СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ лабораторной ДИАГНОСТИКИ СИФИЛИСА И ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

О.В.Панкратов, В.Г.Панкратов

БелМАПО, БГМУ, г. Минск

Мед. новости. – 2006. – №12. – С. 35-39.
Клинический диагноз сифилиса требует обязательного лабораторного подтверждения [1–6]. Все методы лабораторной диагностики сифилиса можно условно разделить на:

• 
  Методы непосредственного выявления возбудителя в материале из очагов поражения (прямые тесты) :
  

- темнопольная микроскопия;

- молекулярно-биологические методы детекции ДНК бледной трепонемы (полимеразная цепная реакция или ДНК-зондирование);

- заражение кроликов инфицированным материалом от больных;

• 
  Методы серологической диагностики сифилиса, базирующиеся на выявлении антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови ( или в спинномозговой жидкости;
  
• 
  Гистоморфологические методы.
  

Обнаружение бледной трепонемы в отделяемом сифилидов проводится методом микроскопирования полученных препаратов в темном поле. Исследование базируется на феномене Тиндаля: если в тёмное помещение пропустить через узкую щель луч солнечного света, то мелкие пылинки, невидимые при обычном освещении, начинают ярко светиться [2, 6]. Для проведения исследования пользуются специальным тёмнопольным конденсором при объективе Х40 и окуляре Х 10 (Х15). Этому исследованию отводится важное значение, так как с помощью темнопольного микроскопа проводится исследование бледной трепонемы в живом виде, что позволяет дифференцировать её от других трепонем по морфологическим признакам и характеру движения. Материалом для бактериологического исследования на бледную трепонему является тканевая жидкость (серум), поскольку бледные трепонемы располагаются между волокнами соединительной ткани, вокруг лимфатических и кровеносных сосудов, в стенках и просветах лимфатических капилляров.

Исследованию на бледную трепонему подлежат все высыпные элементы, подозрительные на первичные и вторичные сифилиды (эрозивные и язвенные шанкры, мокнущие и эрозивные папулы, широкие кондиломы на коже и слизистых оболочках рта, половых органов и анальной области). При невозможности исследования высыпных элементов рекомендуется проводить пункцию увеличенного регионарного лимфатического узла.

Сифилиды, подлежащие исследованию на бледную трепонему, очищают марлевым тампоном, смоченным изотоническим раствором хлорида натрия, и подсушивают обработанную поверхность сухим тампоном. Затем осторожно массируют исследуемый элемент сыпи платиновой лопаточной или вольфрамовой петлей до появлении тканевой, слегка опалесцирующей жидкости. Тканевую жидкость можно получить и путём сдавливания эрозии или язвы пальцами в резиновой перчатке. Если трепонема не найдена, особенно если больной занимался местным лечением, следует назначить на 1-2 дня влажно-высыхающие повязки с изотоническим раствором хлорида натрия и затем повторить исследование. Полученный серум исследуют в нативном препарате в темном подле зрения или в виде окрашенных препаратов. Каплю полученного серозного экссудата помещают в центре тонкого обезжиренного предметного стекла и покрывают покровным стеклом, при этом капля не должна выходить за пределы покровного стекла. Между линзой темнопольного микроскопа и покровным стеклом помещают маленькую каплю иммерсионного масла, с которой и контактирует линза микроскопа. Яркого освещения препарата добиваются поворотами зеркала и движениями тубуса микроскопа. В темном поле должны появиться движущиеся светящиеся частицы, эпителиальные клетки, лейкоциты. Бледная трепонема выглядит в виде тонкой спирали или тонкого нежного пунктира, с серебристым оттенком. Она совершает плавные движения. Treponema pallidum следует отличать от Tr. refringens, которая может встречаться на половых органах и в полости рта. Последняя выглядит более толстой, имеет широкие, грубые, неравномерные завитки (5-7 завитков), отличается резкими беспорядочными движениями. А.Н.Родионов (1997) обращает внимание на необходимость дифференцировать бледную трепонему с 3 разновидностями зубных трепонем, при исследовании материала из полости рта: Tr. microdentium (она короче и толще бледной трепонемы, она сильнее преломляет свет и имеет заостренные завитки, перемещается медленнее без сгибательных движений); Tr. buccalis (имеет от 3 до 10 широких неравномерных завитков, сильно преломляет свет, активно двигается); Tr. vincenti (тонкая и нежная трепонема с плоскими неравномерными 2-3 завитками, движется активно, хаотично, ярко светится) [6].

Поскольку бледная трепонема плохо окрашивается анилиновыми красками, то препараты окрашивают или по Романовскому-Гимзе или серебрением бледных трепонем по Морозову.

Г.А.Дмитриев и Н.В.Фриго (2004) отмечают, что при необходимости микроскопия возбудителя в темном поле может быть дополнена прямой реакцией иммунофлюоресценции [2]. При этом на запарафинированные мазки или биопсийный материал накладываются меченные флюоресцирующим красителем противотрепонемные антитела, а образующиеся комплексы антиген-антитело исследуют под люминесцентным микроскопом.

Прямые методы диагностики сифилиса весьма применимы и для подтверждения врожденного сифилиса. Для прямой визуализации бледной трепонемы в тёмном поле можно исследовать содержимое пузырей при ладонно-подошвенной сифилитической пузырчатке, серума с раздраженных папул, амниотическую жидкость, выжатый сок плаценты, ткань пуповины, органы плода [2].

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет выявить единственную молекулу ДНК бледной трепонемы среди сотен тысяч других молекул. Суть метода состоит в амплификации (размножении) в пробирке отдельных участков ДНК трепонемы в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом этапе вновь синтезированные молекулы копируются ферментом ДНК-полимеразой, что приводит к многократному удвоению специфических фрагментов ДНК. Детекция этих фрагментов проводится методом электрофореза в агаровом геле (т.е. разделение молекул ДНК по молекулярному весу). ПЦР-тест для выявления ДНК бледной трепонемы был разработан в 1991 году. Метод ПЦР является высоко специфичным, чувствительным и воспроизводимым, при грамотном техническим исполнении и хорошей подготовкой образцов он практически не дает ложных результатов и очень оправдан для диагностики сифилиса при небольшом количестве трепонем в исследуемом материале, что особенно ценно при диагностике врожденного сифилиса. И хотя у ПЦР пока исследовательский статус, но уже в недалеком будущем эта реакция стать ведущим лабораторным тестом в диагностике сифилиса [3].

Метод ДНК-зондирования или гибридизации нуклеиновых кислот базируется на использовании, как и в методе ПЦР, искусственно синтезированных нуклеотидов, которые называются не праймерами, а зондами [2]. Вначале из образцов клинического материала выделяют ДНК, потом её кипятят (денатурируют) и фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре. Затем идёт этап гибридизации с ДНК-зондом, способным специфически гибридизироваться с ДНК искомого возбудителя. На концах зонда имеются метки в виде сульфоновых групп или биотина, против которых имеются моноклональные антитела. После окончания гибридизации фильтр проявляют иммуноферментным методом путём последовательного добавления коньюгата и субстрата. Окрашивание в соответствующих точках свидетельствует о наличии тестируемой ДНК в исследуемом образце.

Заражение сифилисом лабораторных животных как метод прямой детекции бледной трепонемы уже давно не применяется для клинической лабораторной диагностики сифилиса из-за дороговизны, трудоёмкости, длительности получения результата, необходимости содержания вивария. Наиболее чувствительным и удобным лабораторным животным для привития сифилиса является кролик. Заражение кроликов производят инокуляцией инфекционного материала в яичко. Чувствительность кроликов к инфекции Treponema pallidum достигает 100 % , если во взятом материале для прививки содержится достаточное количество бледных трепонем. В настоящее время он используется только в крупных исследовательских центрах в качестве «золотого стандарта» для оценки чувствительности других тестов.

Серологическими методами выявляются антитела к бледной трепонеме. Эти методы подразделяются на нетрепонемные (скрининговые) и трепонемные (диагностические) [1, 2, 3, 4, 5, 8].

Нетрепонемные тесты делятся на реакцию связывания комплемента (РСК) – реакцию Вассермана с липидными антигенами и флокуляционные реакции. Наиболее известными нетрепонемными тестами с визуальной расшифровкой результатов исследования являются:

• 
  Реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк);
  
• 
  Микрореакция преципитации (МРП) с плазмой или инактивированной сывороткой;
  
• 
  RPR – тест быстрых плазменных реагинов (Rapid Plasma Reagins);
  
• 
  TRUST-тест с толуидиновым красным и непрогретой сывороткой (Toluidin Red Unheated Serum Test);
  
• 
  RST-тест – тест отбора реагинов (Reagin Screen Test);
  

Среди нетрепонемных тестов имеются 2 теста с микроскопическим считыванием результатов реакции:

• 
  VDRL – Venereal Disease Research Laboratory;
  
• 
  USR – тест определения активных реагинов плазмы (Unheated Serum Reagins).
  

С помощью этих тестов выявляются IgM и IgG антитела (реагины) к липидам клеточной стенки бледной трепонемы, которые появляются в крови в количестве достаточном для определения этими реакциями примерно через неделю после появления твердого шанкра [3].

Скрининговые тесты имеют свои плюсы и минусы. К плюсам нетрепонемных тестов можно отнести их невысокую стоимость, сравнительно короткое время для получения ответа при постановке отдельных тестов, пригодность для проведения скрининга большого количества образцов, кроме того, ряд современных нетрепонемных тестов выпускаются уже стандартизированными. К минусам большинства нетрепонемных тестов относят их сравнительно низкую чувствительность при первичном (70-90 %) и позднем (30-50 %) сифилисе, наличие феномена прозоны в отдельных случаях (появление ложно отрицательных или слабо положительных результатов при наличии избыточного количества антител в неразведенной исследуемой сыворотке (блокировка реакции антиген-антитело), в то время как при разведении исходной сыворотки получаются резко положительные результаты); сложность, громоздкость и длительность постановки РСК. В настоящее время считается, что положительные результаты нетрепонемных тестов не могут считаться достаточными для постановки диагноза сифилитической инфекции без дополнительного подтверждения в трепонемных тестах. Нетрепонемные тесты дают ложноположительные результаты до 2,5 %, чаще у женщин. Основными причинами ложноположительных нетрепонемных тестов являются: аутоиммунные заболевания (ревматизм, системная красная волчанка, системная склеродермия, узелковый периартериит, криоглобулиновая пурпура, саркоидоз), онкологические заболевания и болезни крови, некоторые вирусные и бактериальные инфекции, малярия, цирроз печени, наркомании, алкоголизм, беременность, эндокринные заболевания (сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит), старческий возраст и др.

Специфические серологические тесты называются трепонемными, потому что они предполагают применение антигенов трепонемного происхождения. К ним относятся:

• 
  Реакция связывания комплемента (реакция Вассермана) с трепонемным антигеном – РСКт;
  
• 
  Реакция иммобилизации бледных трепонем – РИБТ или РИТ, в зарубежной литературе она идет под названием TPI (Treponema pallidum immobilization test);
  
• 
  Реакция иммунофлюоресценции – РИФ, в зарубежной литературе называется FTA (Fluorescent treponemal antibody). Она применяется в нескольких модификациях: РФИ-200 (FTA-200); РИФ-абс (FTA-abs, FTA-abs double staining; FTA-abs IgM; 19S (IgM)-FTA-abs); РИФц – реакция иммунофлюоресценции с цельной кровью или спинномозговой жидкостью;
  
• 
  Реакция пассивной гемагглютинации – РПГА, в зарубежной литературе известна под названием TPHA (Treponema pallidum haemagglutination assay);
  
• 
  Иммуноферментный анализ - ИФА, за рубежом называется ELISA – Enzymelynked immunosorbent assay);
  
• 
  Иммуноблотинг, в зарубежной литературе называется Western Blot.
  

Диагноз первичного сифилиса должен подтверждаться обнаружением бледной трепонемы в отделяемом твердого шанкра или в соке увеличенных регионарных лимфоузлов (тёмнопольная микроскопия или ПЦР). Первичный сифилис характеризуется ранней выработкой специфических IgM-антител, которые обнаруживаются уже к концу второй недели после заражения, в то время как IgG-антитела начинают вырабатываться через 4 недели после заражения. Трепонемоспецифические IgM-антитела выявляются уже на третьей-четвертой неделе после заражения одним из методов IgM-серологии (IgM-РИФ-абс, IgM-ИФА c ловушкой, 19S-IgM-FTA-авс, IgM-Western blot), диапазон чувствительности которых колеблется от 92 % до 98 % (Б.Л.Шмидт, Г.А.Дмитриев, Н.В.Фриго). КСР, включая МРП, может давать отрицательный результат. Повторение анализа через 5-7 дней усилит уверенность врача в правильности диагноза при позитивации МРП, КСР и положительном результате ИФА-IgG. РИФ-200, РИФ-абс обычно уже положительные. РИФ, ИФА, РПГА дают положительные результаты на стадии первичного сифилиса у 80-88 %.

На стадии вторичного и раннего скрытого сифилиса КСР, МРП, ИФА, РИФ-200, РИФ-абс, РПГА дают положительные результаты с высокими титрами антител. По мере «старения» инфекции (18-24 месяца после заражения) титры антител по нетрепонемным тестам и IgM-тестам снижаются вплоть до отрицательных результатов (РСК_к, МРП, IgM-ИФА, IgM-РИФ-абс). После лечения больных вторичным и ранним скрытым сифилисом трепонемные тесты (РИФ, РИТ, ИФА, РПГА) могут сохраняться положительными годами и десятилетиями.

При позднем скрытом и висцеральном сифилисе, позднем нейросифилисе МРП не показательна, так как может быть отрицательной, слабо положительной или положительной с низкими титрами антител. ИФА-IgG у этих больных положительная с высокими титрами антител, а ИФА-IgM практически всегда даёт отрицательный результат. РСК с трепонемным антигеном положительная с низкими титрами антител. РИФ, РИТ и РПГА положительные практически у 100 % больных. Диагностика нейросифилиса сегодня проводится на основании клинических признаков, результатов томографического исследования структур головного и спинного мозга (КТ или ЯМР), результатов морфобиохимических и серологических исследований спинномозговой жидкости, при этом наиболее чувствительными серологическими тестами выступают РИФ-ц, РВ, ИФА-IgG+IgM, ИФА-IgG. Б.Л.Шмидт (2003) считает, что измерение индекса РПГА, отражающего местную продукцию антител в спинномозговой жидкости, может иметь диагностическую ценность при поздних скрытых и маломанифестных формах нейросифилиса.

Если у беременной после лечения в процессе клинико-серологического наблюдения отмечается динамическое снижение титров антител по всем реакциям, включая РИФ и РИТ, особенно если процент иммобилизации в РИТ спустя 6-12 месяцев после лечения менее 30 %, профилактическое лечение беременных мы обычно не проводим.

При раннем врожденном сифилисе МРП, РПГА и ИФА дают положительный результат. Ориентироваться только на выявление у этих детей IgM-антител пока рано, так как применявшиеся нами тест-системы для определения противотрепонемных IgM-антител (РекомбиБест-антипаллидум-IgM-стрип производства АО «Вектор-Бест) нуждаются в доработке, поскольку обладают недостаточной чувствительностью и могут давать отрицательный результат при наличии врожденного сифилиса у грудного ребёнка. В таких случаях в качестве подтверждающих реакций лучше использовать РВ с трепонемным антигеном, РИФ-200, РИФ-абс, РПГА или РИТ в сочетании с ИФА в повторных постановках у матери и у ребенка. В пользу наличия врожденного сифилиса у ребенка будут говорить положительные результаты МРП, РВ, РИФ, РПГА или РИТ и ИФА с титрами антител на уровне материнских или выше. В последние годы ряд исследователей подчёркивают, что помочь в диагностике раннего врожденного сифилиса могут результаты темнопольной микроскопии и ПЦР-диагностики следующих материалов: отделяемого слизистой оболочки носа ребенка при наличии сифилитического насморка, отделяемого папул и содержимого везикул (сифилитическая пузырчатка), сока плаценты, ткани пуповины и амниотической жидкости.

Лабораторное подтверждение позднего скрытого сифилиса обеспечивается прежде всего результатами трепонемных тестов (РИФ-200, РИФ-абс, РИТ, ИФА-IgG и ИФА–общие антитела, РПГА), которые положительные и резко положительные у 100 % больных. Нетрепонемные тесты могут вести себя по разному – от положительных и слабо положительных до отрицательных результатов.

ТРАКТОВКА РЕЗУЛЬТАТОВ СЕРОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

При обследовании пациентов с подозрением на сифилис или контактов больных сифилисом иногда возникают проблемы с трактовкой серологических анализов. При этом следует учитывать одновременно нетрепонемные скрининговые и трепонемные подтверждающие тесты. При этом возможны 4 комбинации нетрепонемных (НТТ) и трепонемных (ТТ) тестов [7]:

1. 
   НТТ – отрицательные, ТТ – отрицательные. Подобное сочетание может наблюдаться в следующих случаях.
   

а) Обследуемый пациент здоров и никогда не страдал сифилисом.

б) Первичный сифилис на первой неделе развития. Показано, что у 30-40 % больных с положительными результатами темнопольной микроскопии определяются отрицательные НТТ и у 25 % - отрицательные ТТ [7].

в) Больные первичным сифилисом после лечения. Спустя 6-12 месяцев после лечения НТТ становятся отрицательными практически у 98-100 %, а ТТ – у 25-50 % больных. [2, 9].

г) Отрицательные НТТ и ТТ могут наблюдаться у ВИЧ-инфицированных в стадии активного сифилиса при феноменах Hass и Hick вследствие отсроченной сероконверсии [7].

2. НТТ – отрицательные, а ТТ – положительные. Такое сочетание серологических тестов может наблюдаться при ранних формах манифестного сифилиса после успешного лечения, у больных первичным сифилисом, когда сероконверсия НТТ отстает от таковой при ТТ; при вторичном сифилисе и феномене прозоны; при позднем нелеченном сифилисе НТТ бывают отрицательными у 20-40 % больных; при биологически ложноположительных ТТ, наблюдающихся у больных аутоиммунными заболеваниями, у онкологических и инфекционных больных, у беременных; в терминальной стадии ВИЧ-инфекции.

3. НТТ – положительные, ТТ – отрицательные. Это сочетание чаще всего встречается при биологически ложноположительных серологических реакциях у указанных выше контингентов больных аутоиммунными, онкологическими и инфекционными заболеваниями, лепрой; а также у людей преклонного возраста, у наркоманов [1, 7].

4. Сочетание положительных НТТ и ТТ наблюдается у нелеченных больных сифилисом в любой стадии инфекции, у леченных больных поздним сифилисом, серорезистентным сифилисом, при других трепонематозах (фрамбезия, беджель, пинта), при боррелиозе, ложноположительные НТТ и ТТ у больных системной красной волчанкой и другими заболеваниями с аномальной или избыточной продукцией антител.

Опыт показывает [1, 5], что интерпретация результатов серологических реакций должна проводиться в каждом конкретном случае с учетом анамнеза, клиники, общего состояния здоровья, проведенного лечения, сопутствующих заболеваний и др.. Нельзя забывать, что наряду с ложноположительными встречаются и ложноотрицательные серологические реакции. Такое может наблюдаться в серонегативной фазе первичного сифилиса, при выраженной иммунной недостаточности, в том числе и у ВИЧ-инфицированных, при избытке антител (феномен прозоны), у больных со злокачественным течением вторичного сифилиса, при длительном приёме иммунодепрессантов. Разобраться в истине могут помочь современные иммуноферментные тест-системы, выявляющие раздельно IgM и IgG-антитела к бледной трепонеме.

Гистоморфологические методы.

Гистологическая картина твердого шанкра характеризуется отсутствием эпидермиса, а на границе шанкра эпидермис истончен и пронизан лимфоидными и плазматическми клетками. В дерме определяется компактный инфильтрат из плазматических клеток и лимфоцитов с резко измененными кровеносными и лимфатическими сосудами. Отдельные сосуды полностью облитерированы. Бледные трепонемы после специальной окраски препаратов выявляются в большом количестве, особенно внутри и вокруг стенок капилляров и лимфатических сосудов. В сифилитическом бубоне гистологически выявляется воспалительный инфильтрат, содержащий большое количество плазматических клеток. Могут наблюдаться небольшие гранулёмы. При серебрении в инфильтрате обнаруживается большое количество бледных трепонем.

Розеолезные сифилиды втричного периода не имеют специфичной гистологической картины: умеренный воспалительный инфильтрат из лимфоцитов, гистиоцитов и плазматических клеток с преимущественным расположением вокруг сосудов сосочкового слоя дермы. Папулёзные сифилиды отличаются выраженным инфильтратом из лимфоцитов и плазматических клеток, располагающимся вокруг сосудов и волосяных фолликулов. Эндотелий сосудов гиперплазирован, отёчен. В папулах рецидивного сифилиса нередко обнаруживаются эпителиоидно-клеточные гранулёмы с наличием в них гигантских клеток.

Для широких кондилом типичным является акантоз с расширением и удлинением эпидермальных отростков.

Как справедливо отмечает А.Н.Родионов (1997), «характерным гистологическим признаком третичного сифилиса является образование инфекционной гранулёмы, состоящей из лимфоцитов, плазматических клеток, гистиоцитов, фибробластов и различного количества эпителиоидных и гигантских клеток» [6]. Особенно массивный инфильтрат наблюдается в центре очага, а по периферии располагается больше периваскулярно. Стенки сосудов пролиферированы, а просвет последних сужен. При бугорковом третичном сифилиде казеозный некроз выражен слабо или отсутствует. В центре гранулёмы гуммозного инфильтрата виден массивный казеозный некроз. Вокруг очагов некроза скапливается большое количество эпителиоидных и гигантских клеток. Следует признать, что дифференциальная диагностика гистологических изменений при бугорковом сифилиде и вульгарной волчанке, гуммозном третичном сифилиде и скрофулодерме, а также индуративной эритеме представляет серьёзные трудности, при трактовке гистоморфологических изменений необходимо обязательно учитывать к4линические и лабораторные данные в каждом конкретном случае.

Литература

1. 
   Аковбян В.А., Прохоренков В.И., Новиков А.И., Гузей Т.Н. Сифилис. Иллюстрированное руководство (ред. В.И.Прохоренков). –М.: Медкнига. -2002. – С. 194-201.
   
2. 
   Дмитриев Г.А., Фриго Н.В. Сифилис. Дифференциальный клинико-лабораторный диагноз. – М.: Медицинская книга. – 2004. – С. 26-45.
   
3. 
   Лосева О.К., Ловенецкий А.Н. Эпидемиология, клиника, диагностика и лечение сифилиса. Руководство для врачей. -М. 2000. – 62 с.
   
4. 
   Панкратов В.Г., Панкратов О.В., Навроцкий А.Л., Крукович А.А. и соавт Серологическая диагностика сифилиса: состояние и перспективы. // Рецепт (приложение: Международная научно-практическая конференция «Современные подходы к диагностике, лечению и профилактике инфекций, передаваемых половым путём», Гродно, 2005) – 2005. – С.165-169.
   

5. Панкратов В.Г., Панкратов О.В., Крукович А.А., Журавская Л.В., Ховратович М.В. Возможности и перспективы серологической диагностики сифилиса в Республике Беларусь. // Здравоохранение. – 2006. - № 6. – С. 35 – 39.

6. Родионов А.Н. Сифилис. Руководство для врачей. – СПб. : Питер. – 1997. – С. 226-245.

7. Хурадо Р.Л. Серология сифилиса: практический подход // ЗППП. – 1997. - № 3.– С. 3-10.

8. Шмидт Б.Л. Современная серология сифилиса // Первый Российский конгресс дерматовенерологов: Тезисы научных работ. – СПб. – 2003. Том II. – С. 40-41.

9. Romanowski B., Sutherland R., Flick G.H. et al. // Ann. Intern. Med. -1991. -Vol. 114/. –P. 1005-1009.