Сборник лабораторных работ Для студентов вузов Кемерово 2005

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

КЕМЕРОВСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

БИОХИМИЯ
Сборник лабораторных работ
Для студентов вузов

Кемерово 2005

УДК 577.1 (076.5)

ББК 8.072я7

Б63
Авторы:

В.В. Шапкарин, А.П. Королев, С.Б. Гридина, Е.П. Зинкевич

Рецинзенты:

А.С. Разумов, д-р м. наук,профессор;

Л.Г. Пинчук, канд. с/х. наук, доцент
Рекомендовано редакционно-издательским советом

Кемеровского технологического института

пищевой промышленности

Б63 Биохимия: сборник лабораторных работ / В.В. Шапкарин, А.П. Королев, С.Б. Гридина, Е.П. Зинкевич; Кемеровский технологический институт пищевой промышленности.- Кемерово, 2005.- 84 с.

ISBN 5-89289-349-9
Пособие знакомит студентов с методами обнаружения и количественного опреде-

ления белков, ферментов, углеводов, липидов и витаминов в биологических объектах и сырья для пищевой промышленности, а также приемами выделения этих соединений и некоторыми сторонами их обмена. Работы подобраны с учетом доступности исследуемого материала, реактивов и оборудования, возможности выполнения в отведенное для занятий время и использования методов анализа для различных биологических объектов. Каждая работа содержит теоретическое обоснование, порядок выполнения, способ учета результатов.

Пособие может быть полезно для студентов технологических специальностей вузов пищевой промышленности.

УДК 577.1(076.5)

ББК 28.072я7
ISBN 5-89289-349-9

© КемТИПП, 2005

Введение

Настоящее руководство к выполнению лабораторных работ по биохимии предназначено для студентов всех технологических специальностей и форм обучения. Учебное пособие включает методы определения белков, углеводов и жиров, а также методы определения активности ферментов белкового, углеводного и липидного обменов.

Цель лабораторного практикума – ознакомить студентов с основными методами, применяемыми в биохимии, а также с проведением работ, включающих элементы исследования. При проведении учебно-исследовательских работ студенты получают индивидуальные задания, с учетом получаемой специальности. В конце работы полученные результаты сводятся в таблицу и анализируются.

В учебное пособие включены описания следующих методов, используемых студентами при выполнении учебно-исследовательских работ: - определение белка по методу Кьельдаля и с помощью биуретового реактива; - выделение простых белков с использованием метода диализа и фракционирования; - определение аминокислот в смеси методом хроматографии на бумаге и др.

Лабораторные работы по изучению активности ферментов белкового, углеводного и липидного обменов являются исследовательскими, так как для их проведения преподавателю предоставляется возможность перед началом работы выдать студентам индивидуальные задания с учетом изучаемой специальности, используя при этом различные виды изучаемых биологических материалов, а также различные критерии оценки химического состава и ферментативной активности.

По окончании курса студент должен знать биологическую роль, пищевое значение, строение и свойства химических соединений, входящих в состав живых организмов и основные процессы обмена, лежащие в основе жизнедеятельности и овладеть основными методами химического анализа биологического материала: качественное обнаружение и количественное определение белков, аминокислот, витаминов и др. соединений.

При изучении курса студент должен овладеть навыками обнаружения в биологических объектах белков, углеводов, липидов и витаминов. Знать методы исследования свойств и определения активности ферментов.
Глава 1. Методы исследования в биохимии
Биохимия является и биологической и химической наукой, так как изучает вещества животного, растительного и микробного происхождения с целью познания их строения, свойств и выяснения механизмов функционирования.

Данные о химическом составе организмов, строении мономеров, полимеров, надмолекулярных комплексов, органелл клеток, их структур и функций были получены разнообразными методами неорганической, аналитической, органической химий, химии высокомолекулярных соединений, физиологии и методами разработанными биохимиками.

Среди методов, используемых в биохимии, ключевое значение имеют методы выделения веществ из биологического материала и их очистка с целью получения индивидуальных соединений.

Следует отметить три главные проблемы выделения индивидуальных комплексов из живых организмов, в особенности таких сложных как белки и нуклеиновые кислоты.

Во-первых исследуемый материал – биомасса, из которой предстоит выделить интересующее исследователя вещество – состоит из сотен и тысяч различных соединений. Разделение таких смесей по уровню сложности не имеет себе равных среди других этапов изучения веществ. Это усугубляется еще тем, что многие компоненты этих смесей, выполняя различные биологические функции, построены однотипно и мало различаются по таким свойствам как растворимость и осаждаемость или способность поглощаться определенным типом сорбентов.

Во-вторых, многочисленные исследования выделенного и очищенного вещества (например, белка), ставят в рамки необходимости работать с очень малыми количествами вещества – мг и мкг. Поэтому основными методами исследования являются: - спектрофотометрические, основанные на измерении поглощения видимого или ультрафиолетового света; - радиохимические, основанные на измерении радиоактивности, и люминесцентные, основанные на флюоресценции (био- и хемилюминесценции).

В-третьих, многие компоненты обладают очень низкой устойчивостью. Так многие белки, при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды, подвергаются необратимому изменению нативной конформации – денатурации, которая сопровождается потерей биологической активности – инактивацией. Кроме того, в клетках имеются ферменты, способные гидролизовать белки и нуклеиновые кислоты – протеазы и нуклеазы. В неповрежденных клетках эти ферменты сосредоточены главным образом в лизосомах. Однако при разрушении клеток тканей, которое всегда предшествует выделению веществ, лизосомы разрушаются, ферменты выходят, что приводит к быстрому гидролизу биополимеров в биомассе.

Выделение индивидуальных биополимеров является многоступенчатым процессом. На каждом этапе разделения должна получаться фракция, более богатая выделяемым веществом. Такой процесс называют фракционированием.

Для выделения искомого биополимера из раствора можно воспользоваться осаждением, для этого необходимо понизить растворимость этого биополимера. Так, для осаждения белков добавляют к их водным растворам ацетон. На растворимость белков влияет ионная сила раствора. Высокая концентрация соли приводит к высаливанию. При этом концентрация соли, необходимая для осаждения, различна для различных белков. Наиболее широко для высаливания используется сульфат аммония, обладающий высокой растворимостью и даже высокие концентрации этой соли не вызывают денатурирующего действия на белки.

Изменение рН среды для кислых белков в кислую сторону, а для основных – в щелочную приводит их молекулы к изоэлектрической точке. Молекулы лишенные ионной атмосферы сближаются до радиуса действия Ван-дер-Ваальсова притяжения. Иногда это приводит к выпадению белка в осадок. Такой способ выделения называют изоэлектрическим осаждением. Выпавший осадок можно отделить фильтрованием.

На начальных стадиях выделения белков из исходной биомассы или осадков нередко используют экстракцию. Например, для выделения из измельченного биологического материала фракции альбуминов применяют экстракцию дистиллированной водой, фракции глобулинов – экстракцию 5-10 %-ными растворами нейтральных солей (хлорида натрия или сульфата аммония), суммарной фракции липидов – серным эфиром и т.д.

Многие задачи по разделению веществ решаются с помощью сорбции части компонентов смеси на тех или иных сорбентах (гель фосфата кальция, активированный уголь). Заряженные компоненты можно сорбировать на ионитах – сорбентах, имеющих на поверхности заряженные группы.

Разделение может проводиться по размеру частиц с использованием ситового эффекта. Молекулярные сита – это материалы с порами определенного размера. Вещества, молекулы которых меньше размера пор, при пропускании через колонку задерживаются в порах, так как вода, находящаяся там, служит неподвижной фазой для малых частиц. Для больших молекул эти поры недоступны, и они обтекают гранулы, существенно опережая низкомолекулярные компоненты смеси.

Во многих методах разделения применяют различные низкомолекулярные вещества (органические растворители, соли, кислоты, щелочи), создающие нужные значения ионной силы и рН, от которых, на определенном этапе выделения и очистки, требуется избавиться. Для этого используется диализ, основанный на применении мембран, проницаемых для воды и низкомолекулярных веществ и непроницаемых для биополимеров.Чаще всего для этого используют пленки из целлофана, представляющие собой нитрат целлюлозы, обладающие прочностью и способностью пропускать молекулы воды и гидрофильных низкомолекулярных компонентов.

Для получения индивидуального вещества, из смеси близких по строению веществ, используют зональные методы разделения. Одним из них является хроматография. Используются три группы методов хроматографии: на колонках, на пластинах (тонкослойная) и на бумаге. Вторым зональным методом разделения смесей является электрофорез, основанный на перемещении заряженных частиц в электрическом поле.

Зональное разделение можно проводить с помощью седиментации органелл клеток, биополимеров в центробежном поле в ультрацентрифугах.

Более тонкие методы разделения основаны на использовании специфического (например, иммунного) сродства биополимера к партнеру получили название аффинных методов разделения. Наиболее широко используемый вариант - использование аффинных сорбентов, которые адсорбируют выделяемое вещество из смеси.

После выделения и очистки конкретного вещества используют методы качественного и количественного определения, методы изучения их свойств, структуры и функций.

Изучение структур биополимеров, надмолекулярных комплексов осуществляют методами электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа.

Выяснение химизма обмена веществ проводят на живых организмах, органах, тканях и клетках животных, растений, микробов методами балансовых опытов, меченых атомов (радиоактивных изотопов) и др.

1.1. Указания к выполнению лабораторных работ

Перед выполнением работы необходимо внимательно ознакомиться с методикой её проведения и предположить ожидаемый результат, вытекающий из теоретического обоснования химизма реакции или процесса.

Выполнение работ знакомит студента с методами качественных и количественных исследований сырья и готовой продукции, с основами биотехнологии, дополняет и закрепляет теоретический материал наиболее сложных разделов изучаемой дисциплины.

В начале раздела и перед работой излагаются краткие теоретические обоснования по химии, биологической роли и метаболизму органических веществ. К каждой работе дано описание химической реакции или процесса, ожидаемый результат и практическое значение.

Выполняемую работу обязательно записать в тетрадь с указанием номера, названия, цели работы, принципа метода, химизма происходящих реакций или процессов, схемы исследования и полученных результатов. По результатам работы произвести расчет или оформить полученные данные по предложенной схеме и сделать вывод.

Контрольные вопросы, приведенные в учебном пособии к каждой лабораторной работе, очерчивают минимум знаний, необходимых для защиты выполненной и оформленной работы.

Правила безопасной работы в лаборатории биохимии

1. Работу в лаборатории необходимо выполнять в халатах.

Всю посуду перед выполнением работы необходимо вымыть.
Концентрированные кислоты, щелочи и другие сильнодействующие реактивы набирать пипеткой с грушей или отмерять цилиндром.
Все опыты с концентрированными кислотами, щелочами и легкоиспаряющимися веществами производить только в вытяжном шкафу.
Если пролили концентрированную кислоту или щелочь, то их надо нейтрализовать толченым мелом или раствором кислоты, соответственно, а затем смыть водой.
При попадании концентрированной кислоты или щелочи на кожу, необходимо быстро смыть водой, а затем соответственно 2 % раствором бикарбоната натрия или 2 % раствором борной кислоты.
Запрещается оставлять без присмотра включенные электроприборы.
Категорически запрещается принимать в лаборатории пищу, пользоваться лабораторной посудой для питья.
При работе с химическими веществами нельзя пробовать их на вкус.

Глава 2. Белки и аминокислоты
Белки – высокомолекулярные биологические полимеры, структурными (мономерными) звеньями которых служат -аминокислоты. Аминокислоты в белках соединены друг с другом пептидной связью, образование которой происходит за счет карбоксильной группы, стоящей у -углеродного атома одной аминокислоты и -аминной группы другой аминокислоты с выделением молекулы воды. Мономерные звенья белков называют остатками аминокислот.

Кроме белков, из аминокислот построены пептиды - соединения, содержащие до 20 аминокислотных остатков и полипептиды, содержашщие от 20 до 50 аминокислотных остатков с молекулярной массой до 6 тыс. ед. Массовая доля белков в биологических объектах колеблется в широких пределах: молоке – 2,5-5 %, мышечной ткани – 18-22 %, содержимом куриного яйца – 12-14%, семенах зерновых культур (от сухой массы) – 12- 40 % (и более), картофеле – 0,7-4,6 %, свекле, моркови и других корнеплодах 0,9-1,6 %, фруктах и ягодах – 0,3-2 %, грибах – 3-4 %.

Пептиды, полипептиды и белки отличаются не только количеством, составом но и последовательностью аминокислотных остатков, физико-химическими свойствами и функциями, выполняемыми в организме.

Молекулярная масса белков варьирует от 6 тыс. до 1 млн. и более. Химические и физические свойства белков обусловлены химической природой и физико-химическими свойствами радикалов, входящих в них остатков аминокислот. Способы обнаружения и количественного определения белков в биологических объектах и продуктах питания, а также выделения их из тканей и биологических жидкостей основаны на физических и химических свойствах этих соединений.

2.1. Цветные реакции на белки и аминокислоты

Белки при взаимодействии с некоторыми химическими веществами дают окрашенные соединения. Образование этих соединений происходит при участии радикалов аминокислот, их специфических групп или пептидных связей. Цветные реакции позволяют установить наличие белка в биологическом объекте или растворе и доказать присутствие определенных аминокислот в белковой молекуле. На основе цветных реакций разработаны некоторые методы количественного определения белков и аминокислот.

Универсальными считают биуретовую и нингидриновую реакции, так как их дают все белки. Ксантопротеиновая реакция, реакция Фоля и др. являются специфическими, так как они обусловлены радикальными группами определенных аминокислот в молекуле белка.

Цветные реакции позволяют установить наличие белка в исследуемом материале и присутствие определенных аминокислот в его молекулах.

На основании некоторых цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот.
БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ. Реакция обусловлена наличием в белках, пептидах, полипептидах пептидных связей, которые в щелочной среде образуют с ионами меди (II) комплексные соединения, окрашенные в фиолетовый (с красным или с синим оттенком) цвет. Окраска обусловлена наличием в молекуле не менее двух групп -CO-NH-, связанных непосредственно между собой или при участии атома углерода или азота.

Образующееся в щелочной среде комплексное соединение меди (II) с пептидными группами имеет следующее строение:

+ NaOH (избыток), + Cu²⁺

Ионы меди (II) соединяются двумя ионными связями с группами =С─О^ˉи четырьмя координационными связями с атомами азота (=N―).

Итенсивность окраски зависит от количества белка в растворе. Это позволяет использовать данную реакцию для количественного определения белка. Цвет окрашенных растворов зависит от длины полипептидной цепи. Белки дают сине-фиолетовое окрашивание; продукты их гидролиза (поли- и олигопептиды) – красную или розовую окраску. Биуретовую реакцию дают не только белки, пептиды и полипептиды но и биурет (NH₂-CO-NH-CO-NH₂) , оксамид (NH₂-CO-CO-NH₂), гистидин.

ХОД РАБОТЫ. Берут пять пробирок и вносят по 1 мл : в первую воды, во вторую – раствора казеина, в третью – раствора яичного белка, в четвертую – раствора желатины, в пятую – раствора α-аминокислоты. В каждую пробирку добавляют по 2 мл раствора гидроксида натрия 10 % и по 5-6 капель раствора с массовой долей сульфата меди 1 %. Содержимое каждой пробирки перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 10 минут для развития окраски.При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить путем наслоения на раствор белка в щелочи 1 мл раствора с массовой долей сульфата меди 1 %.

Результаты этой и всех других цветных реакций на белки и аминокислоты вносят в табл. 1. Таблица 1.

Цветные реакции на белки и аминокислоты

Исследуемый материал	Окраска продукта	Реагирующая группа
Биуретовая реакция
Вода
Казеин
Яичный белок
Желатин
Аминокислота
Нингидриновая реакция
Вода
Казеин
Яичный белок
Желатин
Аминокислота
Ксантопротеиновая реакция
Казеин
Яичный белок
Желатин
Фенол
Реакция Фоля (на слабосвязанную серу)
Вода
Казеин
Яичный белок
Желатин

НИНГИДРИНОВАЯ РЕАКЦИЯ. В этой реакции растворы белка, полипептидов, пептидов и свободных α-аминокислот при нагревании с нингидрином дают синее, сине-фиолетовое или розово-фиолетовое окрашивание. Окраска в этой реакции развивается за счет α-аминогруппы. Реакция протекает в две стадии.

Н

Нингидрин Аминокислота Кетимин
ингидрин образует с аминокислотами соединения с двойной связью между углеродом и азотом, называемые иминами или основаниями Шиффа.

^-

‾

Альдимин Промежуточный амин Альдегид

‾

‾

‾
Эти соединения обладают высокой реакционной способностью. Дальнейшее превращение их приводит к промежуточному амину, который может реагировать со второй молекулой нингидрина, давая соединение окрашенное в сине-фиолетовый (пурпурный) цвет – сине-фиолетовый (пурпурный) Руэмана.

Очень легко реагируют с нингидрином -аминокислоты. Наряду с ними сине-фиолетовый Руэмана образуют также белки, пептиды, первичные амины, аммиак и некоторые другие соединения. Вторичные амины, например пролин и оксипролин, дают желтую окраску.

Нингидриновую реакцию широко используют для обнаружения и количественного определения аминокислот.

ХОД РАБОТЫ. Берут пять пробирок, и вносят по 1 мл: в первую воды, во вторую – раствора казеина, в третью – раствора яичного белка, в четвертую – раствора желатины, в пятую – раствора аминокислоты (глицина). Затем в каждую пробирку добавляют по 10-12 капель раствора с массовой долей нингидрина в ацетоне или этаноле 1 %. Содержимое каждой пробирки перемешивают встряхиванием и ставят их в кипящую водяную баню на 3-5 мин. Записывают химизм реакции, схему постановки опыта, строение окрашенных соединений. Результаты вносят в табл. 1.

КСАНТОПРОТЕИНОВАЯ РЕАКЦИЯ. Эта реакция указывает на наличие в белках остатков ароматических аминокислот – тирозина, фенилаланина, триптофана. Основана на нитровании бензольного кольца радикалов этих аминокислот с образованием нитросоединений, окрашенных в желтый цвет (греческое «Ксантос» – желтый). На примере тирозина эту реакцию можно описать в виде следующих уравнений.

Тирозин Нитротирозин

+ Н₂О

Нитротирозин Натриевая соль нитротирозина
В щелочной среде нитропроизводные аминокислот образуют соли хиноидной структуры, окрашенные в оранжевый цвет.

Ксантопротеиновую реакцию дают бензол и его гомологи, фенол и другие ароматические соединения.

ХОД РАБОТЫ. Берут четыре пробирки и вносят по 1 мл: в первую раствора казеина, во вторую – раствора яичного белка, в третью – раствора желатины, в четвертую – раствора фенола. Во все пробирки добавляют по 10 капель концентрированной азотной кислоты. Содержимое перемешивают встряхиванием и пробирки помещают в кипящую водяную баню на 5-8 мин. Под действием кислоты появляется осадок белка, который при нагревании окрашивается в желтый цвет. После бани пробирки выдерживают при комнатной температуре 4-5 мин и записывают окраску содержимого. Затем в каждую пробирку прибавляют по 1 мл раствора с массовой долей гидроксида натрия 30 % (или другую щелочь). Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, окраску записывают. Работу оформляют в соответствии с табл.1.
РЕАКЦИЯ ФОЛЯ (на слабосвязанную серу). Этой реакцией открывают в белках радикалы цистеина содержащие как свободные –SH (тиоловые) радикальные группы, так и окисленные с образованием дисульфидных (-S-S-) связей цистина.

При нагревании белка, содержащегося в молекуле остатки цистеина и цистина, с концентрированным раствором щелочи и ацетатом (или другой растворимой солью) свинца (реактив Фоля) образуется бурое или черное окрашивание. Это объясняют тем, что под действием щелочи от радикалов цистеина отщепляется сера в виде иона со степенью окисления минус два, который, взаимодействуя с ионом свинца (II), дает бурый или черный нерастворимый осадок сульфида свинца. Белки, в составе которых нет цистина и цистеина, реакцию Фоля не дают. Химизм процесса можно описать следующими реакциями:

CH₂SH CH₂OH

| |

CHNH₂ + 2 NaOH = CHNH₂ + Na₂S + H₂O

| |

COOH COOH

Цистеин Серин

Na₂S + Pb(CH₃COO)₂ = PbS + 2CH₃COONa

Ацетат свинца Ацетат натрия

При нагревании со щелочью часть белка подвергается гидролизу. Кроме того происходит отщепление части аминогрупп (реакция дезаминирования) в виде аммиака, который можно обнаружить по запаху и посредством смоченной водой красной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться стенок!).

ХОД РАБОТЫ. Берут четыре пробирки и вносят по 1 мл: в первую воды, во вторую – раствора казеина, в третью – раствора яичного белка, в четвертую – раствора желатины. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора с массовой долей гидроксида натрия 30 % и по 6-8 капель раствора с массовой долей ацетата свинца 5 %, или можно приготовить реактив Фоля на всю подгруппу и добавить по 1 мл в каждую пробирку приготовленного раствора. Содержимое перемешивают встряхиванием, и пробирки помещают в кипящую водяную баню на 5-7 мин. Окраску содержимого пробирок записывают. Результаты оформляют в табл. 1.

РЕАКТИВЫ.Вода дистиллированная (в дальнейшем вода); растворы с массовыми долями: казеина 1 %, желатины 1 %, яичного белка 1 %, сульфата меди 1 %, гидроксида натря 10 и 30 %, глицина (или другой аминокислоты) 0,1 %, фенола 0,1 %, ацетата свинца 5 %, нингидрина в ацетоне или этаноле 1 %; концентрированная азотная кислота.

Реактив Фоля готовят в пробирке перед определением. В пробирку вносят 1 мл 5 % раствора ацетата свинца и небольшими порциями (по 1,5-2 мл) приливают 30 % раствор гидроксида натрия с интервалом 30 сек, каждый раз, перемешивая, до растворения молочно-белого хлопьевидного осадка появившегося после внесения первой порции гидроксида натрия.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:

Общая характеристика пептидов, полипептидов, белков и их строения.
Как соединяются аминокислоты в молекуле белка и за счет каких групп? Соедините Ала, Цис, Сер.
Перечислите цветные реакции на белки и аминокислоты.
Какая реакция открывает пептидные связи? Её химизм.
Что характеризуют цвет и интенсивность окраски при положительной биуретовой реакции?
Что открывает нингидриновая реакция? Её химизм.
Назовите аминокислоты имеющие в радикале бензольное кольцо. Какой реакцией можно обнаружить ароматические аминокислоты? Её химизм.
Назовите аминокислоты содержащие серу. Какую из них обнаруживает реакция Фоля? Химизм реакции.
Какую цветную реакцию используют для количественного определения белков в растворе и почему?
Какую цветную реакцию используют для количественного определения α-аминокислот и почему?

2.2. Методы количественного определения белка
В настоящее время используют более десяти методов для определения массы белка в биологическом материале и продуктах питания, которые можно разделить на 3 группы: химические, физические и физико-химические (колориметрические).

Из химических наиболее часто применяют метод формольного титрования, метод кислотного титрования и универсальный - метод Кьельдаля, основанный на количественном определении азота в исследуемом биологическом материале или пищевом продукте.

Из колориметрических методов наиболее распространены количественное определение белка на основе биуретовой реакции и метод Лоури (основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией), метод Бредфорда (основан на связывании белком красителя кумасси бриллиантового синего).

Среди физических методов наибольшее распространение получили: - рефрактометрический (по показателю преломления света раствором белка); - спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой области спектра); - полярографический (по кривым зависимости между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО АЗОТА ПО КЬЕЛЬДАЛЮ
Азот биологических объектов делят на общий, белковый и небелковый. Общий – это весь азот органических и минеральных соединений, содержащийся в биологическом объекте – целом организме, молоке, зернах растений, плодах и фруктах, яйцах птиц, мышцах, крови и т.п.

Белковый – это азот, входящий в состав белков. Небелковый – это азот, оставшийся в растворе после удаления белков. В составе небелкового азота различают: аминный (азот свободных аминокислот), амидный (азот аспарагина и глутамина), аммиачный азот, азот оснований, нитратный и нитритный азот.

Метод определения азота в биологических объектах и продуктах питания предложен Кьельдалем в 1883 году и до настоящего времени остается, по сравнению с другими методами, наиболее точным. Этим методом определяют отрицательно заряженный трехвалентный азот органических и минеральных соединений.

ПРИНЦИП МЕТОДА. Навеску анализируемого материала кипятят с концентрированной серной кислотой. При этом углерод органических веществ окисляется до диоксида углерода, водород – до воды; азот (отрицательно заряженный трехвалентный) превращается в аммиак, который с серной кислотой, взятой в избытке, образует сульфат аммония. Минерализованную пробу затем подщелачивают, аммиак отгоняют в раствор кислоты, где определяют титрованием.

Азот нитратов и нитритов, ядер гетероциклических соединений в ходе этого процесса в аммонийную соль не превращается.

ХОД РАБОТЫ. Работу по определению общего азота в биологических объектах и пищевых продуктах условно можно разделить на три этапа: минерализация, отгонка аммиака, титрование и расчет.

1. МИНЕРАЛИЗАЦИЯ. Материал для исследования взвешивают на аналитических весах с точностью до 0,0002 г и вносят, не касаясь краев, на дно колбы Кьельдаля (рис. 1) проба для анализа должна содержать 10-20 мг азота.

Исходя из этого отвешивают: сухой растительный материал – 300-500 мг, сухой животный материал – 100-200 мг, кровь, органы и ткани животных – 0,5-1,0 г, молоко – 2-4 г, молочная сыворотка – 10-20 г. В колбу добавляют 5-10 мл концентрированной серной кислоты (плотность 1,84), 5-7 крупинок сульфата меди (катализатор), 2-4 г сульфата калия или натрия (для повышения температуры кипения) и содержимое перемешивают круговым движением. Затем колбу ставят в наклонном положении на нагревательный прибор, помещенный в вытяжном шкафу, и закрывают ее отверстие стеклянной полой втулкой (специальный воздушный холодильник). Для уменьшения вспенивания и ускорения минерализации сразу же после начала нагрева в колбу осторожно добавляют 2-3 мл пероксида

Рис. 1. Колба Кьельдаля (1) и воздушный холодильник (2)
водорода. В процессе сжигания пероксид водорода добавляется еще 2-3 раза, но перед этим колбу снимают с огня и выдерживают при комнатной температуре 3-5 мин. Минерализацию считают законченной, если содержимое колбы остается прозрачным при кипячении 10-15 мин после очередного добавления пероксида водорода.

Параллельно с опытной ставят контрольную пробу с теми же реактивами, но без исследуемого материала. Химизм этого этапа можно выразить следующими уравнениями:
Навеска

биологического + H₂SO₄ CO₂ +H₂O + NH₃.

материала
Образующиеся при минерализации диоксид углерода и вода улетучиваются, а аммиак вступает в реакцию с избытком серной кислоты:
2 NH₃+H₂SO₄= (NH₄)₂SO₄.
2. ОТГОНКА АММИАКА. Эту часть работы выполняют в отгонном аппарате (рис. 2), состоящем из перегонной колбы 1, насадки Кьельдаля 2, воронки со стеклянной трубкой 3, холодильника 4, трубки с шариком для предохранения от всасывания жидкости 5, приемного стакана или колбы 6.

По окончании минерализации колбу Кьельдаля с содержимым оставляют при комнатной температуре для охлаждения и собирают аппарат для отгонки аммиака. Затем в приемный стакан (или колбу) вносят 25 мл раствора с массовой концентрацией борной кислоты 4 % или 20 мл раствора с концентрацией серной кислоты 0,05 моль/л (или соляной = 0,1 моль/л), 3-5 капель смешанного индикатора (имеет резкий переход цвета при pH 5,4 от сине-фиолетового в кислой среде к зеленому в щелочной) и ставят его так, чтобы нижний конец трубки, присоединенной к холодильнику, был погружен в раствор кислоты приемной колбы.

Рис. 2. Аппарат для отгонки аммиака
О хлажденный минерализат разбавляют в 2-3 раза водой и из колбы Кьельдаля переносят в перегонную колбу. Колбу Кьельдаля ополаскивают 3-4 раза порциями воды по 20-30 мл, смыв выливают в перегонную колбу. При ополаскивании учитывают, чтобы общий объем жидкости в перегонной колбе составлял около 1/3 ее вместимости. В перегонную колбу вносят 3-5 капель индикатора Таширо, бросают несколько кусочков пемзы или короткие стеклянные трубочки для равномерного кипения и ставят на нагревательный прибор. Все части отгонного аппарата соединяют герметически, через воронку приливают к содержимому перегонной колбы раствор с массовой долей гидроксида натрия 40 % до сильно щелочной реакции. При этом содержимое колбы окрасится в зеленый цвет. Нужный объем добавляемой щелочи можно предварительно рассчитать по реакции нейтрализации.

Включают холодильник и, нагревая содержимое перегонной колбы до кипения, отгоняют аммиак. Конец отгонки аммиака определяют по отсутствию изменения цвета красной лакмусовой бумажки при нанесении на нее капли жидкости, вытекающей из холодильника после отсоединения от него трубки с шариком. Первую проверку на полноту отгонки аммиака проводят через 10-15 мин после полного прогревания каплеуловителя. Обычно отгонку заканчивают после увеличения в приемной колбе объема жидкости в 2,5-3 раза от первоначального. По такой же методике производят отгонку содержимого контрольной колбы. Реакции второго этапа можно записать в виде следующих уравнений:

В перегонной колбе: (NH₄)₂SO₄ +NaOH = Nа₂SO₄+ NH₃ + Н₂O.

избыток

В приемной колбе:

а) при улавливании отгоняемого аммиака раствором серной кислоты -

2 NH₃+H₂SO₄= (NH₄)₂SO₄,

б) при улавливании отгоняемого аммиака раствором борной кислоты - 2 NH₃+ 4H₃ВO₃= (NH₄)₂В₄О₇ + 5 Н₂O.
Образовавшийся тетраборат аммония при гидролизе дает щелочную реакцию и содержимое приемной колбы окрашивается в зеленый цвет.

3. ТИТРОВАНИЕ И РАСЧЕТ. После окончания отгонки аммиака холодильник приподнимают так, чтобы свободный конец трубки с шариком находился над поверхностью жидкости приемной колбы и трубку изнутри и снаружи ополаскивают дистиллированной водой. Содержимое приемной колбы (погон) титруют раствором кислоты или щелочи, что зависит от соединения, применяемого для поглощения аммиака. При отгонке аммиака в раствор борной кислоты погон титруют раствором с концентрацией соляной кислоты 0,1 моль/л (серной кислоты 0,05 моль/л) до четкого перехода зеленого цвета в сине-фиолетовый (промежуточная окраска сероватого тона). Реакции, происходящие при титровании, можно описать следующими уравнениями:

(NH₄)₂В₄О₇ +2 HCl +5H₂O= 2NH₄Cl + 4Н₃BO₃
(NH₄)₂В₄О₇ +H₂SO₄ +5H₂O= (NH₄)₂ SO₄ + 4Н₃BO₃
Из приведенных уравнений легко рассчитать, что 1 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 0,1 моль/л (серной кислоты 0,05 моль/л) соответствует 0,0014 г азота.

Массовую долю азота в исследуемом материале (Х, %) рассчитывают по формуле:

где а – объем раствора с концентрацией соляной кислоты 0,1 моль/л (серной кислоты = 0,05 моль/л), израсходованной на титрование опытной пробы, мл;

b – объем раствора той же кислоты, израсходованной на титрование контрольной пробы, мл;

Т – титр примененного для опыта раствора соляной (серной) кислоты;

m - масса исследуемого вещества, г.

При отгонке аммиака в раствор серной (соляной ) кислоты погон титруют раствором с концентрацией гидроксида натрия (реже калия) 0,1 моль/л до четкого перехода сине-фиолетового цвета в зеленый. В этом случае оттитровывают избыток раствора с концентрацией соляной кислоты 0,1 моль/л (серной - 0,05 моль/л) взятого для поглощения аммиака. Массовую долю азота в исследуемом материале рассчитывают по приведенной выше формуле с той лишь разницей, что обозначения «а», «b» и «Т» относятся не к кислоте, а к щелочи.

Умножая полученную массовую долю азота на 6,25 (фактор пересчета азота в белок), находят содержание в исследуемом материале «сырого» белка. «Сырым» белок в этом случае называют потому, что при расчете исходят не из белкового азота, а из всего азота биологического объекта (или пищевого продукта), определенного методом Кьельдаля.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВОГО АЗОТА МЕТОДОМ КЬЕЛЬДАЛЯ

Из анализируемого материала экстрагируют небелковый азот. Для чего навеску измельченного материала, взятую в соответствии с предыдущей работой, помещают в химический стакан вместимостью 50 мл и заливают 20 мл дистиллированной воды (высушенный материал перед добавлением воды смачивают несколькими каплями этанола). Содержимое размешивают стеклянной палочкой и оставляют ее в стакане до конца экстракции небелкового азота. Стакан ставят на нагретую до 40-50 С водяную баню и, перемешивая содержимое каждые 10 мин, выдерживают 30 мин. При этом растворимые в воде азотистые соединения переходят в экстракт. Охлаждают до комнатной температуры, приливают равный объем раствора с концентрацией трихлоруксусной кислоты (ТХУ) 10 %, перемешивают и оставляют на 30-40 мин. ТХУ осаждает из экстракта белки, оставляя в нем небелковые азотистые соединения. Затем фильтруют через плотный беззольный фильтр. Стакан и осадок на фильтре промывают трижды порциями раствора с массовой долей ТХУ 5 %. Затем фильтр вместе с осадком переносят в колбу Кьельдаля, добавляют туда 10 мл концентрированной серной кислоты, 5-7 кристаллов сульфата меди, 4 г сульфата калия или натрия. Одновременно с опытом ставят контроль с теми же реактивами и таким же, как в опыте фильтром, но без исследуемого материала.

Минерализацию, отгонку аммиака, титрование и расчет проводят так же, как в предыдущей работе.

Определение белкового азота в молоке имеет некоторые особенности. Во взвешенный с точностью до 0,0002 г химический стаканчик вместимостью 50 мл вносят 2-4 мл молока и еще раз взвешивают до такой же точности. Оба результата записывают. Приливают 20 мл раствора с концентрацией ТХУ 15 %, перемешивают, выдерживают 30-40 мин и фильтруют через беззольный фильтр. Стакан и осадок на фильтре трижды промывают порциями раствора с концентрацией ТХУ 5 % (раствор ТХУ вначале наливают в стакан и, тщательно ополоснув его, смыв переносят на фильтр, смачивая все его участки). Далее методика работы аналогична описанной выше.

По разности между общим азотом и белковым азотом данного биологического объекта (или пищевого продукта) находят массовую долю небелкового азота, определяемого методом Кьельдаля.

Массовую долю белка в исследуемом материале можно высчитать умножением массовой доли белкового азота на фактор пересчета азота в белок (белковый коэффициент). Последний определяют делением 100 на массовую долю азота в химически чистом белке, выделенном из конкретного биологического материала (молока, сыворотки, крови, мышц, яиц, зерна пшеницы, гороха, клубней картофеля, моркови, ягод и т.д.)

Принцип метода, ход работы и результаты анализа записывают в лабораторный журнал.

Массовые доли азота в белках некоторых биологических объектов и факторы пересчета азота в белок (белковые коэффициенты) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Массовая доля белка в биологических объектах

Наименование	Массовая доля азота в белке, %	Фактор пересчета (белковый коэффициент)
Белки молока в целом	15,65	6,38
Белки животных организмов (кроме коллагена)	16,00	6,25
Белки зерна риса	16,80	5,95
Белки зерна овса и ржи	17,15	5,83
Белки зерна сои	17,51	5,71
Белки зерна пшеницы и ячменя	17,54	5,70
Коллаген (животный белок)	17,79	5,62
Белки зерна арахиса	18,31	5,46
Белки семян подсолнечника, льна и хлопчатника	18,88	5,30

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА С БИУРЕТОВЫМ РЕАКТИВОМ

Метод основан на биуретовой реакции, образующей в щелочной среде окрашенные в фиолетовый цвет комплексы пептидных связей с ионами меди (II). Он известен в двух модификациях: макрометод и микрометод. Макрометод (макроопределение) применяют в случаях, когда содержание белка в исследуемом образце достаточно велико (1-10 мг/мл); микрометод позволяет определить в 4 мл щелочного раствора 0,1-2 мг белка. На окраску, даваемую белками, оказывают влияние соли аммония, сахароза, глицерин и др. Ниже приведено описание макрометода.

ХОД РАБОТЫ. Исследование начинают с построения калибровочного графика. Для чего готовят стандартный раствор белка (альбумина, глобулина, казеина или другого белка), содержащий 10 мг белка в 1 мл. Из стандартного раствора казеина (или другого белка) готовят в соответствии с табл. 3 ряд растворов белка известной концентрации.

Таблица 3

Разведение стандартного раствора белка

№ пробы	Объем стандартного раствора белка, мл	Объем воды, мл	Масса белка в пробе, мг	Оптическая плотность раствора
1.	-	1,0	Контроль
2.	0,2	0,8	2
3.	0,4	0,6	4
4.	0,6	0,4	6
5.	0,8	0,2	8
6.	1,0	-	10

Берут еще три пробирки и наливают в них исследуемый раствор белка: в первую – 1,0 мл, во вторую – 0,5 мл и в третью – 0,25 мл. Затем во вторую и третью пробирки добавляют соответственно 0,5 и 0,75 мл воды (объем содержимого в каждой пробирке должен быть одинаковым и составлять на данном этапе 1 мл). Таким образом, во второй и третьей пробирках получают раствор исследуемого белка, разведенный соответственно в 2 и 4 раза. Эти разведения учитывают при расчете.

В контрольную пробирку, к пробам с известной концентрацией белка, пробам исследуемого раствора белка приливают по 4 мл биуретового реактива (4 мл реактива на 1-10 мг белка). Содержимое каждой пробирки перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин для развития окраски.

Оптическую плотность растворов (экстинкцию) измеряют на ФЭКе при 540-650 нм (зеленый светофильтр) против контроля (проба № 1).

Результаты, полученные для растворов белка известной концентрации, отображают графически, откладывая по оси ординат величину оптической плотности, а по оси абсцисс – массу белка, соответствующую этой величине.

Закон Бера-Бугера-Ламберта гласит: прямая зависимость между концентрацией вещества и его оптической плотностью сохраняется в строго определенных параметрах концентраций. Для построения графика необходимо иметь усредненные данные экстинкций трех повторностей колориметрирования стандартных растворов. Соединив полученные точки прямой линией, получим калибровочный график. По калибровочному графику определяют массу белка в анализируемых пробах. На основании полученных данных рассчитывают массовую концентрацию белка в исследуемом растворе (учесть разведения).

Однако содержание белка в сырье или продукте чаще обозначают в процентах. Для пересчета полученных результатов (мг/мл) в проценты, необходимо знать массу сырья или продукта и растворителя взятых для экстрагирования белка. Например, взято 2 г пшеничной муки и тщательно размешано в 10 мл дистиллированной воды, провели экстракцию альбуминов, а затем их количественно определили по биуретовой реакции. Полученный результат – 8,2 мг/мл. Содержание альбуминов пшеничной муки определяется по формуле:

С = ^8,2^·^V^{· 100},

^{1000 ·}^m

где, V – объем экстракта альбуминов муки;

m – масса навески муки;

1000 – коэффициент пересчета мг на г;

100 – коэффициент пересчета на 100 г муки.

При оформлении работы кратко описывают принцип метода. Поясняя на своем примере методику определения по калибровочному графику массы белка в пробе. На основании полученных данных составляют формулу для расчета массовой концентрации белка в исследуемом растворе.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; биуретовый реактив (в мерную колбу вместимостью 1 л вносят 500 мл воды, последовательно растворяют в ней 1,5 г кристаллогидрата сульфата меди и 6,0 г кристаллогидрата тартрата калия-натрия; приливают медленно при постоянном перемешивании 300 мл раствора с массовой долей гидроксида натрия 10 % (свободного от карбонатов); для предотвращения образования осадка оксида меди (I) добавляют 1,0 г иодида калия; содержимое колбы доводят до метки водой и перемешивают; хранят реактив в парафиновой или пластиковой посуде); стандартный раствор казеина или другого белка, содержащий 10 мг белка в 1 мл (в мерной колбе вместимостью 100 мл взбалтывают с 60 мл воды 1,0 г чистого казеина и при помешивании добавляют 10-12 мл раствора с концентрацией гидроксида натрия 0,2 моль/л до растворения казеина; затем приливают по каплям при помешивании 10-12 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 0,1 моль/л до pH 7, содержимое доводят до метки водой и перемешивают); раствор исследуемого белка; серная кислота конц.; сульфат меди; сульфат калия или натрия; пероксид водорода; растворы с массовыми долями: гидроксида натрия 40 % , трихлоруксусной кислоты (ТХУ) 15, 10 и 5 %; борной кислоты 4 %; раствор с концентрацией соляной кислоты 0,1 моль/л (или серной кислоты = 0,05 моль/л); смешанный индикатор, или индикатор Таширо (0,2 г метилового красного и 0,1 г метилового синего растворяют в 100 мл этанола).
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Перечислите группы методов количественного определения белков.

2. Общая характеристика метода Кьельдаля и его этапов.

3. Техника проведения минерализации, и её химизм.

4. Техника и химизм отгонки аммиака.

5. Техника и химизм титрования. Расчет массы белка.

6. Назовите физические методы количественного определения белка и расскажите на чем они основаны.

7. Какие Вы знаете колориметрические (физико-химические) методы количественного определения белков? На чем они основаны?

8. Техника приготовления основного и стандартного растворов белка.

9. Техника проведения биуретовой реакции со стандартными и исследуемыми растворами белков.

10. Принцип и техника построения калибровочного графика. Минимум повторностей для построения калибровочного графика.

11. Методика и техника определения количества белка в исследуемом сырье или продукте колориметрическим методом.

Закон Бера-Бугера-Ламберта, его практическое значение для построения калибровочного графика и количественного определения белка в сырье или продукте по калибровочному графику.

2.3. Выделение белков из биологических объектов
Процесс выделения белков включает следующие операции:

измельчение биологического материала до однородной (гомогенной) массы (растения, органы и ткани животных, микроорганизмы);
перевод белков в растворенное состояние (наиболее часто извлечение белков производят при одновременном измельчении биологического объекта);
осаждение из раствора отдельных фракций (групп) белков;
выделение индивидуального белка из смеси других белков.

Операции по выделению белков производят при температуре около 5 С с применением химических реагентов, щадящих нативную конформацию молекулы белка (применение кислот и щелочей, растворов солей тяжелых металлов для экстрагирования белков недопустимо).
ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОСТЫХ БЕЛКОВ
Простые белки – протеины, состоят только из остатков α-аминокислот соединенных пептидными связями. Протеины выполняют разные функции в организме: структурную, каталитическую, регуляторную, защитную, сократительную и т. д. Протеины различаются аминокислотным составом и разделены на группы по способности к растворению в различных растворителях.

Альбумины – белки хорошо растворимые в воде и в водных растворах нейтральных солей и сульфата аммония с концентрацией 4-10 % и выпадают в осадок из этих растворов при насыщении их этими же солями и сульфатом аммония. Альбумины содержатся в клетках всех организмов.

Глобулины – не растворимы в воде, хорошо растворимы в водных растворах нейтральных солей и сульфата аммония с концентрацией 4-10 %, выпадают в осадок при полунасыщении этих растворов. Глобулины встречаются во всех видах организмов, наиболее распространены в растениях, особенно много их в семенах бобовых.

Проламины – хорошо растворимы в растворе с массовой долей этанола 60-80 % . Эта группа белков найдена только в растениях и только в семенах злаковых.
ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ ИЗ СЕМЯН ЗЛАКОВЫХ И БОБОВЫХ
ВЫДЕЛЕНИЕ АЛЬБУМИНОВ. Ход работы. В пробирки вносят по 1 г: в первую – пшеничной или ячменной муки, во вторую – гороховой. В обе наливают по 10 мл воды, перемешивают и ставят в термостат при температуре 37-38 °С на 30 минут, перемешивая содержимое пробирок через каждые 6-10 минут. По истечении указанного времени содержимое пробирок вместе с осадком переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут со скоростью 3000 об/мин или фильтруют через складчатый фильтр. Полученный прозрачный раствор альбуминов сливают в чистые сухие пробирки и используют для проведения биуретовой реакции (см. стр. 20). По интенсивности окраски делают вывод о содержании альбуминов в исследуемых объектах.

Если к 1 мл раствора альбуминов пшеничной или гороховой муки добавить по 4 мл насыщенного раствора хлорида натрия то белки выпадут в осадок, вначале в виде мути медленно оседающей на дно пробирки. Результаты записать в журнал.

ВЫДЕЛЕНИЕ ГЛОБУЛИНОВ. Ход работы. В пробирки вносят по 1 г: в первую – пшеничной или ячменной муки, во вторую – гороховой. В обе наливают по 10 мл раствора хлорида натрия с массовой долей 10 %, перемешивают и ставят в термостат при температуре 37-38 °С на 30 минут, перемешивая содержимое пробирок через каждые 6-10 минут. По истечении указанного времени содержимое пробирок вместе с осадком переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут со скоростью 3000об/мин или фильтруют через складчатый фильтр. Полученный прозрачный раствор глобулинов сливают в чистые сухие пробирки и используют для проведения биуретовой реакции (см. стр. 20). По интенсивности окраски делают вывод о содержании глобулинов в исследуемых объектах.

Если к 1 мл раствора глобулинов пшеничной или гороховой муки добавить по 1 мл насыщенного раствора хлорида натрия то белки выпадут в осадок, вначале в виде мути медленно оседающей на дно пробирки. Результаты записать в журнал.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОЛАМИНОВ. Ход работы. В пробирки вносят по 1 г: в первую – пшеничной или ячменной муки, во вторую – гороховой. В обе наливают по 10 мл раствора этанола с массовой долей 70 %, перемешивают и ставят в термостат при температуре 37-38 °С на 30 минут, перемешивая содержимое пробирок через каждые 6-10 минут. По истечении указанного времени содержимое пробирок вместе с осадком переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут со скоростью 3000об/мин или фильтруют через складчатый фильтр. Полученный прозрачный раствор проламинов сливают в чистые сухие пробирки и используют для проведения биуретовой реакции (см. стр. 20). По интенсивности окраски делают вывод о содержании проламинов в исследуемых объектах.

Если к 2 мл раствора проламинов пшеничной или гороховой муки добавить по 2 мл воды, то белки выпадут в осадок, раствор мутнеет. Результаты записать в табл. 4. Таблица 4

Содержание простых белков в пшенице и горохе

Объекты исследования

Простые белки

Альбумины

Глобулины

Проламины

Мука пшеничная

Горох

РЕАКТИВЫ. Растворы с массовыми долями: хлорида натрия 10 %, этанола 70 %, гидроксида натрия 10 %, сульфата меди 1 %, насыщенный раствор хлорида натрия.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Строение простых белков (протеинов).

2. Какие функции выполняют протеины?

3. Какой принцип положен в основу деления протеинов на группы?

4. Общая характеристика альбуминов.

5. Общая характеристика глобулинов.

6. Общая характеристика проламинов.

7. Назовите основные операции выделения простых белков.

8. Значение превращения биологического материала в гомогенную массу.

9. Что происходит с молекулами выделяемого белка во время настаивания в термостате?

10. Какие условия выделения обеспечивают сохранение нативной конформации молекул белка?

11. Выделение, обнаружение и осаждение альбуминов.

12. Выделение, обнаружение и осаждение глобулинов.

13. Выделение, обнаружение и осаждение проламинов.

14. Какие из выделяемых белков содержатся в пшеничной муке и горохе.
2.4. Реакции осаждения белков
Стабильность белковых растворов обусловлена двумя основными факторами: наличием заряда белковой молекулы и, обусловленной зарядом, гидратной оболочки вокруг нее. Устранение этих факторов приводит к осаждению белка из раствора. Реакции осаждения белков делят на две группы: обратимые и необратимые.

При необратимых реакциях осаждения белки подвергаются денатурации и, утрачивая свои нативные свойства, теряют способность растворяться в первоначальном растворителе. К этим реакциям относят: осаждение белков кислотами, солями тяжелых металлов, при нагревании и др.

При обратимых реакциях осаждения молекулы белка не подвергаются глубоким изменениям (разрушаются четвертичная и до 30 % третичной структуры), сохраняют свои нативные (первоначальные) свойства и полученные осадки можно вновь растворить в первоначальном растворителе. К названным реакциям относят: осаждение белков этанолом и ацетоном при температуре минус 35С, высаливание (осаждение белков нейтральными солями – NaCl, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄) и др.

Реакции осаждения применяют для обнаружения белка в растворе, получения безбелковых фильтратов (например, при определении сахаров в молоке или крови), выделения из раствора отдельных групп белков (фракционирования белков).

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ ПРИ НАГРЕВАНИИ

При температуре выше 50 С многие белки денатурируют и выпадают в осадок. Наиболее полное и быстрое осаждение их при нагревании происходит в изоэлектрической точке (ИЭТ). В сильно кислых (за исключением азотной, ТХУ и сульфосалициловой кислот) и сильно щелочных растворах денатурированный при нагревании белок не выпадает в осадок. Это объясняют усилением заряда (или перезарядкой) молекул белка. Осадить белок из сильно кислых растворов можно добавлением растворов нейтральных солей.

ХОД РАБОТЫ. В пять пробирок вносят по 1мл раствора белка яиц (альбумина). Альбумин яиц – кислый белок и в нейтральной среде имеет отрицательный заряд.

Содержимое первой пробирки нагревают. Жидкость мутнеет (появление опалесценции), но осадок не образуется или его очень мало. Это объясняют тем, что частицы белка в нейтральной среде имеют отрицательный заряд и удерживаются во взвешенном состоянии.

Во вторую пробирку добавляют две капли раствора с массовой долей уксусной кислоты 1 % и нагревают. Выпадает белый хлопьевидный осадок белка. Это объясняют тем, что pH среды приближается к изоэлектрической точке и молекула белка теряет заряд.

В третью пробирку добавляют две капли раствора с массовой долей уксусной кислоты 10 % и содержимое нагревают. Осадок белка в этом случае не образуется, так как в сильно кислой среде частицы белка приобретают значительный положительный заряд.

В четвертую пробирку добавляют две капли раствора с массовой долей уксусной кислоты 10 %, одну каплю раствора насыщенного хлоридом натрия и нагревают. Выпадает белый хлопьевидный осадок, так как вследствие адсорбции ионов хлорида натрия (образование двойного электрического слоя) происходит нейтрализация положительного заряда на частицах белка; наступает момент, когда силы притяжения между молекулами превышают силы отталкивания, и белок выпадает в осадок.

В пятую пробирку добавляют две капли раствора с массовой долей гидроксида натрия 10 % и нагревают. Осадка белка не образуется, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка усиливается.

Нагревание пробирок производят в кипящей водяной бане (лучше всех пробирок одновременно). Желатин при нагревании в осадок не выпадает. Результаты опыта и выводы оформляют в виде таблицы.

Таблица 5

Осаждение белков при нагревании

№ пробирки	Реакция среды	Наблюдаемые изменения	Причина изменений
1.	Нейтральная
2.	Слабокислая
3.	Сильнокислая
4.	Сильнокислая + NaCl
5.	Щелочная

ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

Концентрированные минеральные кислоты (кроме ортофосфорной) вызывают необратимое осаждение белков. Это объясняют как явлениями дегидратации молекул белка, так и рядом других причин (денатурация, образование нерастворимых солей и др.). В избытке минеральных кислот, кроме азотной, выпавший остаток белка растворяется. Желатин не осаждается минеральными кислотами.

ХОД РАБОТЫ. В три пробирки вносят 1,5-2,0 мл следующих концентрированных кислот: в первую – соляной, во вторую – серной, в третью – азотной. Затем, наклонив пробирки под углом 45, осторожно по стенке наслаивают 0,5-1,0 мл раствора белка (молоко или раствор яичного белка). На границе соприкосновения двух слоев образуется осадок в виде белого кольца. Пробирки осторожно встряхивают и наблюдают за состоянием осадка. Осадок, выпавший при действии азотной кислоты, увеличивается, а осадки, выпавшие при действии соляной и серной кислот, растворяются в их избытке. Результаты этой и всех последующих реакций вносят табл. 6.

следующая страница>

Объекты исследования	Простые белки
Объекты исследования	Альбумины	Глобулины	Проламины
Мука пшеничная
Горох