурные изменения сетчатки глаза при экспериментальных ретинопатиях.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить закономерности дегенерации и адаптации клеточно-тканевых элементов сетчатки глаз при экспериментальных ретинопатиях, индуцированных воздействием света различной интенсивности и продолжительности, а также в комбинации с аллоксановым диабетом. Установить характер влияния асковертина и каровертина на морфофункциональное состояние компонентов сетчатки белых крыс при указанных воздействиях, а также сравнить возможные ретинопротекторные свойства данных препаратов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Создать модели ретинопатий посредством светового воздействия различной интенсивности и продолжительности, а также освещения в комбинации с аллоксановым диабетом на сетчатку глаз. Изучить вклад каждого фактора и их взаимодействие с целью выявления общих закономерностей повреждения и репарации тканевых компонентов сетчатки глаз.
Установить характер и динамику изменений нейрональной популяции и глиальных элементов сетчатки, а также глионейрональные взаимоотношения при фотоповреждении на фоне гипергликемии с использованием методов математического моделирования.
Изучить в динамике ультраструктурные изменения синаптоархитектоники сетчатки при воздействии указанных факторов.
Исследовать сосудистые реакции сетчатки и ультраструктуру гематоретинального барьера при фотоповреждении на фоне гипергликемии.
Определить последовательность и взаимосвязь клеточных реакций для выяснения их роли в тканевых механизмах дегенерации и адаптации при воздействии высоко- и низкоинтенсивного света на фоне гипергликемии.
Выявить модифицирующее влияние биофлавоноидов: асковертина и каровертина на сетчатку при воздействии указанных факторов и сравнить возможные ретинопротекторные эффекты препаратов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. С помощью гистологических, электронномикроскопических и морфометрических методов впервые обнаружено, что при световом воздействии и освещении на фоне гипергликемии выраженность деструкции сетчатки в большей степени зависит от интенсивности освещения, а не от его продолжительности. При высокоинтенсивном световом воздействии и освещении на фоне гипергликемии в динамике на 7-е сут появляются очаговые изменения сетчатки. Выявлено, что наиболее поражаемыми структурами при указанных воздействиях являются нейросенсорные клетки (НСК) и пигментный эпителий (ПЭ). Изменения нейрональной популяции сетчатки при высокоинтенсивном световом воздействии и освещении на фоне гипергликемии характеризуются деструкцией закономерно убывающей в следующей последовательности: нейросенсорные клетки - ассоциативные нейроны - ганглионарные нейроны. Относительная сохранность ганглионарных нейронов, возможно, связана с высокой активностью в них белка bcl-2, в несколько раз превышающая активность гена p-53, что было выявлено при иммуногистохимическом исследовании сетчаток. В популяции ассоциативных нейронов наиболее подвержены деструкции амакринные нейроны, минимальной чувствительностью к повреждающим факторам обладают горизонтальные нейроны. По результатам исследования удельной площади органелл в биполярных и ганглионарных нейронах показана наибольшая чувствительность гранулярной эндоплазматической сети (ЭПС) и митохондрий, что лежит в основе хроматолитических изменений различной выраженности. Межнейрональные связи также высокочувствительны к световому воздействию. Обнаружено, что наибольшей деструкции подвержены синапсы наружного сетчатого слоя, а в очагах деструкции нейросенсорных клеток (при освещении 6000 лк) этот слой полностью отсутствует, и тела ассоциативных нейронов смещаются к наружной глиальной пограничной мембране. Во внутреннем сетчатом слое отмечается снижение общей численной плотности синапсов преимущественно за счет асимметричных контактов. Изменения синаптического пула сетчатки после длительного низкоинтенсивного светового воздействия на фоне гипергликемии и без нее имеет адаптивный характер, выражающийся сохранением общей численной плотности синапсов после 7 сут. светового воздействия. Однако имеет место и деструктивный эффект, характеризующийся снижением количества активно функционирующих искривленных контактов, и сохранность более статичных плоских синапсов. После освещения в течение 30 сут. наблюдается срыв адаптации, характеризующийся снижением численной плотности синапсов по сравнению с данными после 7 сут. светового воздействия. В механизмах репарации синаптического пула сетчатки после указанных воздействий ведущую роль играют процессы неосинаптогенеза и созревание контактов ювенильного типа. Реакция глиальных элементов сетчатки на воздействие повреждающих факторов неодназначна и характеризуется как регрессивными, так и прогрессивно-пролиферативными изменениями. Установлена роль радиальных глиоцитов в изоляции деструктивных элементов от неизмененной ткани посредством образования многослойных глиальных пластин. Пустоты, появившиеся вследствие гибели нейронов, также заполнены пролиферирующими глиальными отростками. Выраженность изменений компонентов гематоретинального барьера неодинакова и убывает в ряду: пигментоэпителиоциты - хориокапилляры - базальный комплекс.

Установлено, что курсовое введение биофлавоноидов асковертина и каровертина приводит к уменьшению очагов поражения, что связано с ростом удельной площади открытых сосудов, увеличением функциональной активности пигментного эпителия, большей сохранностью нейросенсорных клеток в обеих экспериментальных группах благодаря выраженным антиоксидантным и гемореологическим свойствам перпаратов. Выявлено, что данные антиоксиданты улучшают глионейральные и межнейрональные взаимодействия, способствуя снижению деструкции и увеличению регенераторного потенциала радиальной глии, повышая устойчивость нейронов внутренних слоев сетчатки и их синаптические контакты к повреждению. Показано, что наибольший ретинопротекторный эффект отмечен при однократном высокоинтенсивном воздействии, нежели при длительном непрерывном низкоинтенсивном освещении.

Впервые разработана математическая модель, позволяющая оценить изменения клеточных элементов сетчатки при воздействии высоко- и низкоинтенсивного света в комбинации с аллоксановым диабетом в любой момент времени на протяжении эксперимента, а также прогнозировать эти изменения по временному критерию.

Практическая значимость работы. Получены новые знания о закономерностях морфофункциональных изменений структурных компонентов сетчатки при световом воздействии, освещении на фоне аллоксанового диабета и коррекции биофлавоноидами асковертин и каровертин. Данные об усилении альтерации при воздействии света на фоне диабета могут быть использованы для разработки гигиенических стандартов при проведении офтальмологического обследования больных с диабетической ретинопатией. Представленные в диссертации данные о протективном эффекте препаратов на сетчатку глаза при воздействии света на фоне аллоксанового диабета могут быть использованы для разработки новых подходов профилактики и патогенетического лечения одного из осложнений сахарного диабета - ретинопатии.

Материалы работы используются в учебном процессе при чтении лекций на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии Сибирского государственного медицинского университета по разделу “Органы чувств”.

Работа выполнена в соответствии с планом проблемной комиссии Межведомственного научного совета при Президиуме РАМН “Структурно-функциональные основы организации мозга в норме и патологии”.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

Наиболее выраженную дегенерацию сетчатки вызывает кратковременное высокоинтенсивное световое воздействие на фоне экспериментального сахарного диабета. Данный эффект характеризуется очаговой гибелью НСК и ПЭ. В поздние сроки отмечаются процессы адаптации, характеризующиеся репарацией наружных отростков сохранившихся НСК и фагоцитозом деструктивно измененных фоторецепторов. Препараты асковертин и каровертин увеличивают сохранность НСК, приводя к снижению площади очагов поражения.
Нейроны внутренних слоев сетчатки менее чувствительны к указанным воздействиям по сравнению с НСК. При высокоинтенсивном освещении наиболее поражаемы амакринные нейроны, а наименее - горизонтальные. При длительном низкоинтенсивном световом воздействии изменения ассоциативных нейронов имеют обратимый характер и проявляются только на ультраструктурном уровне. Введение препаратов защищает мембранные структуры нейронов и улучшает межнейрональные взаимодействия.
Деструкция радиальной глии вносит значительный вклад в дегенерацию нейронной популяции сетчатки, а ее пролиферативная активность приводит к изоляции очагов деструкции от неизмененных тканей, что является отражением адаптации. Введение препаратов снижает деструкцию радиальной глии, препятствуя развитию вторичных альтеративных изменений.
Повреждение сосудов сетчатки и хориоидеи при воздействии указанных факторов, наряду с очаговой деструкцией ПЭ приводит к прорыву гематоретинального барьера, а при освещении (6000 лк) развитию неоангиогенеза. Введение препаратов предупреждает деструкцию компонентов сосудистой стенки, улучшает состояние гемореологии и вносит вклад в уменьшение площади очагов поражения.

АПРОБАЦИЯ. Материалы диссертации доложены на VII Международном конгрессе ассоциации морфологов (Казань, 2004); на научном совещании гистологов на тему “Актуальные проблемы учения о тканях” (Санкт-Петербург, 2006); V съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2006); VIII Международном конгрессе ассоциации морфологов (Орел, 2006); на конференции посвященной 100-летию со дня рождения проф. И.С. Кудрина (Тверь, 2006); на Всероссийской конференции с международным участием "Структурно-функциональные и ней-

рохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга (Москва, 2006; 2007); VII международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2007).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликована 30 работ, из них 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа изложена на 385 страницах, иллюстрирована 8 таблицами, 175 рисунками. Библиографический указатель включает 604 источников из них 177 на русском и 427 на иностранном языках.

СОБСТВЕННЫЕ НАБЛЮДЕНИЯ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 310-ти беспородных белых крысах самцах с первоначальной массой 150-180 г, полученных из вивария СибГМУ.

До начала эксперимента крыс выдерживали на протяжении двухнедельного карантинного срока в условиях вивария с учетом традиционных требований к содержанию экспериментальных животных на обычном пищевом рационе. Для исключения влияния сезонных колебаний эксперимент проводился в осеннее-зимний период. Начало экспериментальных воздействий, и взятие материала осуществляли в одно и тоже время суток – в 10-12 часов с учетом известных вариаций зрительных структур. Животных содержали в стандартных условиях вивария при световом режиме 12 часов день, 12 часов ночь с искусственным дневным освещением низкой интенсивности 20 лк.

При проведении экспериментов животных помещали в специально сконструированную установку из прямоугольных рефлекторов с вмонтированными в них лампами, освещающих клетку с 5-и сторон. В ней производилось тотальное кратковременное высокоинтенсивное (6000 лк) и длительное низкоинтенсивное (200 лк) освещение люминесцентными лампами ЛБ-40 с максимумом излучения в желто-зеленой области спектра. Перед освещением проводили атропинизацию и дикаинизацию глаз животных. Дозиметрический контроль освещенности осуществляли с помощью люксметра.

Сахарный диабет моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана в дозе 15 мг/100 г. Критерием тяжести заболевания служили уровень гипергликемии, потеря массы тела, выраженность полиурии. Содержание сахара в крови определяли глюкозооксидазным методом с помощью набора “Новоглюк” (г. Новосибирск) 1 раз в неделю. Средний уровень сахара на 7-е сут после введения аллоксана составил – 20,1 ммоль/л (контроль 5-7 ммоль/л).

В качестве предполагаемых ретинопротекторов использовали препараты "Асковертин" - (патент РФ № 2150282, приоритет от 06.11.1998г.) и «Каровертин» - (регистрационное удостоверение МЗ РФ № 003406.Р.643.10.2001), разработанные в НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН коллективом авторов: М.Б. Плотников, О.И. Алиев, М.Ю. Маслов и др. Асковертин вводили в дозе 70 мг/кг (20 мг/кг - диквертина, 50 мг/кг аскорбиновой кислоты, а каровертин - из расчета 10 мг/кг дигидрокверцетина, 50 мг/кг аскорбиновой кислоты и 1 мг/кг -каротина в 1% крахмальной слизи. При высокоинтенсивном световом воздействии препараты вводили в течение 5-ти дней ежедневно внутрижелудочно 1 раз в сутки, первое введение препарата осуществляли за двое суток до освещения. При длительном низкоинтенсивном световом воздействии - ежедневно на протяжении всего периода освещения.

Животных выводили из эксперимента посредством декапитации под эфирным наркозом. В максимально короткий срок после умерщвления осуществляли энуклеацию глаз. В контрольную группу входили 50 интактных крыс, которых содержали в идентичных условиях вивария с экспериментальными животными. График опытов планировался таким образом, что забой экспериментальных животных производился одновременно с контрольной группой крыс.

Серии экспериментов 1, 3, 4 и 5 выполнены совместно с к.м.н. А.А. Жданкиной. Эксперименты проводили с соблюдением приказа Министерства здравоохранения СССР за № 755 от 12.08.77 об обеспечении принципов гуманного обращения с животными и федеральным законом РФ "О защите животных от жестокого обращения" от 01.01.1997.

Микроскопическое исследование

Глазные яблоки фиксировали в жидкости Карнуа и заливали в парафин. Отвесные срезы задней стенки глаза окрашивали гематоксилином и эозином [Ромейс Б., 1954], крезиловым фиолетовым по Nissl [Лили Р., 1969] - для выявления хроматофильного вещества в перикарионах нейронов.

Иммуногистохимические исследования

С целью проведения иммуногистохимического исследования материал фиксировали в 12% нейтральном формалине в течение 24 часов [Эллиниди В.Н. и др., 2002]. Далее объекты заливали в парафин по обычной схеме. На парафиновых срезах проводили двухэтапные реакции для выявления белков-маркеров апоптоза – p 53 и bcl-2. На первом этапе депарафинированные срезы подвергали предварительной высокотемпературной обработке с целью демаскировки антигена, а затем инкубации с первыми (специфичными) антителами в течение ночи при температуре +4^оС. На втором этапе проводили инкубацию со вторыми антителами, авидин-биотин-пероксидазным комплексом с последующим выявле- нием пероксидазы хрена диаминобензидином.

Готовые срезы докрашивали квасцовым гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Подсчет p-53 иbcl 2– положительных нейронов производили по 4-бальной шкале на 100 клеток с каждой сетчатки при увеличении 10x40. Формула подсчета следующая [Эллиниди, В.Н., 2002]: Histochemical scores = P(i) х i где, i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0-4, P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Таблица 1. Распределение животных по сериям эксперимента.

№	Серия эксперимента	Кол-во животных	Сроки взятия материала (сут)
1	Воздействие света (6000 лк, 6 ч.)	20	1, 7, 14, 30
2	Аллоксановый диабет (1месяц)	20	Через 4, 5, 6 и 8 недель после введения аллоксана
3	Световое воздействие (6000 лк, 6 ч.) через месяц после введения аллоксана	20	1, 7, 14, 30
4	Световое воздействие (6000 лк, 6 ч.), коррекция асковертином	20	1, 7, 14, 30
5	Световое воздействие (6000 лк, 6 ч.) через месяц после введения аллоксана, коррекция асковертином	20	1, 7, 14, 30
6	Световое воздействие (6000 лк, 6 ч.), коррекция каровертином	20	1, 7, 14, 30
7	Световое воздействие (6000 лк, 6 ч.) через месяц после введения аллоксана, коррекция каровертином	20	1, 7, 14, 30
8	Освещение животных (200 лк) в течение 1, 7, 14, 30 сут	20	После окончания освещения
9	Световое воздействие (200 лк) в течение 1, 7, 14, 30 суток через месяц после введения аллоксана	20	После окончания освещения
10	Освещение животных светом 200 лк в течение 1, 7, 14, 30 сут. на фоне введения асковертина.	20	После окончания освещения
11	Световое воздействие (200 лк) в течение 1, 7, 14, 30 суток через месяц после введения аллоксана, коррекция асковертином	20	После окончания освещения
12	Освещение животных светом 200 лк в течение 1, 7, 14, 30 сут на фоне введения каровертина.	20	После окончания освещения
13	Световое воздействие (200 лк) в течение 1, 7, 14, 30 суток через месяц после введения аллоксана, коррекция каровертином	20	После окончания освещения