На правах рукописи

ШЕСТАКОВ АЛЕКСЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИИ РЯДА ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ

03.00.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук

Москва – 2006
Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП “Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов” (ФГУП “ГосНИИ генетика”).

Научный консультант:	доктор биологических наук, профессор Носиков Валерий Вячеславович.
Научный руководитель:	кандидат биологических наук Савостьянов Кирилл Викторович
Официальные оппоненты:	доктор биологических наук, профессор Фаворова Ольга Олеговна кандидат биологических наук Бабенко Ольга Владимировна
Ведущая организация:	Институт Молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Защита состоится «21» декабря 2006г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».
Реферат разослан « » ноября 2006.г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Заиграева Г.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Прогрессирование хронических заболеваний почек и поиск способов предотвращения их развития, а также замедления прогрессирования остается одной из наиболее актуальных проблем нефрологии.

В общей сложности, по данным крупных европейских медицинских центров, наследственные гломерулопатии занимают от 6,5 до 15% среди патологий, ведущих к хронической почечной недостаточности (ХПН). Связь той или иной патологии почек с генетическими дефектами может помочь выработать тактику терапии этих заболеваний.

Роль генетики в развитии нефрологии состоит не только в выявлении генетической компоненты заболевания, но и в изменении представлений о так называемых приобретенных заболеваниях, появлении новых концепций механизмов развития болезни, дополнении информации о предохраняющих и предрасполагающих факторах в развитии заболеваний, а также формировании гипотезы о совокупности экзогенных и эндогенных факторов, приводящих к болезни.

Для многофакторных заболеваний характерен сложный механизм формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды. Однако для каждого конкретного заболевания можно выделить группу, так называемых генов-кандидатов, продукты которых могут быть прямо или косвенно вовлечены в развитие данной патологии.

Одним из наиболее перспективных направлений в современной молекулярной генетике заболеваний является поиск полиморфных маркеров в генах-кандидатах и выявление их ассоциации с наследственными заболеваниями.

При исследовании ассоциации сравнивают распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера, расположенного внутри или рядом с геном-кандидатом, в группах больных и здоровых доноров. Наличие достоверных различий в распределении аллелей и генотипов свидетельствует об ассоциации полиморфного маркера с заболеванием.

Установление ассоциации гена с заболеванием и последующая оценка индивидуального генетического риска имеют важное значение для разработки дифференцированного подхода к профилактике и лечению данной патологии и ее осложнений в зависимости от наследственной предрасположенности конкретного больного.

Цель и задачи работы. Целью данной работы явилось изучение ассоциации ряда полиморфных маркеров генов-кандидатов с развитием хронического гломерулонефрита. Это были полиморфные маркеры внутри генов, кодирующих подоцин (NPHS2), нефрин (NPHS1), антагонист рецептора интерлейкина 1 (IL1RN), интерлейкин 4 (IL4), интерлейкин 13 (IL13), поверхностный антиген цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4), ген–супрессор опухолей (TP53), главный регулятор супрессора опухолей р53 (MDM2) и поли(ADP-рибозил)полимеразу (ADPRT1). Кроме того использовались микросателлитные маркеры D6S2414 и D6S1271, расположенные рядом с генами HLA класса II.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов NPHS2, NPHS1, IL1RN, IL4, IL13, CTLA4, TP53, MDM2 и ADPRT1, а также, полиморфных микросателлитов D6S2414 и D6S1271 в группе больных ХГН и в группе здоровых доноров.

2. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров, расположенных в вышеуказанных генах–кандидатах, и двух полиморфных микросателлитов в области HLA в исследованных выборках для выявления их ассоциации с развитием ХГН и определения вклада данных генов в наследственную предрасположенность к патологии.

Научная новизна работы. В этой работе впервые в мире исследована ассоциация полиморфных маркеров A(–601)G и Arg229Gly гена NPHS2, Glu117Lys гена NPHS1, VNTR во втором интроне гена IL1RN, С(-590)Т гена IL4, G4257A гена IL13, Ala17Thr гена CTLA4, Pro72Arg гена TР53, G(–309)T гена MDM2, Val762Ala и Leu54Phe гена ADPRT1, полиморфных микросателлитов D6S2414 и D6S1271 у русских пациентов с ХГН, проживающих в г. Москве.

Практическая ценность работы. Выявление аллельных вариантов полиморфных маркеров различных генов-кандидатов, обуславливающих повышенный генетический риск развития хронического гломерулонефрита, создает базу для разработки диагностических методов прогнозирования течения заболевания.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ Генетика» 25 Октября 2006 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, включая 3 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на конференциях.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 94 страницах машинописного текста и содержат 16 таблиц и 11 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.Формирование группы больных с хроническим гломерулонефритом и методы исследования.

Общеклиническое обследование и формирование выборки больных, проводилось в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева ММА им. И. М. Сеченова, в Детской Городской больнице №13 им. Н.Ф. Филатова, а также в Научном Центре Здоровья Детей РАМН.

Морфологическое исследование ткани почки, полученной с помощью чрезкожной биопсии, проводилось на кафедре патологической анатомии ММА им. И. М. Сеченова. При определении морфологического варианта ХГН использовали классификацию В. В. Серова (1977 г.).

Обследовано 370 человек: 290 больных ХГН и 80 человек без заболеваний почек и артериальной гипертензии, составивших контрольную группу. Оценка клинических особенностей ХГН проводилась у больных на основании данных анамнеза. Она включала анализ дебюта ХГН, клинических и морфологических вариантов нефрита с характеристикой лабораторных показателей на момент первого обследования и на момент биопсии почки, а также анализ течения ХГН.

Анализ нуклеотидных последовательностей интересующих нас хромосомных областей осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov), используя при этом следующие разделы: MapView (расположение этих полиморфных маркеров на хромосоме), dbSNP (информация об однонуклеотидных полиморфизмах). Для подбора праймеров и рестриктаз использовали пакеты программ DNAStar и VectorNTI 9.0.

Идентификация аллелей полиморфных маркеров проводилась с использованием полимеразной цепной реакции, дальнейшего расщепления фрагментов ДНК рестриктазами и электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 8-12%-ном полиакриламидном геле или в 2-3% -ном агарозном геле.

2. Изучение ассоциации полиморфных маркеров A(–601)G и Arg229Gly гена NPHS2 с ХГН.

Интегральный мембранный белок подоцин с молекулярной массой 42 кДа относится к стоматиновому протеиновому семейству и на 47% гомологичен стоматину человека. В основном подоцин экспрессируется в гломерулярных подоцитах и в меньшей степени - в яичках, фетальных тканях сердца и печени (Вoute et al, 2000). Подоцин, подобно «шпильке», замыкает нефрин в подоцитах и тем самым входит в единую структуру щелевой диафрагмы (ЩД) (Roselli et al, 2002), а также связан с липидными мостиками последней (Schwarz et al, 2001). Роль подоцина в формировании гломерулопатий стало возможным изучить после идентификации гена, кодирующего этот белок. Ген подоцина (NPHS2) расположен в хромосомной области 1q25-q31 (Huber et al, 2003). В пятом экзоне гена NPHS2 расположен однонуклеотидный полиморфизм A/G, в положении 755 от точки начала транскрипции, которому соответствует полиморфизм аминокислотных остатков Arg/Gly в положении 229.

По данным Перейры и соавторов (2004) носительство гетерозиготного генотипа Arg229Gly коррелирует с микроальбуминурией у людей, не имеющих заболеваний почек (Pereira et al, 2004). В ряде случаев спорадически возникший ФСГС во взрослом состоянии был ассоциирован с носительством гетерозиготного генотипа Arg/Gly. Считается, что у этих людей достаточно полно сохранена функция подоцина в детском возрасте, но в дальнейшем она утрачивается, приводя к развитию нефротического синдрома.

В группах ХГН и здоровых доноров частота аллеля Gly резко преобладала над частотой аллеля Arg. Наиболее распространенным генотипом в обеих группах были гомозиготы Gly/Gly (0,87 и 0,89 в группе больных хроническим гломерулонефритом и здоровых доноров, соответственно). Гомозиготы Arg/Arg не наблюдались ни в группе ХГН, ни в группе здоровых доноров. В группе больных с ХГН было отмечено незначительное увеличение содержания гетерозигот Arg/Gly, однако оно носило недостоверный характер (табл. 1).

Таблица 1.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Arg229Gly гена NPHS2 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе здоровых доноров (ЗД).

Аллели и генотипы	Частота аллелей и генотипов		p
	ХГН (n = 290)	ЗД (n = 80)
Аллель Arg	0,065	0,053	НД
Аллель Gly	0,935	0,947	НД
Генотип Arg/Arg	-	-	-
Генотип Arg/Gly	0,130	0,105	НД
Генотип Gly/Gly	0,870	0,895	НД

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии ассоциации полиморфного маркера Arg229Gly гена NPHS2 с развитием ХГН.

Второй полиморфный маркер расположен в промоторном участке гена NPHS2 и также представляет собой однонуклеотидный полиморфизм A/G в положении –601 п.н. от участка инициации транскрипции. В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля G, при этом наиболее частыми генотипами являлись: в группе больных гомозиготные генотипы G/G, а в группе контроля гетерозиготные генотипы A/G (0,47 и 0,59 в группах ХГН и здоровых доноров, соответственно). Гомозиготные генотипы A/A наблюдались крайне редко – их доля в выборке больных и здоровых доноров составляла 0,10 и 0,09, соответственно (табл. 2).

Таблица 2.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера A(-601)G гена NPHS2 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе здоровых доноров (ЗД).

Аллели и генотипы	Частота аллелей и генотипов		p	OR	CI
	ХГН (n = 290)	ЗД (n = 80)
АллельA	0,31	0,39	НД	-	-
Аллель G	0,68	0,60	НД	-	-
Генотип A/A	0,10	0,09	НД	-	-
ГенотипA/G	0,41	0,59	0,019	0,49	0,27-0,88
ГенотипG/G	0,47	0,31	0,027	1,99	1,09-3,63

Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов выявил как снижение доли генотипа A/G, так и возрастание содержания гомозигот G/G в группе больных по сравнению с контрольной группой. Эти различия статистически достоверны и свидетельствуют об ассоциации данного полиморфного маркера с хроническим гломерулонефритом. При этом носительство гетерозиготного генотипа A/G связано с устойчивостью к развитию ХГН (OR = 0,49; CI 0,27 – 0,88), тогда как гомозиготность по аллелю G повышает риск развития патологии (OR = 1,99; CI 1,09-3,63).

3. Изучение ассоциации полиморфного маркера Glu117Lys гена NPHS1 с ХГН.

Нефрин является основным белком щелевой диафрагмы (ЩД), он связывает два рядом расположенных подоцита (Holzman et al, 1999). Обнаружение нефрина в составе ЩД дало новое понимание клубочкового фильтра и роли ЩД как заключительного фильтрационного барьера для прохождения белка (Kestila et al, 1998).

Нефрин – это трансмембранный белок, который относится к суперсемейству иммуноглобулинов с адгезивными функциями. Он состоит из 1241 аминокислотного остатка и его молекулярная масса составляет 185 кДа (Lenkkeri et al, 1999). Доказательством важной роли нефрина в клубочковой фильтрации служат исследования, проведенные на крысах. Инъекция моноклональных антинефриновых антител, приводила к развитию протеинурии (Orikasa et al, 1988). Эти данные подтверждают значимость нефрина как обязательного компонента щелевой мембраны, формирующей фильтрационный барьер гломерул (Tryggvason et al, 1999). Нарушения в структуре как самого нефрина, так и ассоциированного с ним белкового комплекса приводят к изменениям архитектоники подоцита - сглаживанию «ножек» и протеинурии (Вoute et al, 2000). В 1998 г. Кестила и соавт. обнаружили, что ген NPHS1, расположенный на хромосоме 19, ответственен за развитие врожденного нефротического синдрома финского типа (Kestila et al, 1998). Ген NPHS1 содержит 29 экзонов. В финской популяции обнаружены две мутации: делеция в экзоне 2 и нонсенс-мутация в экзоне 26. Обе мутации приводят к нарушению синтеза нефрина.

В экзоне 3 гена NPHS1 (положение 349) расположен однонуклеотидный полиморфизм A/G, которому соответствует полиморфизм аминокислотных остатков Glu/Lys в положении 117. Ланденкари и соавт. обнаружили, что этот полиморфный маркер (G349A) ассоциирован как с той формой ХГН, что поддается терапии стероидами при минимальных изменениях нефротического синдрома (форма зависимоя от стероидов), так и с другой формой ХГН, при которой стероиды не эффективны (форма устойчивая к действию стероидов) (Landenkari et al, 2004).

Таблица 3.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Glu117Lys гена NPHS1 в группе больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) и в группе здоровых доноров (ЗД).

Аллели и генотипы	Частота аллелей и генотипов		p
	ХГН (n = 290)	ЗД (n = 80)
Аллель Lys	0,35	0,39	НД
Аллель Glu	0,65	0,61	НД
Генотип Lys/Lys	0,11	0,14	НД
Генотип Lys/Glu	0,47	0,51	НД
Генотип Glu/Glu	0,41	0,35	НД

В группах ХГН и здоровых доноров частота аллеля Glu резко преобладала над частотой аллеля Lys, также как и встречаемость гомозигот Glu/Glu - над встречаемостью генотипа Lys/Lys (табл. 3). При этом различия в распределении аллелей и генотипов между двумя группами были незначительными и носили недостоверный характер.

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии ассоциации полиморфного маркера Glu117Lys гена NPHS1 с развитием хронического гломерулонефрита. Возможно, отсутствие корреляции между нашими данными, и данными, полученными Ланденкари с соавт. (Landenkari et al, 2004), связано с различиями в формировании группы больных.

4. Изучение ассоциации полиморфного минисателлита, расположенного в интроне 2 гена IL1RN, с ХГН.

Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма. В первую очередь они регулируют развитие местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и клеток эпителия. Гиперпродукция цитокинов ведет к развитию системной воспалительной реакции и может служить причиной развития ряда патологических состояний, в частности, гломерулонефрита. Экспрессия генов цитокинов начинается в ответ на проникновение в организм патогенов, антигенное раздражение или повреждение тканей. Согласно данным последних лет, полиморфизм генов, кодирующих цитокины, оказывает существенное влияние на предрасположенность к гломерулонефриту и способу его лечения, в частности на цитокиновую и антицитокиновую терапию.

Антагонист рецептора интерлейкина-1 блокирует связывание интерлейкинов 1α и 1β (IL-1α и IL-1β) с рецептором. Ингибирующее действие антагониста имеет важное физиологическое значение в организации иммунного ответа и в развитии воспалительного процесса при различных патологиях. Ген IL1RN картирован в хромосомной области 2q14.2 (Patterson et al, 1993). Его продуктами являются две изоформы антагониста, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга. Одна из них остается в цитоплазме, а другая секретируется наружу. Секреция антагониста осуществляется гепатоцитами, регулируется цитокинами на стадиях, предшествующих воспалительной реакции и происходит во время острой фазы воспалительного процесса (Gabay et al, 1997).

В интроне 2 гена IL1RN расположен VNTR, состоящий из тандемных повторов длиной 86 п.н. Минисателлит включает 5 аллелей, из которых наиболее распространены аллели с четырьмя (IL1RN*4) и двумя (IL1RN*2) повторами (Tarlow et al., 1993). При этом аллель IL1RN*2 является маркером риска многих хронических заболеваний, сопровождающихся воспалительным процессом: язвы кишечника (Mansfield et al, 1994), системной красной волчанки (Иллариошкин и соавт., 1995), сепсиса (Fang et al, 1999) и других. Противоречивы данные о роли гена IL1RN в развитии таких аутоиммунных заболеваний как ревматоидный артрит (Tjernstrom et al, 1999) и базедова болезнь (Blakemore et al, 1995). Показана ассоциация аллеля IL1RN*2 с повышенным риском поражения почек при СД типа 1 (Blakemore et al, 1996).

При анализе контрольной выборки (80 человек) было выявлено 3 аллеля длиной 240, 410 и 495 п.н. (табл. 5). В группе больных ХГН встречались 4 аллеля размером 240, 326, 412, 495 п.н. Наибольшими частотами в группах больных и контроля обладали аллели с 2 (0,273 и 0,290) и 4 (0,699 и 0,685) повторами соответственно.

Из 10 возможных генотипов нам удалось обнаружить 6. В группах больных и здоровых доноров преобладали гетерозиготные генотипы 2/4 (0,481 и 0,419) и гомозиготные генотипы 4/4 (0,435 и 0,468), соответственно (табл. 4).

следующая страница>