Оптические и электрохимические методы анализа
В лабораторной практике широко применяются оптические и электрохимические методы анализа. Все они связаны с использованием соответствующей аппаратуры. Приборы для исследования химического состава вещества называются оптическими анализаторами состава. К ним относятся поляриметры, рефрактометры, фотометры различных типов, которыми пользуются в химических, биохимических, гигиенических, клинических и научно-исследовательских лабораториях.

1. Поляриметрия. Поляриметрия – определение количества различных оптически активных веществ (глюкоза, белок), обладающих способностью отклонять плоскость поляризации светового луча от прямого направления вправо или влево.

От источника света лучи распространяются в различных плоскостях (рис.1). Волны их расходятся в виде конуса, вершиной которого является источник света (). Если на пути светового луча поставить экран (), то его изображение будет иметь форму круга. Если поставить на пути световых волн трехгранную призму (), называемую поляризатором, то прошедшие сквозь неё световые волны расположатся в одной плоскости, называемой плоскостью поляризации. Если поставить экран на пути поляризованного луча, то его изображение будет иметь вид прямой вертикальной линии.

Если же мы поставим на пути поляризованного луча сосуд с жидкостью (), содержащий глюкозу, которая обладает свойством вращать плоскость поляризации вправо, то поляризованный луч, пройдя через раствор глюкозы, отклонится. На экране он отобразится в виде наклонённой вправо прямой. Угол между вертикалью и наклонённой прямой тем больше, чем больше глюкозы содержится в растворе. Не все сахара вращают плоскость поляризации вправо. Фруктоза, например, отклоняет её влево. Белки также отклоняют плоскость поляризации влево.

Поляриметрическое определение количества глюкозы и других веществ в растворе основано на измерении величины угла отклонения плоскости поляризации. Это измерение производится при помощи поляриметра.

2. Фотоэлектроколориметрия. Фотоэлектроколориметрия – определение концентрации вещества в растворе по изменению силы тока в фотоэлементе при падении на него луча света, прошедшего через исследуемый раствор.

При прохождении светового потока через окрашенную жидкость часть света поглощается. Степень поглощения света, или коэффициент экстинции («тушения»), во многих случаях прямо пропорциональна интенсивности окраски раствора. Окраска раствора зависит от концентрации в нем растворенного вещества: чем выше концентрация, тем интенсивнее окраска и тем больше света поглощает раствор. Степень светопоглощения определяют в приборе фотоэлектроколориметре (ФЭК) путем уравнивания интенсивности света, прошедшего через исследуемый окрашенный раствор, и света, прошедшего через контрольную жидкость – бесцветный растворитель исследуемого вещества. По степени светопоглощения определяют содержание вещества в растворе.

Для получения точных объективных данных об интенсивности света в прибор вводят фотоэлемент. Фотоэлемент преобразует световое излучение в электрический ток. При попадании света на некоторые светочувствительные вещества (селен, цезий) энергия световых квантов передается электронам этого вещества, которые начинают двигаться в одном направлении. Если пластинки фотоэлемента соединить с проводником, то в нем возникает поток электронов, то есть электрический ток, силу которого можно измерить микроамперметром.

Сила тока пропорциональна световому потоку, падающему на фотоэлемент. Когда на пути светового потока ставят кювету с раствором, поглощающим или рассеивающим свет, на фотоэлемент падает меньше лучей. Сила тока в цепи уменьшается, на что указывает отклонение стрелки амперметра. По изменению силы тока можно судить о концентрации исследуемого вещества.

На измерении светопоглощения основано определение концентрации прозрачных окрашенных растворов – фотоэлектроколометрия. Описываемый прибор позволяет делать и нефелометрические определения, то есть определять концентрацию вещества во взвесях и эмульсиях по степени рассеяния ими света.

Частички взвеси, помещенной на пути узкого бокового пучка света, отражают световые волны – рассеивают свет. Чем мутнее взвесь, то есть чем больше ее концентрация, тем больше света отражается и тем меньше его проникает через взвесь и падает на фотоэлемент, и тем меньшей силы ток возникает в фотоэлементе. Между концентрацией вещества во взвеси и силой фототока существует обратно пропорциональная зависимость.

Оптическая схема прибора ФЭК-56М (рис.2): от источника света - лампы накаливания () световой поток направляется на призму (), которая делит его на два пучка и направляет на плоские зеркала (). Зеркала отражают свет двумя параллельными пучками: правый световой пучок является измерительным, левый – компенсаторным.

Параллельные пучки света проходят через светофильтры () и попадают в кюветы с контрольным () и исследуемым () растворами. Здесь часть света поглощается или рассеивается. Вышедшие из кювет пучки света проходят через раздвижные диафрагмы () и попадают на линзы (), в фокусе которых помещены зеркала (), отражающие свет на матовые стекла (), за которыми находятся фотоэлементы ().

Раздвижные диафрагмы при вращении связанных с ними отсчетных барабанов () меняют площадь отверстий и тем самым изменяют интенсивность светового потока, падающего на фотоэлементы ().

В фотоэлементах возникает ток, сила которого пропорциональна световому потоку. Оба фотоэлемента соединены с микроамперметром таким образом, что при возникновении в них тока одинаковой силы стрелка микроамперметра стоит на нуле.

3. Спектрофотометрия. Спектрофотометрия – определение количества вещества в окрашенном растворе или в твердой среде по измерению светопоглащения волн строго определенной длины. Светопоглощение измеряют с помощью фотоэлемента по изменению силы фототока, возникающего в нем, при падении на фотоэлемент светового потока, прошедшего через контрольный, а затем через исследуемый растворы или образцы.

Измерение светопоглощения производится в приборе – спектрофотометре, кварцевая призма которого выявляет монохроматические пучки спектра, соответствующие окраске раствора исследуемого вещества, в силу этого прибор отличается большой точностью и чувствительностью.

Оптическая схема СФ-4А (рис.3): Прибор снабжен тремя источниками света: лампой накаливания, водородной и ртутной лампами, что позволяет работать в широком диапазоне видимой и ультрафиолетовой части спектра.

Свет от источника () падает на зеркальный конденсор (), который собирает его и направляет на плоское зеркало (). Зеркало отклоняет пучок лучей на 90⁰ и направляет его через кварцевую линзу () во входную щель (), через которую свет проникает на зеркальный объектив (), представляющий собой сферическое зеркало.

От зеркального объектива параллельный пучок лучей попадает на кварцевую призму (), которая разлагает его спектр (диспергирует). Диспергированный пучок лучей направляется обратно на объектив и фокусируется им на выходной щели (), расположенной под входной щелью. Вращая кварцевую призму, можно получать на выходе свет различных волн. Длина волны зависит от угла поворота призмы.

Монохроматические лучи, пройдя выходную щель (), кварцевую линзу () и светофильтр, поглощающий рассеянный свет (), попадают в кювету с контрольным или исследуемым раствором (). Здесь часть света поглощается, а прошедшие через раствор лучи попадают на фотоэлемент ().

Для обеспечения работы в широком диапазоне спектра в приборе предусмотрены 2 фотоэлемента, каждый из которых воспринимает длины волн в определенном интервале: 10ый – от 220 до 650 нм, 2-ой – от 600 до 1100 нм.

4. рН-метрия. рН-метрия – определение концентрации водородных ионов или реакции раствора – его кислотности или щелочности, производится с помощью прибора рН-метра.

Принципиальная схема (рис.4). Для измерения величины рН используют электродную систему со стеклянным электродом, электродвижущая сила которого зависит от активности ионов водорода в растворе.

При погружении электрода () в раствор между поверхностью полого шарика () из литиевого стекла, который располагается на конусе электрода, и раствором происходит обмен ионами, в результате которого ионы лития замещаются ионами водорода, и стеклянный электрод приобретает свойства водородного электрода.

Между поверхностью стекла и исследуемым раствором возникает разность потенциалов, величина которой определяется активностью водорода в растворе.

Для создания электрической цепи при измерении применяют контактные электроды: внутренний контактный электрод (), осуществляющий электрический контакт с раствором, заполняющим внутреннюю часть стеклянного электрода, и внешний контактный электрод (), осуществляющий электрический контакт с исследуемым раствором.

Электродвижущая сила (ЭДС – разность потенциалов между двумя электродами) электродной системы зависит от величины рН раствора. Измеряя ЭДС электродной системы с помощью электродного милливольтметра, шкала которого градуирована в единицах рН, определяют величину рН исследуемого раствора.

5. Автоматические устройства для подсчета биологических частиц. Различные модели таких приборов построены по единому принципу: прибор регистрирует и подсчитывает импульсы, возникающие в момент прохождения частиц через капиллярное отверстие, включенное в электрическую цепь. Частицы должны быть взвешены в растворе электролита, который является хорошим проводником электрического тока. Протекая через капиллярное отверстие, электролит не изменяет напряжения в цепи. Когда же через капиллярное отверстие проходит частица, обладающая меньшей электропроводностью, сопротивление в электрической цепи резко возрастает. Возникают импульсы напряжения, которые регистрируются и суммируются электронным счетным устройством.

► Целлоскоп - прибор, предназначенный для подсчета форменных элементов крови. Подсчет производится при прохождении определенного количества разведенной крови через капиллярное отверстие апертурной трубки, что осуществляется с помощью дозатора.

Различные форменные элементы крови имеют разную величину, в зависимости от которой подбирается апертурная трубка с капиллярным отверстием определенного диаметра. Минимальный размер подсчитываемых частиц устанавливается с помощью дискриминатора.

Осциллоскопический экран регистрирует частицы, проходящие через точечное отверстие апертурной трубки, в виде вертикальных линий, высота которых соответствует размерам частиц.

► Пикоскале - предназначен для подсчета частиц, распределенных в жидкости на единицу объема взвеси.

Этот прибор применяется в биологии и медицине для подсчета форменных элементов крови, определения количества дрожжевых грибков, бактерий, растительных спор.

Измерительная трубка имеет капиллярное отверстие, диаметр которого должен соответствовать величине подсчитываемых частиц. Прибор считает только те частицы, максимальный размер которых меньше половины диаметра капиллярного отверстия. К прибору придается набор измерительных трубок с капиллярными отверстиями различного диаметра, которые подбирают к соответствующему исследованию. Например, для подсчета эритроцитов диаметр измерительного капилляра должен быть 62 мкм, а для подсчета лейкоцитов – 72 мкм.

► Гематологический анализатор ABACUS. Предназначен для измерения количества форменных элементов крови, объёма эритроцитов, дифференциации лейкоцитов по трем субпопуляциям и определения уровня концентрации гемоглобина. Полный автоматический цифровой счетчик. Обрабатывает 55 проб в час, сохраняет 10000 результатов, определяет 18 гематологических параметров из 25 мл цельной крови.

Принцип подсчета количества форменных элементов и измерения из объёма (рис.5): анализатор работает по так называемому «Методу полного сопротивления». Этот метод позволяет измерить объем и число кровяных клеток путем обнаружения и измерения изменений в электрическом сопротивлении при прохождении клеток крови в токопроводящей жидкости через капиллярное отверстие.

Каждая клетка, проходя через капиллярное отверстие, где течет постоянный ток между внутренним и внешним электродами, вызывает изменение в сопротивлении токопроводящей суспензии кровяных клеток. Эти изменения фиксируются как повышение напряжения между электродами, что эквивалентно импульсам напряжения. Количество импульсов соответствует количеству клеток (подсчет кровяных клеток). Интенсивность каждого импульса пропорциональна объёму частицы. Подсчитываются только те импульсы, которые оказываются между верхним и нижним уровнями дискриминаторов. Эти уровни устанавливаются в заводских условиях. Единицами измерения уровней являются фемтолитры (fl).

Принцип измерения уровня гемоглобина: разбавленная лизирующим раствором проба (цельная кровь) в соотношении 1:196 измеряется цианметгемоглобиновым методом. Реагент лизирует эритроциты, освобождая гемоглобин. Железо гемоглобина переходит из состояния Fe⁺² в состояние Fe⁺³ для формирования метгемоглобина, который в соединении с цианидом калия дает стабильный цианметгемоглобин. После этого концентрация гемоглобина измеряется фотометрически.