Полиморфизм биологических маркеров течения ревматоидного артрита среди русских женщин европеоидного происхождения
Коненков В.И., Зонова Е.В., Королев М.А., Прокофьев В.Ф., Шевченко А.В., Орлов Н.Б., Леонова Ю.Б., Орлов Д.Н.

НИИКЭЛ СО РАМН

Ревматоидный артрит (РА) среди европеоидов, включая русских, распространен в основном среди женщин [1]. Среди эндокринных, метаболических и прочих возможных причин такой селективной заболеваемости, несомненное значение имеют генетические факторы. Так по нашим данным, среди мужчин практически во всех случая выявляются гомозиготные генотипы *GG и *CC в полиморфных точках гена TNFA A-238 G, A-308 G и A-863 C, ассоциированные с низким уровнем продукции самого фактора некроза опухолей α. Часто встречаются и гомозиготные варианты *ТТ гена IL4 в точке полиморфизма C -590T, ассоциированные по некоторым данным с высокой продукцией интерлейкина-4. Если гипотеза о характере этих ассоциаций найдет свое подтверждение и для русской популяции, то иммунорегуляторный цитокиновый тип мужчин должен отличатся от женского типа преобладанием противовоспалительных сигналов над провоспалительными. Возможно такой, более «воспалительный», характер иммунорегуляции у женщин и связан с широким распространением среди них РА, характеризующегося системным характером воспалительных процессов.

Исходя из этого, мы провели анализ ассоциированности генотипов в ряду полиморфных точек промоторных участков генов цитокинов с такими надежными показателями течения РА, как концентрации С-реактивного протеина (СРП) и ревматоидного фактора (РФ) среди пациентов с РА женского пола. Проведено и сопоставление характера распределения комбинаций исследованных генотипов цитокинов среди здоровых женщин и женщин, страдающих РА. Исследовались 8 полиморфизмов, локализованных в промоторных регионах 6 генов интерлейкинов (IL): TNFA в позициях С-863А, G-308A, G-238A, IL1B T-31C, IL4 C-590T, IL6 G-174C, IL10 C-592A, VEGFA С-2578А.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты Всего обследовано 509 женщин, из которых 135 пациенток с РА и 374 здоровых женщин из группы сравнения.

Генотипирование

Статистика

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исходя из общего числа анализируемых комбинаций генотипов 8 полиморфных участков, теоретически в популяции должны встречаться 65 535 комбинаций, однако реально в проанализированной нами выборке выявлено лишь 13 498 комбинаций генотипов. Это свидетельствует о том, что большая часть комбинаций генотипов среди женщин отсутствует, причиной чего может быть воздействие какого либо эволюционно селективного негативного фактора, исключающего из популяции возможность существования в геноме индивида таких сочетаний. Из числа реально существующих комбинаций в 374 случаях нами установлено наличие достоверных по двустороннему критерию точного метода Фишера (ТМФ) различий между здоровыми и больными РА женщинами. Из них 233 соответствуют достоверному доверительному интервалу для OR CI 95%. Результаты анализа 52 из них, с наиболее высоким уровнем достоверности различий по ТМФ менее 0,01 и значениями 0,33,0, представлены в таблице 1.

Как следует из представленных в ней данных, большая часть, почти 80%, достоверно различающихся по частоте встречаемости признаков, увеличена в группе пациенток с РА. Обращает на себя внимание высокая частота среди них гомозиготных генотипов в полиморфных участках генов цитокинов, ассоциированных с высоким или низким уровнем продукции самих регуляторных цитокинов [2]. Наиболее широко, среди часто встречающихся при женском РА комбинированных генетических признаков, представлены гомозиготные варианты гена TNFA в точках полиморфизма С-863А, G-308A и G-238A, ассоциированные с низким уровнем продукции фактора некроза опухолей альфа, обладающего провоспалительным эффектом [3]. Из 42 комбинаций генотипов, ассоциированных с РА у женщин, такие гомозиготные варианты выявлены в 34 комбинациях (более 80% случаев), тогда как гомозиготы, ассоциированные с высокой продукцией фактора, не выявлены ни в одном случае.

Схожая ситуация и с гомозиготным вариантом АА гена IL10 в позиции C-592A, ассоциированного с низким уровнем продукции интерлейкина-10 с выраженной противовоспалительной активностью [4]. Из 42 позитивно ассоциированных комбинаций, его генотипы выявлены в 36 комбинаций. В 21 комбинации выявлен генотип АА и в остальных 15 гетерозиготный вариант АС, тогда как гомозиготный вариант СС не выявлен ни в одном случае. Генотипы IL1B в точке полиморфизма T- 31C выявлены в группе женщин с РА 18 раз и в 12 случаях это были гомозиготные варианты ТТ, ассоциированные с высоким уровнем продукции провоспалительного цитокина интерлейкин-1 [5], и 6 раз геторозиготные варианты АТ, тогда как гомозиготные варианты СС не выявлены ни в одном случае.

Суммируя эти наблюдения можно предположить, что среди русских женщин, страдающих РА, наиболее часто выявляются генотипы цитокинов, ассоциированные с низким уровнем продукции антивоспалительного цитокина интерлейкина-10, наряду с высоким уровнем продукции провоспалительного цитокина интерлейкина-1, что сдвигает иммунорегуляторный баланс в сторону активного воспаления. Наряду с этим часто встречаются варианты гена TNFA, ассоциированные с низким уровнем этого провоспалительного цитокина, что может негативно сказываться на эффективности проведения у носителей таких генотипов, анти-TNF терапии генно-инженерными биологическими препаратами.

Далее нами проведен анализ частоты распределения исследуемых комбинаций генотипов цитокинов у пациентов с различным уровнем ревматоидного фактора М, результаты которого представлены в таблице 2. В данном анализе использован квантильный подход, при котором сравниваются распределение генотипов в группах с максимальными значениями концентрации РФ (в нашей выборке более 433,6 U/ml) и с минимальными значениями показателя (менее 40,07 U/ml). Вопрос о том, можно ли считать пациентов с такими минимальными значениями концентрации РФ, «серонегативными», в классическом понимании этого термина, остается открытым и требует согласованного многоцентрового исследования для различных по этнической принадлежности, полу и возрасту групп населения России.

Однако при сопоставлении параметров распределения комбинаций генотипов цитокинов в этих группах выявляются значительные различия между условно серонегативными и серопозитивными пациентками с РА. Прежде всего, обращает на себя внимание, что в группе «серопозитивных» пациенток в достоверно повышенных по частоте комбинациях генотипов выявляются исключительно гомозиготные варианты GG гена IL6 в позиции C-174G, ассоциированные с высоким уровнем продукции этого провоспалительного цитокина интерлейкина-6 [6]. В оппозитной группе таких генотипов не выявлено в составе ни одной комбинации, наряду с наличием в их составе генотипов СС, характерных для лиц с низким уровнем продукции этого цитокина.

Еще большие различия выявлены по частоте встречаемости генотипов цитокинов с антивоспалительной активностью IL4 и IL10. В группе пациенток с максимальными значениями концентрации РФ гомозиготные генотипы этих генов в исследованных точках полиморфизма не выявлены ни разу. Тогда как в группе пациенток с минимальными значениями концентрации РФ в 85% случаев выявлены генотипы СС гена IL4, ассоциированные с низким уровнем его продукции [7]. А гомозиготный вариант СС гена IL10 в полиморфной позиции C-592A, связанной с высоким уровнем продукции интерлейкина-10, выявляется еще в 30% достоверно ассоциированных комбинаций.

Гомозиготные генотипы СС и GG гена TNFA в трех исследованных полиморфных позициях, ассоциированные с низким уровнем продукции этого провоспалительного цитокина, встречаются с одинаковой высокой частотой в составе комбинаций генотипов в обеих группах пациенток с РА вне зависимости от концентрации РФ. Вероятно, этот генетический признак является общим для всей группы русских женщин с РА, как показано в таблицах 1 и 2, и не может служить дискриминирующим фактором для уровня РФ.

Общепринятым в ревматологии уже длительное время считается показатель СРП. С внедрением в практику методов его количественного определения встал вопрос о динамичности этого лабораторного признака. Появились сведения о том, что концентрация этого белка в сыворотке крови не всегда тесно ассоциирована со степенью активности РА и существуют пациенты с явными клинико-лабораторными признаками высокой степени активности, но с длительно сохраняющимися минимальными значениями этого показателя. Именно такие пациентки вошли в группу с минимальными значениями концентрации СРП менее 6 мг/л, тогда как оппозитную группу составили пациентки с аналогичным уровнем активности РА, но с максимальными значениями концентрации СРП более 25,5 мг/л (группы мин. и макс. в таблице 3).

Как показали результаты проведенного анализа, пациентки с длительно сохраняющимися до начала стационарного лечения минимальными значениями СРП, достоверно различаются от пациенток с его максимальными значениями по целому ряду генетических признаков. Прежде всего, в группе больных с минимальными значениями признака в составе достоверно чаще встречающихся комбинаций генотипов цитокинов, закономерно выявляются гомозиготные генотипы гена IL10 в полиморфной позиции C-592A, связанной с высоким уровнем продукции интерлейкина-10 [4]. Эти белки с регуляторными свойствами (интерлейкин-10 и С-реактивный протеин) находятся в конкурентных отношениях и взаимно подавляют продукцию друг друга [8]. Таким образом, наличие низких концентраций СРП у лиц с генетически обусловленным высоким уровнем продукции IL-10 находит свое логичное объяснение.

Столь же часто в этой группе больных РА женщин выявляются гомозиготные генотипа ТТ гена IL1B в полиморфной позиции C-31T, ассоциированной с высокой степенью продукции этого провоспалительного цитокина. Вероятно за счет этого у пациенток с минимальными значениями СРП сохраняются другие клинико-лабораторные показатели активности системного воспаления при РА.

Таким образом, в результате проведенного исследования нами выявлены генетические признаки, которые с высокой частотой агрегируются в группе женщин, страдающих РА. Эти генетические признаки носят комплексный характер и состоят из различного числа генотипов цитокинов. Исследуемые нами полиморфные участки генов цитокинов располагаются в промоторных зонах генов и по некоторым данным ассоциируются с различным уровнем продукции мононуклеарными клетками соответствующих цитокинов. Естественно главным образом этот эффект проявляется в гомозиготных комбинациях, когда в геноме индивида имеются одинаковые аллели с однонаправленным характером ассоциированности. Этот вопрос о характере ассоциированности аллелей генов цитокинов с уровнем их продукции в различных этнических группах в настоящее время находится в стадии разработки, однако сам факт ассоциированности РА у женщин с такими генетическими комбинациями доказан корректной математической обработкой. Сочетание в едином геноме человека аллелей и генотипов, ассоциированных с однотипно высоким или низким уровнем продукции цитокинов с провоспалительной и антивоспалительной активностью, может иметь самые различные клинические проявления и, вероятно, с этим феноменом отчасти связан высокий клинический полиморфизм течения большинства болезней современного человека.

Об этом же свидетельствуют и представленные в настоящем сообщении результаты генетического анализа пациентов с различным уровнем содержания в крови таких устойчивых лабораторных показателей течения РА, как РФ и СРП, которые показали выраженные различия в частоте распространения комбинированных генетических признаков в группах пациенток максимальными и минимальными уровнями концентраций этих протеинов. Эти лабораторные признаки, несомненно, интегрально отражают характер течения РА у отдельных индивидов и хорошо сочетаются с выявленными нами генетическими характеристиками пациентов в этих группах.

В заключении необходимо отметить, что подобные исследования лишь подступают к решению фундаментальной проблемы современной клинической медицины – к разработке ее персонифицированной версии, когда лечение пациента будет основываться на индивидуальных особенностях каждого пациента, и эти конституциональные особенности, скорее всего, будут иметь генетический, а, следовательно, и прогностический характер.

ЛИТЕРАТУРА

1. 
   Насонов Е.Л. Ревматология: национальное руководство. – 2008. – М., Гоэтар-Медиа.- 720с.
   
2. 
   Hollegaard M.V., Bidwell J.L. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases, Supplement 3.//Genes and Immunity.-2006.-Vol.7. - P. 269-276
   
3. 
   Ackerman H., Usen S., Mott R. Haplotypic analysis of the TNF locus by association efficiency and entropy //Genome Biology.-2003.-Vol.4.-Р.24-27.
   
4. 
   Perrey C, Pravica V, Sinnott PJ, Hutchinson IV. Genotyping for polymorphisms in interferon-gamma, interleukin-10, transforming growth factor-beta 1 and tumour necrosis factor-alpha genes: a technical report. //Transpl. Immunol.- 1998.-Vol 6.-P.193-197.
   
5. 
   Waterer G.W., Wunderink R.G. Science review: Genetic variability in the systemic inflammatory response // Critical Care. - 2003. - Vol. 7.- (4). - P. 308-314
   
6. 
   Fishman D, Faulds G, Jeffery R, Mohamed-Ali V, Yudkin JS, Humphries S, Woo P. The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis //J. Clin. Invest. – 1998. – v.102 - №7. – p.1369-1376.
   
7. 
   Kawashima T, Noguchi E, Arinami T, Yamakawa-Kobayashi K, Nakagawa H, Otsuka F, Hamaguchi H. Linkage and association of an interleukin 4 gene polymorphism with atopic dermatitis in Japanese families//J Med Genet. - 1998 – v.35. - № 6. – p. 502-504.
   
8. 
   Singh U., Devaraj S., Dasu M.R., Ciobanu D., Reusch J., Jialal I. C-Reactive Protein decreases interleukin-10 secretion in activated human monocyte-derived macrophages via inhibition of cyclic AMP production// Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. – 2006. – v. 26. - p.2469 – 2473.