На правах рукописи

НЕФЁДОВА

Екатерина Дмитриевна
ГНЁЗДНАЯ АЛОПЕЦИЯ: КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ ТЯЖЁЛОГО ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ

14.01.10 – кожные и венерические болезни

03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2011

Работа выполнена на кафедре дерматовенерологии, микологии и косметологии ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава»

Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор СУВОРОВА

Ксения Николаевна
доктор медицинских наук, профессор ЗИНЧЕНКО

Рена Абульфазовна

Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор СУКОЛИН

Геннадий Иванович
доктор медицинских наук, профессор ДАДАЛИ

Елена Леонидовна


Ведущая организация:
ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита диссертации состоится «___» _______ 2011 г. в 12°° часов на заседании Диссертационного совета Д 208.115.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии Минздравсоцразвития» (107076, г. Москва, ул. Короленко, д.3, стр. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГУ «ГНЦДК Минздравсоцразвития».
Автореферат разослан «____»_________2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Иванова Наталия Константиновна

Актуальность исследования. Гнёздная алопеция - аутоиммунный хронический дерматоз с наследственной предрасположенностью [Суворова К.Н., Гаджигороева А. Г., 1998], которым по данным ряда авторов страдает до 5 и более процентов населения [Адаскевич В.П., Мяделец О.Д., Тихоновская И.В., 2000]. Популяционная частота заболевания составляет 1:1000-3300 [Мордовцев В.Н., Алиева П.М., Сергеев А.С., 2002]. Учитывая психоэмоциональный дискомфорт, который причиняет развитие гнёздной алопеции, её можно отнести к социально-значимым заболеваниям [Кочергина С.С. и др., 2002]. Рост тяжёлых форм, непредсказуемость течения диктуют необходимость дальнейшего изучения этиопатогенеза болезни.

Гнёздная алопеция — мультифакториальное заболевание, условиями манифестации, клинического разнообразия и течения которого является сложное сочетание внешнесредовых и генетических факторов [McDonagh A.J.G., Tazi-Ahnini R., 2002; Alkhalifah A. et al., 2010]. Исходя из этого, актуальным остаётся поиск факторов риска, позволяющих оценить вероятность развития заболевания и его прогноз.

Экзогенными предикторами болезни являются бактериально-вирусные инфекции, стресс, инсоляция и др. Их влияние усиливается при наличии у больного сопутствующих хронических и других мультифакториальных болезней (атопического дерматита, псориаза, аутоиммунного тиреоидита, витилиго и др.) [Вандышев П.Р., Бурштейн Ю.Я., 1992; Озёрская О.С., 2004].

На генетическую детерминированность болезни указывают повышенная частота встречаемости у родственников первой линии родства, близнецовая конкордантность, наличие других нозологических форм, детерминированных моногенно (монилетрикс, наследственный аутосомно-рецессивный гипотрихоз, синдром «неукладываемых волос», семейная алопеция др.), влияние ряда генов (генов-кандидатов) на рост волос и развитие/течение гнёздной алопеции (гены системы HLA, AIRE, FLG и др.) [Martinez-Mir A. et al., 2007].

Изучается влияние мутаций в гене филаггрина (FLG) на развитие гнёздной алопеции [Betz R.C. et al., 2007]. При сочетании с атопическим дерматитом наличие соответствующих мутаций в гене FLG значительно повышает риск развития у такого пациента тяжёлых форм алопеции [Blyumin M.L., Hu S., Kirsner R.S., 2007].

В последнее время все большее внимание учёных уделяется изучению полиморфизмов генов цитокинов (ФНОα (TNFA), семейство генов IL1, IL4 и др.), учитывая их влияние на рост волос, участие в системных аутоиммунных воспалительных процессах.

Интерлейкин 1 (IL1) — провоспалительный цитокин, который продуцируется активированными нейтрофилами и макрофагами в очагах воспаления (в том числе в перибульбарных зонах волосяных фолликулов при гнёздной алопеции) [Dinarello C.A., 1996]. Совместно с генами семейства IL1, TNFA подавляет рост волос in vitro [Harmon C.S., Nevins T.D., 1993; Philpott M.P. et al., 1996]. Даже незначительное количество этих цитокинов приводит к дистрофическим изменениям анагеновых волос, нарушению функционирования клеток в перибульбарной зоне волосяного фолликула и нарушению кератинизации в перикортикальной зоне, что соответствует процессам, наблюдаемым при гнёздной алопеции [Tazi-Ahnini R. et al., 2002].

Противоположным образом действует антагонист рецептора IL1 — IL1RN. IL1RN относится к типу IL1 рецепторов, но, преобразуя сигнал, оказывает противовоспалительное действие [Dinarello C.A., 1996]. На продукцию цитокинов оказывают влияние полиморфизмы соответствующих генов [Kim S.H. et al., 2008].

Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам гнёздной алопеции немногочисленны и выполнены в основном за рубежом [Tazi-Ahnini R., et al., 2003; Kemp E.H., et al., 2006; Proff J., et al., 2006]. Данные о роли генов-кандидатов TNFA, семейства генов IL1, мутаций в генах FLG, AIRE в развитии и течении заболевания в нашей стране отсутствуют.

В связи с вышеизложенным, целью исследования явилось определение клинико-морфологических, эндогенных и генетических (полиморфизмов генов-кандидатов TNFA, семейства генов IL1, мутаций в генах FLG, AIRE, LIPH) предикторов тяжёлого течения гнёздной алопеции у пациентов разного возраста и разработка алгоритма обследования и ведения больных на основании полученных данных.

В соответствии с поставленной целью нам предстояло решить следующие задачи:

1. 
   Выявить и изучить варианты клинического течения гнёздной алопеции на основании определения формы и стадии болезни, частоты рецидивов, сопутствующей патологии с оценкой иммунологических особенностей у больных разных возрастных групп и определить клинические предикторы тяжёлого течения заболевания.
   
2. 
   Определить наличие мутационных изменений в генах фосфолипазы LIPH (делеция 4 экзона), FLG (2282 del4 и R501X), AIRE (R251X), характерных для болезней волос с моногенным типом наследования (наследственный гипотрихоз, гнёздная алопеция в составе аутоиммунного полигландулярного синдрома 1-го типа (АПС 1-го типа)) у пациентов с тяжелыми формами гнёздной алопеции.
   
3. 
   Оценить полиморфизмы генов TNFA (–308G>A), IL1A (—559C>T и +889С>T)), IL1B (–511C>T, +3953C>T, – 31C>T)) и IL1RN (VNTR в 4-м интроне) у пациентов с гнёздной алопецией.
   
4. 
   Изучить возможные ассоциации изученных полиморфизмов в генах TNFA, IL1A, IL1B и IL1RN с развитием, возрастом манифестации и особенностями клинического течения у больных гнёздной алопецией.
   
5. 
   Изучить межгенные взаимодействия полиморфизмов генов TNFA, IL1A, IL1B и IL1RN в развитии и течении заболевания.
   
6. 
   Разработать алгоритм обследования и ведения пациентов с гнёздной алопецией, исходя из клинических проявлений, течения болезни, сопутствующей патологии, иммунологических особенностей, наличия отягощенной наследственности по аутоиммунным заболеваниям у родственников и особенностям полиморфизма кандидатных генов TNFA, IL1A, IL1B и IL1RN, выявления мутаций в гене FLG.
   

Научная новизна исследования. Выявлены клинические предикторы тяжёлого течения гнёздной алопеции: ранняя манифестация, медленный регресс клинических проявлений, частые рецидивы, выявление ониходистрофий, наличие сопутствующей эндокринной и аутоиммунной патологии.

Впервые проанализированы полиморфизмы генов цитокинов TNFA, IL1A, IL1B и IL1RN и их роль в развитии и течении гнёздной алопеции у пациентов, проживающих на территории России. Установлена ассоциация тяжёлого течения болезни с полиморфизмами –31C>T, –511C>T гена IL1B, лёгкого – с полиморфизмами +889C>T гена IL1A и генотипом 2-2 гена IL1RN.

Проведенные молекулярно-генетические исследования позволили выявить группу больных с наследственной патологией (больные с АПС 1-го типа, аутосомно-рецессивным гипотрихозом).

Впервые в России проведен поиск наиболее распространенных мутаций в гене FLG (2282 del4 и R501X) у больных гнёздной алопецией. В результате мутация 2282 del4 выявлена у больной с тяжёлым течением гнёздной алопеции, вульгарным ихтиозом и атопическим дерматитом.

На основании полученных данных разработан алгоритм обследования больных с гнёздной алопецией, позволяющий прогнозировать течение заболевания и определять тактику ведения больных.

Полученные результаты расширяют научную базу по обоснованию молекулярно-генетической природы мультифакториальных дерматозов, таких как гнёздная алопеция.

Основные положения, выносимые на защиту

1. 
   Клинико-морфологическое обследование, динамическое наблюдение больных гнёздной алопецией позволяют выявить предикторы тяжёлого течения болезни: ранний дебют, медленный регресс клинических проявлений, ониходистрофии, сопутствующие эндокринные и аутоиммунные заболевания.
   
2. 
   В рамки дифференциальной диагностики универсальных форм гнёздной алопеции необходимо включать моногенно-наследуемые болезни волос/синдромы (АПС 1-го типа, аутосомно-рецессивный гипотрихоз) доля которых составила 8,6%.
   
3. 
   Полиморфизмы семейства генов IL1, THFA оказывают синергичное влияние на развитие/течение гнёздной алопеции, при этом наибольшая ассоциация выявлена с полиморфизмом +889C>T гена IL1A (χ2=4,2, p<0,05), аллелем 2 антагониста гена IL1 – IL1RN (VNTR в 4-м интроне) (χ2=3,9, p<0,05).
   
4. 
   Лёгкое течение гнёздной алопеции более характерно для взрослых и ассоциируется с полиморфизмом +889C>T гена IL1A (χ2=5,5, p<0,05) и генотипом 2-2 гена IL1RN (χ2=5,44, p<0,05). Наличие генотипа 2-2 гена IL1RN (χ2=4,05, p<0,05) и полиморфизма –308G>A гена TNFA (χ2=4,03, p<0,05) в 3 - 4 раза повышает риск рецидивирующего течения болезни у этой группы больных.
   
5. 
   Тяжёлое течение болезни более характерно для детей и ассоциировано с полиморфизмами –31С>T гена IL1B (χ2=5,84, p<0,05) и –511C>T гена IL1B (χ2=4,27, p<0,05).
   

Практическая значимость работы.

На основании полученных данных составлен алгоритм обследования и ведения больных гнёздной алопецией. Показана необходимость включения в рамки обследования пациентов молекулярно-генетических методов с целью дифференциальной диагностики гнёздной алопеции с моногенно-детерминированными болезнями волос и определения генетических предикторов тяжёлого течения заболевания (полиморфизмов провоспалительных генов цитокинов – генов семейства IL1, THFA). Выявление генотипа СС полиморфизмов – 31C>T, аллеля Т полиморфизма – 511C>T гена IL1B; генотипа GG полиморфизма – 308G>A гена THFA и 2-2 гена IL1RN позволяет отнести таких пациентов в группу риска развития тотальной и универсальной форм гнёздной алопеции, частого рецидивирования болезни. Они подлежат диспансерному наблюдению, включающему своевременное выявление и коррекцию очагов хронической инфекции и других сопутствующих заболеваний.

Внедрение в практику. Полученные результаты используются в диагностическом процессе Медико-генетического научного центра РАМН, в лечебно-диагностическом процессе ГУЗМО «Московский областной клинический кожно-венерологический диспансер», ГУЗ МО «Подольский кожно-венерологический диспансер», в учебном процессе кафедры ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на секции «Болезни волос. Междисциплинарное решение проблемы» в рамках проведения I международного форума медицины и красоты 17 ноября 2008г.; на секции «Патогенез, лечение и профилактика дерматозов у детей – 1» в рамках проведения X Всероссийского съезда дерматовенерологов 9 октября 2008г.; на заседании Московского общества дерматовенерологов им. Поспелова 18 ноября 2010г.; на расширенном заседании кафедры дерматовенерологии и косметологии ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава», Медико-генетического научного центра РАМН, Городской клинической больницы №14 им. В.Г. Короленко 10 ноября 2010г.

Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 9 печатных работах, из них 4 опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 157 страницах печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований и обсуждения, выводов и приложения. Иллюстрирована 19 таблицами, 14 рисунками. Список литературы включает 49 отечественных и 145 иностранных научных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

За период с 2007 по 2010 г.г. на кафедре дерматовенерологии, микологии и косметологии ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава» проконсультировано более 120 больных с выпадением волос.

Обследовано 105 больных гнёздной алопецией (68 женщин и 37 мужчин) в возрасте от 3 до 75 лет. Критерием включения являлось наличие заболевания в течение 2 – х недель и более.

Количество детей и подростков до 18 лет включительно составило 44 (42%), взрослых старше 18 лет — 61 (58%). Превалирующее число больных - русские (87%).

Методы исследования:

• 
  клинико-морфологический;
  
• 
  микроскопическое исследование волос;
  
• 
  лабораторно-инструментальный;
  
• 
  генеалогический анализ;
  
• 
  молекулярно-генетические: полимеразная цепная реакция, рестрикционный анализ, метод электрофореза в агарозном геле;
  
• 
  статистические.
  

Клинико-морфологическое обследование больных включало: осмотр кожи, волос, ногтевых пластин, видимых слизистых оболочек и лимфатических узлов. Изучался анамнез болезни (регистрировались возраст дебюта, характер течения, частота рецидивов, возможные триггерные факторы, предыдущие подходы к терапии и их эффективность).

88 (84%) больным проведено микроскопическое исследование волос с помощью светового микроскопа, полученных путем тракционной пробы общей массы волос и по краям очагов выпадения (определение зоны расшатанных волос), а также эпиляционной пробы (в случае стационарной и регрессирующей стадий гнёздной алопеции). Исключение составили 17 больных с универсальной формой выпадения. В зависимости от степени загрязнения волос, вариантом нормы считалось, если из пучка волос за 6-8 тракций вытягивается от 3 до 5 нормальных (телогеновых) волоса [Kligman A.M., 1959].

Лабораторные исследования включали клинические анализы крови, мочи, определение антител к Treponema Pallidum, вирусам гепатитов В, С, ВИЧ, биохимические анализы крови, гормональные исследования. По показаниям назначалось дообследование, консультации эндокринолога, невропатолога, иммунолога, гинеколога и пр.

36 (34%) больным проведена оценка иммунного статуса с исследованием уровня иммуноглобулинов, основных субпопуляций лимфоцитов, фагоцитарной активности нейтрофилов в периферической крови. Исследование проводилось в КДЦ ФГУН МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского на аппарате Cytomix FC-500 (реагенты и оборудование фирмы Beckman Coulter, Франция). Полученные результаты сравнивались с общепринятыми показателями нормы [Никулин Б.А., 2007].

Сбор генетической информации проводился путём опроса и клинического обследования членов семьи больного (выявлялись сопутствующие заболевания у родственников, особое внимание уделялось аутоиммунным болезням).

Всем пациентам проведено молекулярно-генетическое исследование на базе лаборатории генетической эпидемиологии Медико-генетического научного центра РАМН (зав. лабораторией — д.м.н., проф. Зинченко Р.А.). У всех больных оценены полиморфизмы —308G>A гена TNFA, —559C>T и +889C>T гена IL1A, а также —511 C>T, +3953C>T и —31C>T гена IL1B, генотипы гена IL1RN и мутации R501X, 2282del4 в гене FLG. У 16 (15%) больных проведен поиск мутации R251X в гене AIRE, у 8 (7,6%) — поиск делеции 4 экзона в гене LIPH.

В качестве источника ДНК использованы лейкоциты периферической крови. ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Полиморфизмы генов исследовались методом полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом. Амплифицированные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 7-8%-ном полиамидном геле. После окончания элеткрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия и анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на транслюминаторе.

Контрольную группу составили 150 здоровых индивида (94 женщины и 56 мужчин) в возрасте от 14 до 76 лет. Число детей и подростков до 18 лет включительно составило 21 (14%), взрослых старше 18 лет — 129 (86%) человек. Все здоровые индивиды - русские.

Распределение частот генотипов изучаемых полиморфизмов генов соответствовало соотношению Харди-Вайнберга как в контрольной группе, так и в группе больных гнёздной алопецией.

Статистический анализ клинических и лабораторных данных проведен с помощью комплекса программ математического анализа. Клинические расчёты - с использованием пакета прикладных программ Statistica 6 [StatSoft Inc., 2001], “Microsoft Office Excel 2003”. При корреляционном анализе для соответствующих данных использован коэффициент Пирсона.

Для сравнительного анализа двух независимых выборок и выявления ассоциативных связей при оценке молекулярно-генетических данных использован модифицированный χ2. Ассоциацию генотипов, аллелей с течением болезни выявляли, сравнивая выборки больных и здоровых индивидов по частоте одного признака с использованием критерия χ2.

Межгенные взаимодействия изучали с помощью расчета отношения шансов и метода Multifactor Dimensionality Reduction (MDR).

Статистически достоверными считались различия при p<0,05.

Силу ассоциаций генотипических и фенотипических характеристик изученных генов с риском развития гнёздной алопеции оценивали по значениям показателя отношения шансов (odds ratio, OR) [Schlesselman J., 1982].

Результаты исследования и обсуждение

Выявление клинических предикторов тяжёлого течения болезни

В ходе проведенного клинико-морфологического исследования выделены лёгкие и тяжёлые формы заболевания.

69 (66%) больных с лёгкими формами гнёздной алопеции имели один (16 больных (15%)) или несколько очагов (многоочаговая форма) выпадения волос (53 пациента (51%)). Среди 36 (34%) больных с тяжёлыми формами, у 4 (4%) был диагностирован офиазис, у 11 (11%) — субтотальная, у 4 (4%) — тотальная, у 17 (16%) — универсальная формы выпадения. У взрослых, помимо преобладающей многоочаговой формы, чаще диагностированы единичные очаги выпадения волос. В то время как у детей — субтотальная, тотальная и универсальные формы.

Средний возраст дебюта заболевания составил 18,7±14,7 лет. В случае манифестации признаков заболевания до 18 лет, дебют считался ранним, после – поздним (рис. 1).

Рис. 1. Клинические формы гнёздной алопеции в зависимости от возраста манифестации клинических проявлений

Таким образом, взрослые с поздним дебютом гнёздной алопеции имели более лёгкое течение заболевания, которое характеризовалось редким рецидивированием и быстрым регрессом клинических проявлений. В то время как у детей преобладали тяжёлые формы с частым рецидивированием, медленным регрессом.

Ранний дебют наблюдался у 55 (52%) больных. При этом у 15 взрослых с ранней манифестацией клинических проявлений выявлено преобладание тяжёлых форм (у 6 - многоочаговая, у 9 – тотальная, универсальная формы и офиазис).

Проведенный корреляционный анализ подтвердил тенденцию развития тотальных и универсальных форм заболевания при ранней манифестации клинических проявлений (r=0,2221, p=0,029).

Чаще наблюдалась прогрессирующая стадия гнёздной алопеции (у 61 больного (58%)).

При микроскопии полученных путем проведения тракционной и эпиляционной проб волос выявлены признаки повреждения стержня и корневой системы: дистрофические анагеновые и телогеновые волосы, телогеновые волосы, а также независимо от стадии патологического процесса — дистрофии стержня волос (узловой трихорексис, трихошизис и др.) (см. рис. 2).

Рис. 2. Данные микроскопии волос в зависимости от стадии патологического процесса

По мере нарастания тяжести заболевания у больных чаще регистрировались ониходистрофии (у 81 больного (77%)). При этом преобладали онихорексис (38%), трахеонихии (37%), наперстковидные вдавления (33%).

Выявлена тенденция к развитию тяжёлых форм гнёздной алопеции при наличии дистрофического поражения ногтевых пластин (r=0,2128, p=0,0364).

При изучении анамнеза рецидивирующий характер болезни (в течение 1,5-3 мес. наблюдения) отмечен у 70 (67%) больных. Оценка частоты рецидивов носила условный характер и оценивалась в процессе наблюдения, изучения анамнеза и историй болезни. Доказано, что частые рецидивы способствуют развитию тяжёлых форм гнёздной алопеции (r=0,3956, p=0,00007).

Быстрый регресс клинических проявлений в течение 1,5—3 мес. наблюдения выявлен у 38 (36%) пациентов преимущественно с лёгкими формами гнёздной алопеции (у 37 – с одним или несколькими очагами выпадения, у 1 – с субтотальной формой выпадения). Доказано, что чем легче клиническая форма, тем быстрее происходит регресс клинических проявлений и наоборот (r=-0,5047, p=0,00000001).

В структуре сопутствующей соматической патологии преобладали заболевания желудочно-кишечного тракта, кожи, ЛОР органов, нервной и эндокринной систем (рис. 3).

Рис. 3. Разнообразие сопутствующей соматической патологии у больных гнёздной алопецией

Не выявлено достоверного влияния сопутствующих заболеваний на течение гнёздной алопеции (p>0,05). Обнаружена тенденция влияния сопутствующей эндокринной патологии на тяжесть течения заболевания (r=0,2057, p=0,0433).

Сопутствующие аутоиммунные заболевания выявлены у 34 (32%) больных. Проведенный корреляционный анализ также выявил тенденцию влияния этой группы болезней на тяжесть клинических проявлений (r=0,2363, p=0,0198) и рецидивирование гнёздной алопеции (r=0,3708, p=0,0002). В структуре сопутствующей эндокринной и аутоиммунной патологии преобладал аутоиммунный тиреоидит (у 18%). Это диктует необходимость оценки функции щитовидной железы у больных гнёздной алопецией.

Результаты собственных наблюдений показали, что среди экзогенных факторов на развитие/рецидивирование гнёздной алопеции оказывают влияние перенесенные бактериально-вирусные инфекции (ОРВИ, грипп, пневмония, инфекции мочевыводящих путей и ЛОР органов) и инсоляция. 28 (27%) больных отметили эпизоды бактериально-вирусных инфекций за 1 и менее месяца до развития/рецидивирования гнёздной алопеции, 27 (26%) - за 3 и более месяца. Фактор инсоляции за 1 и менее месяца до развития/рецидивирования болезни отметили 11 (10%), 1 (0,95%) - за 3 и более месяца. Однако достоверной корреляционной связи получено не было (p>0,05).

Проведенный статистический анализ позволил выявить предикторы тяжелого течения и рецидивирования гнёздной алопеции (табл. 1, 2).

следующая страница>