На правах рукописи

Ибрагимова Ильсия Ильясовна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ГЕНОВ-СУПРЕССОРОВ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА,

МЕТИЛИРОВАННЫХ ПРИ РАКЕ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
03.00.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань - 2008

Работа выполнена на кафедре биохимии ГОУВПО «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Фаттахова Альфия Нурлимановна
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Лобкарев Олег Александрович

(доцент кафедры урологии и нефрологии

Казанской государственной медицинской

академии, г. Казань)
кандидат биологических наук

Саттарова Лилия Ирековна

(врач высшей категории межрегионального

клинико-диагностического центра, г. Казань)

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН

Защита состоится «30» октября 2008г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская, д.18, ауд.209.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан «27» сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Абрамова З.И.
Посвящается памяти моего научного руководителя,

безвременно ушедшего из жизни, Аскаровой Альфии Наримановны,

а также памяти профессора Винтера Виктора Георгиевича
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы

Рак предстательный железы является одной из главной причин смертности среди мужчин от злокачественных новообразований. В последние годы наблюдается значительный рост данного заболевания. В США рак предстательной железы занимает первое место в структуре онкологических заболеваний (более 186 тыс. новых случаев в 2008 г) и второе место по частоте летальных исходов среди мужчин (около 29 тыс. смертей в 2008 г) (Jemal et al., 2008). По величине прироста показателя заболеваемости в России РПЖ занимает 1-е место за период 1996-2006 гг. (величина прироста составила 128,26%) и во многом превосходит такие распространенные новообразования, как меланомы кожи и злокачественные заболевания легких и желудка (Чиссов, 2008).

Несмотря на успехи фармакологии в разработке противоопухолевых препаратов, до сих пор не было отмечено выраженного снижения смертности от рака простаты. Надежды сократить число смертей от данного заболевания основаны на раннем выявлении патологии, точности прогноза и эффективном лечении болезни в ее начальной стадии. Но ранняя диагностика крайне затруднена вследствие бессимптомного протекания болезни. В настоящее время для диагностики опухолей предстательной железы используются следующие методы: определение уровня простат-специфического антигена в плазме крови, пальцевое ректальное исследование, трансректальное ультразвуковое исследование и биопсия предстательной железы. Однако каждый из этих методов имеет ряд своих недостатков, что делает их использование не всегда эффективным (Lilja et al., 2008). Таким образом, очевидна необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых, более чувствительных и специфичных маркеров ранней диагностики рака предстательной железы.

Известно, что одной из важнейших причин перерождения нормальной клетки в неопластическую является нарушение функционирования генов-супрессоров опухолевого роста. Изменения в работе этих генов приводят к возникновению и прогрессии развития рака, а восстановление функции – к существенному замедлению пролиферации опухолевых клеток. Исследования последнего десятилетия показали, что наряду с генетическими событиями, обуславливающими инактивацию клеточных генов вследствие изменения последовательности ДНК, важную роль в процессе канцерогенеза играют также эпигенетические явления, не затрагивающие первичную структуру ДНК, но влияющие на экспрессию генов (Jones et al., 2002). Одним из таких эпигенетических изменений является локальное гиперметилирование специфических последовательностей – CpG-островков, расположенных в 5’-регуляторных районах многих генов, которое влечет за собой подавление экспрессии гена либо в результате прямого ингибирования связывания транскрипционных факторов с ДНК, либо в результате привлечения корепрессоров транскрипции (Klose et al., 2006). До сих пор остается открытым вопрос о механизмах инициации гиперметилирования CpG-островков в процессе образования опухоли.

На данный момент известен ряд генов-супрессоров опухолевого роста, экспрессия которых нарушена вследствие гиперметилирования их CpG-островков и показана их ассоциация с различными видами опухолей (Esteller, 2002). Но в настоящее время все более актуальным становится поиск новых, ранее неизученных генов-супрессоров опухолевого роста, метилирование которых специфично для опухолей определенных видов, т.к. результаты подобных исследований открывают новые возможности, как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для разработки методов диагностики, мониторинга, прогноза и терапии опухолей.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в идентификации потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста, метилированных при раке предстательной железы.

Для ее достижения нами были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. 
   Провести ингибирование процесса метилирования ДНК в двух андроген – зависимых клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP и MDA2b и в двух андроген – независимых клеточных линиях рака предстательной железы DU-145 и PC-3;
   
2. 
   Идентифицировать гены, экспрессия которых увеличилась вследствие ингибирования процесса метилирования;
   
3. 
   Провести скрининг идентифицированных генов на предмет их экспрессии в клетках морфологически нормальной предстательной железы и наличия CpG-островка в составе их промоторов;
   
4. 
   Исследовать статус метилирования CpG-островков отобранных генов в клеточных линиях рака предстательной железы и морфологически нормальной ткани предстательной железы;
   
5. 
   Провести анализ частоты метилирования в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы различных стадий.
   

Научная новизна

В двух андроген – зависимых клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP и MDA2b и в двух андроген – независимых клеточных линиях рака предстательной железы DU-145 и PC-3 идентифицировано 170 генов, экспрессия которых увеличилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК. Из них промоторы двадцати пяти генов имели в своем составе CpG-островки, удовлетворяющие необходимым условиям, и их экспрессия в клетках нормальной предстательной железы была выше, чем при раковой патологии.

Впервые при анализе статуса метилирования CpG-островков двадцати пяти отобранных генов в клеточных линиях рака предстательной железы и морфологически нормальной ткани предстательной железы было показано, что гены TACSTD2, IFI30, KRT7, ANXA2, AQP3, PDLIM4, SLC15A3, GADD45b метилированы в клеточных линиях РПЖ, но не метилированы в норме.

Впервые проведен анализ частоты метилирования CpG-островков генов TACSTD2, IFI30, KRT7, ANXA2, AQP3, PDLIM4, SLC15A3, GADD45b в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы различных стадий. Высокая частота метилирования генов PDLIM4, KRT7 и SLC15A3 при раке предстательной железы говорит о потенциальной возможности использования вышеперечисленных генов в качестве биологических маркеров ранней диагностики рака предстательной железы.

Практическая значимость

По результатам исследования получены данные, которые могут служить для разработки скрининговых тест-систем ранней диагностики рака простаты, использование которых может служить вспомогательным инструментом в выявлении раковых патологий на самых ранних стадиях, когда результаты патогистологических исследований не могут дать уверенного ответа о наличии или отсутствии новообразования.

Материалы исследования также представляют интерес в свете расширения понимания роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии ряда клеточных генов при злокачественной трансформации клетки, а также получения новых дополнительных знаний об участии некоторых клеточных генов в процессе канцерогенеза.

Положения, выносимые на защиту:

1. 
   Из 170 генов, экспрессия которых увеличилась в результате эпигенетической реактивации генома клеточных линий рака предстательной железы, двадцать пять генов имеют в составе своих промоторов CpG-островки и транскрипционно активны в клетках морфологически нормальной предстательной железы. Гены TACSTD2, PDLIM4, ANXA2, IFI30, GADD45b, AQP3, KRT7, SLC15A3 метилированы в клеточных линиях рака предстательной железы,
   
2. 
   Частота метилирования генов TACSTD2, GADD45b, KRT7, SLC15A3, PDLIM4 при простатической интраэпителиальной неоплазии варьируется от 5% до 53%, при раке предстательной железы ранней стадии - от 10% до 70%; при раке предстательной железы поздней стадии - от 6% до 82%.
   
3. 
   Гены ANXA2, IFI30, AQP3 метилированы в клеточных линиях рака предстательной железы, но не метилированы в клинических образцах простатической интраэпителиальной неоплазии и рака предстательной железы различных стадий.
   

Апробация работы

Основные результаты работы докладывались на международных конференциях: «Postdoctoral and Graduate Student Research Conference» (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, USA, 2007-2008); XLVI международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2008); I Всероссийский конгресс студентов и аспирантов - биологов «Симбиоз-Россия-2008» (Казань, 2008); II международная конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 статья в реферируемом журнале.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Работа содержит 37 рисунков и 8 таблиц. Список литературы содержит 222 цитированных работ, из них 207 иностранных.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Клинические образцы рака предстательной железы (РПЖ), простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) и морфологически нормальной предстательной железы были получены в госпитале ракового центра Фокс Чейз (Филадельфия, США) в результате оперативных вмешательств. Клинический диагноз был подтвержден патоморфологическим исследованием в отделении патоморфологии ракового центра Фокс Чейз. В общей сложности в работе было использовано 37 образцов ДНК, выделенной из опухолей пациентов с диагнозом РПЖ и 19 образцов – с диагнозом ПИН. В ходе исследования образцы РПЖ были разделены на две подгруппы. Первую подгруппу составляли образцы опухолей ранних стадий с суммой баллов по шкале Глисона не более 7; во вторую подгруппу были включены образцы опухолей с суммой баллов по шкале Глисона от 8 и выше. Средний возраст больных в первой подгруппе составил 55,9 лет (42-67 лет); во второй подгруппе – 64,1 года (54-82 года). Средний возраст больных ПИН на момент биопсии был 58,7 лет (50-74 лет). Также в работе были использованы три образца ДНК, выделенной из морфологически нормальной ткани предстательной железы (ПЖ), полученной от пациентов с диагнозом рак мочевого пузыря в результате оперативного вмешательства. Средний возраст пациентов составил 70 лет (63-81 год). Отсутствие новообразований в ПЖ было подтверждено патоморфологическим исследованием. Также для исследования были отобраны андроген - зависимые LNCaP и MDA2b и андроген - независимые PC-3 и DU-145 клеточные линии РПЖ.

Методы исследования. В работе были использованы следующие методы исследования: microarray, реакция обратной транскрипции, выделение ДНК и РНК из клеточных культур, выделение ДНК из тканевых срезов, зафиксированных в парафине и из замороженных срезов тканей, бисульфитная модификация ДНК, гель-электрофорез нуклеиновых кислот, выделение продуктов ПЦР из агарозного геля, секвенирование, ПЦР, ПЦР в реальном времени. Оценку транскрипционной активности клеточных генов в клетках ПЖ и анализ их CpG-островка проводили с помощью он-лайн ресурсов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Отбор клеточных линий и ингибиторов процесса метилирования.

В работе были использованы следующие клеточные линии РПЖ: андроген - зависимые клеточные линии LnCap и MDA2b, полученные из метастаз лимфатических узлов и костей; и андроген - независимые клеточные линии PC-3 и DU-145, полученные из костных метастаз и метастаз головного мозга соответственно. Наш выбор был обусловлен быстрой прогрессией опухолей предстательной железы от андроген - зависимого типа к андроген - независимому, что затрудняет их лечение вследствие потери чувствительности к гормональной терапии (Bokhoven et al., 2003).

В качестве ингибиторов процесса метилирования ДНК в работе были использованы 5-аза-2-деоксицитидин, представляющий собой химический аналог цитидина, обладающий способностью встраиваться в цепочку ДНК при репликации, вызывая ингибирование метилтрансферазной активности путем образования стабильного комплекса между 5-аза-2-диоксицитидиновым остатком в ДНК и активным центром фермента ДНК-метилтрансферазы (Momparler, 2005). Вторым ингибитором, также использованным в нашей работе, был трихостатин А - высокоспецифичный ингибитор гистондеацитилаз. Гистондеацитилазы синтезируются в большом количестве при различных видах опухолей. Эти ферменты катализируют процесс деацитилирования гистонов, в результате чего гистоны приобретают положительный заряд и прочно взаимодействуют с витками нуклеосомной ДНК. Таким образом, нуклеосомы приобретают компактное состояние и теряют способность взаимодействовать с факторами транскрипции (De Ruijter et al., 2003).

На предварительном этапе работы была определена оптимальная концентрация 5-аза-2-деоксицитидина, не вызывающая токсического эффекта. Было установлено, что концентрация 5 мкМ/л вызывает деметилирующий эффект с минимальным токсическим эффектом.

Microarray.

На первом этапе клетки клеточных линий РПЖ LNCaP, DU-145, PC-3 и MDA2b инкубировались в присутствии 5-аза-2-деоксицитидина (5 мкМ/л) и трихостатина А (500 нМ/л). Клетки контрольной группы инкубировались с эквивалентным количеством PBS и этанола. Из двух групп клеток, экспериментальной и контрольной, выделяли РНК, с последующим проведением реакции обратной транскрипции. Далее полученную кДНК метили с использованием флуоресцентных меток - производных индокарбоксицианина Су3 и индодикарбоксицианина Су5, и проводили реакцию гибридизации с ДНК чипом (MWG Biotech, Inc., High Point, USA), с иммобилизованными на нем 15 тыс. ДНК-зондами. Процесс гибридизации повторяли дважды с использованием метода flip-dye, при котором производилась взаимная замена использованных флуоресцентных меток. Одновременная детекция обоих сигналов в каждой из ячеек позволяет прямо сравнить их интенсивность и избежать ошибок, связанных с неполной воспроизводимостью результатов.

В ходе анализа результатов, полученных при двукратном повторении процесса гибридизации (рис. 1), были получены следующие данные. В клеточной линии РПЖ LNCaP двукратное увеличение экспрессии было зафиксировано в 663-х генах; в клеточной линии MDA2b – в 366 генах; в клеточной линии DU-145 – в 293-х генах; в клеточной линии РС-3 – в 641-м гене.


Рисунок 1. Результат сканирования слайда, полученного в результате гибридизации кДНК и ДНК чипа. Ячейки красного цвета соответствуют генам, экспрессия которых повысилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК. Ячейки зеленого цвета – генам с пониженной экспрессией. Ячейки желтого цвета – гены, экспрессия которых не изменилась.

Анализ экспрессии генов в клетках морфологически нормальной предстательной железы.

Для дальнейших исследований были отобраны 170 генов, экспрессия которых повысилась как минимум в три раза в трех из четырех клеточных линиях РПЖ. Далее был проведен сравнительный анализ уровня экспрессии идентифицированных генов в клетках морфологически нормальной ПЖ и ПЖ, пораженной раком. Используя базу данных Cancer Genome Anatomy Project (CGAP), где представлены результаты исследований уровней экспрессии генов в различных органах, как в норме, так и при раковой патологии (http://cgap.nci.nih.gov), мы проанализировали экспрессию каждого гена в клетках нормальной ПЖ и ПЖ, пораженной раком. Отсутствие экспрессии в клетках морфологически нормальной ПЖ было показано для 103-х генов.

Анализ CpG-островков.

При анализе CpG-островков использовались три основных критерия: распределение CpG динуклеотидов по нуклеотидной последовательности, GC состав и длина последовательности.

Так, для оценки распределения CpG динуклеотидов вычисляется показатель Н/Т по следующей формуле:

где Н - наблюдаемое число CpG динуклеотидов; Т – теоретическое число CpG динуклеотидов; n – число CpG в последовательности; N – общее число нуклеотидов в последовательности; N_С – число остатков цитозинов; N_G - число остатков гуанина. Для CpG-островка этот показатель должен быть ≥ 0,6. GC состав - доля цитозиновых и гуаниновых нуклеотидов в составе последовательности для CpG-островка должна быть не меньше 55%. Длина CpG-островка варьирует от 200 п.н. до несколько тысяч, составляя в среднем 1000 п.н. (Gardiner-Garden et al., 1987).

Данные условия отбора также способствуют исключению большинства Alu-повторяющихся элементов, которые могут входить в состав промоторов некоторых кодирующих белков генома человека и перекрываться с CpG-островками и цис-регуляторными модулями, представляющими собой кластеры сайтов связывания транскрипционных факторов, тем самым, влияя на экспрессию генов (Oei et al., 2004). Дополнительно с той же целью была использована компьютерная программа обнаружения повторов Repeat Masker (www.repeatmasker.org).

При анализе нуклеотидных последовательностей промоторов исследуемых генов на наличие CpG-островков в их составе использовалась компьютерная программа Webgene CpG island prediction (www.itb.cnr.it/sun/webgene/).

В результате анализа было установлено, что 16 генов не имеют в своем составе CpG островков; гены TLH29, APOD и CRYAB имеют в составе промоторов CpG-островки, не удовлетворяющие критериям отбора; ген TIMP1 располагается на Х хромосоме; ген IGF2R является импринтированным, а ген JUNB - онкогеном. Анализ литературы показал, что 20 генов ранее были изучены и результаты исследований опубликованы.

Таким образом, для дальнейшей работы были отобраны 25 генов (табл. 1), большинство из которых представляют собой гены, кодирующие транскрипционные факторы, а также рецепторы, белки-переносчики, белки цитоскелета и иммунного ответа.

Таблица 1. Хромосомная локализация и краткая характеристика отобранных генов.

	Ген	Хромосомная локализация	Функция гена
1	H1F2	6p22.2	Конденсация нуклеосом
2	TBX1C	22q11.21	Транскрипционный фактор
3	ID1	20q11.21	Негативная регуляция транскрипции
4	GNAI3	17q24.1	Связывание нуклеотидов
5	RELB	19q13.32	Транскрипционный фактор
6	BASP1	5q15.1	Связывание ДНК в клетках НС
7	FOSL2	2p23.2	Транскрипционный фактор
8	IRF6	1q32.2	Транскрипционный фактор
9	GADD45b	9q22.2	Регуляция клеточных процессов
10	CTSD	11p15.5	Протеолиз
11	IFI30	19p13.11	Иммунный ответ
12	DAF	1q32.2	Активация комплиментов
13	FXYD5	19q13.12	Клеточная адгезия
14	KRT7	12q13.13	Организация цитоскелета и биогенез
15	PDLIM4	5q23.3	Организация цитоскелета
16	TACSTD2	1p32.1	Рецептор, регулятор уровня Са2+
17	ANXA2	15q22.2	Связывание иона кальция
18	ITGA3	17q21.33	Рецептор
19	ECGF1	22q13.33	Фактор роста
20	ARL6IP	16p12.3	Транспорт белков, клеточный сигналинг
21	AQP3	9p13.3	Транспорт белков, клеточный сигналинг
22	SLC15A3	11q12.2	Транспорт белков
23	ARL7	2q37.1	Связывание ГТФ и ГДФ
24	ACAA2	18q21.1	Ацетил-КоА-ацилтрансферазная активность
25	ASNS	7q21.3	Аспартатная и аспарагиновая активность

следующая страница>