УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

На правах рукописи

Мингалеева Римма Ниязовна

03.01.03 – Молекулярная биология

УНИВЕРСАЛЬНАЯ СИСТЕМА ИНТЕНСИФИКАЦИИ РАБОТЫ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОМОТОРОВ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва–2010

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук

Чернов Игорь Павлович
Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Лебедев Юрий Борисович
кандидат биологических наук

Эльдаров Михаил Анатольевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН

Защита состоится «20» октября 2010 г. в 10-00 часов на заседании Специализированного Совета Д.002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.
С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Автореферат разослан « 15 » сентября 2010 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

доктор физ.-мат. наук Олейников В.А.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Спустя несколько десятилетий интенсивных исследований и попыток разработать эффективные методы терапии рака, смертность от рака продолжает расти. В связи с этим усилия многих исследовательских групп по всему миру направлены на поиск новых способов лечения рака. Использование генной терапии в противоопухолевой медицине является одним из наиболее активно развивающихся, и кажущееся перспективным для создания противоопухолевых препаратов, направлений, в основе которого лежит доставка генов терапевтического вмешательства в клетки опухолей. При данном подходе создается возможность специфического воздействия противоопухолевого агента только на раковые клетки, за счет чего можно значительно снизить токсичность и побочные эффекты по сравнению с химио- и радиотерапией. Метод позволяет воздействовать и на дефектные гены, изменение экспрессии которых приводит к развитию заболевания.

Одним из главных требований, предъявляемых к генно-терапевтическому препарату, является высокий уровень экспрессии гена терапевтического вмешательства в клетках-мишенях, который определяется его регуляторными элементами - промоторами. Наиболее сильными среди изученных промоторов являются конститутивные вирусные промоторные системы, например, промотор ранних генов цитомегаловируса. Прямое использование таких промоторов для регуляции экспрессии трансгена в опухоли эффективно, но имеет серьезный недостаток – неспецифичность экспрессии, что приводит к токсичности терапевтического препарата для нормальных клеток и тканей.

Специфически «включить» экспрессию гена терапевтического вмешательства в клетках опухоли можно с помощью опухолеспецифических промоторов или промоторов, отвечающих на изменения условий, характерных для клеток опухоли (например, состояние гипоксии при твердых опухолях человека). Активность опухолеспецифического промотора ограничена раковыми клетками, то есть, экспрессия гена, направляемого таким промотором, наблюдается только в клетках опухоли. Спектр опухолеспецифических промоторов, известных на сегодняшний день, достаточно широк и частично отображает разнообразие видов рака. Большинство таких промоторов имеет специфичность только к определенным типам опухолей, что ограничивает их использование и сильно сужает рамки их применения. Обнаружено и исследовано несколько более универсальных промоторов, которые активны в большинстве опухолевых клеток. К ним относятся промоторы гена сурвивина человека (BIRC5) и гена обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT). Однако, многие из этих промоторов ингибируются активным белком р53, который сохраняет активность во многих типах опухолей.

Существенным недостатком всех опухолеспецифических промоторов является их низкая активность, повысить которую можно несколькими способами: изменить состав регуляторных элементов внутри такого промотора или использовать индуцибельные двухстадийные (бинарные) системы, позволяющие специфически экспрессировать ген терапевтического вмешательства на высоком уровне в опухолевых клетках. Примером бинарной системы регуляции экспрессии является Tat-TAR-система вируса иммунодефицита человека. В ее основе лежит способность белка tat трансактивировать промотор LTR ВИЧ-1 после взаимодействия с TAR-элементом вируса. В данной работе разработана векторная система, позволяющая использовать Tat-TAR-систему повышения активности промотора LTR ВИЧ-1 для усиления опухолеспецифической экспрессии генов терапевтического вмешательства в раковых клетках. Показано, что эффективность полученной системы не зависит от статуса белка p53 в клетках.
Цели и задачи работы

Цель данной работы заключалась в создании универсальной системы, позволяющей специфически усиливать активность опухолеспецифических промоторов.

В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Создать бинарную систему, позволяющую оценить способность Tat-TAR-системы ВИЧ-1 усиливать экспрессию генов в клетках человека.

2. Получить систему, в которой ген tat находится под контролем опухолеспецифического промотора, а ген терапевтического вмешательства - под контролем TAR-элемента ВИЧ-1. На опухолевых клеточных линиях человека проверить эффективность полученной системы.

3. Провести сравнительный анализ активности разработанной системы и сильного неспецифического вирусного промотора.

4. Определить, влияет ли на эффективность полученной системы p53-статус трансфицируемых клеток.

5. Проверить функциональность разработанной системы в генной терапии рака, основанной на использовании ген-опосредованного внутриопухолевого превращения протоксина в токсин (gene-directed enzyme prodrug therapy, GDEPT).

Научная новизна и практическая значимость работы

В данной работе была предложена система на основе Tat-TAR-взаимодействия ВИЧ-1 и опухолеспецифического промотора, позволяющая индуцировать высокий уровень экспрессии трансгена в опухоли. Эффективность разработанной системы сравнима с эффективностью промотора ранних генов цитомегаловируса и более чем в 100 раз выше эффективности опухолеспецифических промоторов. На примере гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-tk) был показан потенциал разработанной системы для терапии рака, а именно, специфическое подавление роста опухолевых клеток, независимо от их p53-статуса.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на российских конференциях: II международная научно-практическая конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008); XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009); Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009).

Объем работы

Диссертационная работа изложена на 95 страницах, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждений, основных выводов и списка литературы из 285 наименований. Диссертация содержит 6 таблиц и 27 рисунков.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 печатные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Проверка Tat-TAR-системы ВИЧ-1 на способность усиливать экспрессию гена HSV-tk

5’LTR ВИЧ-1 обладает свойствами индуцибельной промоторной системы, в которой вирусный белок tat связывается с участком мРНК, соответствующим TAR-последовательности LTR, что приводит к трансактивации промотора LTR и к усилению транскрипции подконтрольных генов. В отсутствии белка tat экспрессия генов минимальна (рис. 1).

Рис. 1. Схема трансактивации промотора LTR ВИЧ-1. В отсутствии белка tat синтезируются короткие абортивные транскрипты длиной около 60 нуклеотидов. Белок tat связывается с участком мРНК, соответствующим TAR-элементу, после чего происходит трансактивация промотора LTR ВИЧ-1 и синтез полноразмерных транскриптов.
Ген tat и TAR-элемент ВИЧ-1 были клонированы в две векторные конструкции (рис. 2, рис. 4). Это позволяет определить уровень базальной экспрессии трансгена под контролем LTR ВИЧ-1 и степень трансактивации промотора LTR ВИЧ-1 при наличии белка tat в клетке (рис. 2). Для клонирования конструктов были выбраны ретровирусные вектора, поскольку они проникают только в делящиеся клетки, то есть имеют определенную селективность к опухоли, и дают возможность получить клетки, стабильно экспрессирующие исследуемый ген.

Рис. 2. Схема индуцибельного усиления экспрессии трансгена с помощью Tat-TAR-системы ВИЧ-1. Система предполагает использование двух векторов, в одном из которых активность гена tat может регулироваться опухолеспецифическим или любым другим подходящим промотором, а во втором - экспрессия трансгена находится под контролем LTR ВИЧ-1. В отсутствии белка tat экспрессия трансгена минимальна.
Для работы был выбран фрагмент LTR ВИЧ-1 с делетированным модуляторным районом, то есть не содержащий негативные элементы регуляции транскрипции. Таким образом, фрагмент LTR ВИЧ-1 состоял из элементов базального промотора и энхансерного района. Выбранный нами вариант LTR был назван ΔLTRep (рис. 3).

Рис. 3. Схема ΔLTRep ВИЧ-1. Прямоугольниками обозначены районы 5'LTR ВИЧ-1: U3, R, U5; Enh – энхансерный и Pr - промоторный участки, TAR-элемент; стрелками в нижней части рисунка обозначен участок ΔLTRep, используемый в экспрессионной конструкции. Цифрами указано положение нуклеотидных остатков на кДНК ВИЧ-1.

Ген tat был клонирован под контроль неспецифического конститутивного промотора 5'LTR вектора pFB-neo, а ген HSV-tk – под контроль ΔLTRep в вектор pQCXIX в направлении, обратном направлению транскрипции вектора (рис. 4). Для получения стабильных трансфектантов вектора pQCXIXb в его состав была введена экспрессионная кассета, несущая ген гигромицин-фосфотрансферазы В под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса.

Для проверки способности Tat-TAR-системы усиливать экспрессию гена HSV-tk полученные конструкции (Tat-pFB-neo и pQCXIXb) были использованы для транзиентной трансфекции клеток HEK293. Клетки трансфицировали либо конструкцией pQCXIXb, либо одновременно pQCXIXb и Tat-pFB-neo. Спустя 48 часов после трансфекции готовили клеточные экстракты и анализировали уровень экспрессии трансгена методом иммуноблоттинга с использованием антител к HSV-tk. В качестве контроля использовали экстракты нетрансфицированных клеток HEK293. Для нормирования концентрации белка в клеточных экстрактах использовали иммуноокрашивание мембран с помощью антител к GAPDH.

Рис. 4. Схема экспрессионных векторов Tat-pFB-neo и pQCXIXb. Стрелками указаны направления транскрипции векторов и экспрессионной кассеты ΔLTRep-tk. Прямоугольниками обозначены: LTR вектора pFB-neo и pQCXIXb, гены tat и HSV-tk, фрагмент LTR ВИЧ-1 (ΔLTRep), внутри которого выделен TAR-элемент и поли-А сигнал вируса SV40.
Количество HSV-tk в экстрактах, несущих конструкции pQCXIXb и Tat-pFB-neo (рис. 5, 3), значительно превышало количество данного белка в экстрактах клеток, трансфицированных только конструкцией pQCXIXb (рис. 5, 2). В экстрактах контрольных нетрансфицированных клеток HEK293 белок соответствующей молекулярной массы отсутствовал (рис. 5, 1). Таким образом, в клетках, содержащих обе конструкции, наблюдалась трансактивация промотора LTR ВИЧ-1 и усиление экспрессии гена HSV-tk.

Рис. 5. Вестерн-блот анализ белков HSV-tk и GAPDH в экстрактах клеток HEK293, трансфицированных: 2 – pQCXIXb, 3 – pQCXIXb и Tat-pFB-neo; 1 – нетрансфицированные клетки.

Оценка эффективности усиления экспрессии Tat-TAR-системы ВИЧ-1 в опухолевых клетках линии Calu-1 при стабильной трансфекции

Усиливающая активность Tat-TAR-системы при интеграции исследуемых конструкций

(рис. 4) в геномную ДНК были проверены на клетках линии эпидермоидной карциномы легких человека (Calu-1). Для этого были получены клетки Calu-tat, стабильно трансфицированные вектором Tat-pFB-neo, которые в дальнейшем транзиентно трансфицировали конструкцией pQCXIXb. Базальный уровень экспрессии гена HSV-tk под контролем ΔLTRep оценивали при транзиентной трансфекции клеток Calu-1 конструкцией pQCXIXb. Клеточные экстракты анализировали спустя 48 часов после трансфекции.


Рис. 6. Вестерн-блот анализ белков HSV-tk и GAPDH в экстрактах клеток Calu-1 (1) и Calu-1-tat (2), транзиентно трансфицированных pQCXIXb.

В экстрактах клеток, стабильно трансфицированных геном tat и транзиентно трансфицированных конструкцией pQCXIXb (рис. 6, 2), уровень экспрессии гена HSV-tk значительно превышал фоновый уровень экспрессии данного гена, наблюдаемый в экстрактах клеток Calu-1, трансфицированных конструкцией pQCXIXb (рис. 6, 1). Таким образом, Tat-TAR-система эффективно усиливает экспрессию гена HSV-tk в опухолевых клетках, если ген tat стабильно экспрессируется в них. Однако, наши попытки получить двойные трансфектанты клеток Calu-1, несущие не только ген tat, но и конструкт ΔLTRep-tk, оказались неудачными вследствие систематически возникающей делеции ΔLTRep фрагмента вектора при селекции клеток на гигромицине. Подобные результаты были получены также для других клеточных линий. В дальнейшем конструкты доставлялись в клетки транзиентно с помощью Липофектамина 2000.

Степень трансактивации промотора LTR ВИЧ-1 зависит от промотора, контролирующего активность гена tat

Эффект усиления экспрессии гена HSV-tk, находящегося под регуляцией Tat-TAR-системы, мог бы использоваться для усиления активности опухолеспецифических промоторов при сохранении их специфичности в опухолевых клетках. Для проверки такого предположения была получена экспрессионная конструкция (pSurv-tat), несущая ген tat под контролем промоторного участка гена сурвивина человека (pSurv) (рис. 7). Чтобы оценить активность опухолеспецифического промотора также была получена конструкция (pCMV/E-tat), в которой ген tat находится под регуляцией сильного неспецифического промотора ранних генов цитомегаловируса, усиленного энхансером (pCMV/E) (рис. 7). Экспрессионная кассета ΔLTRep-tk была перемещена из вектора pQCXIXb (рис. 4) в вектор на основе pGEM-T. В дальнейшем с помощью этих векторов осуществлялась транзиентная экспрессия как усиливающей кассеты, так и кассеты, содержащей ген терапевтического вмешательства.

Рис. 7. Схема экспрессионных кассет pCMV/E-tat, pSurv-tat и ΔLTRep-tk, полученных на основе плазмидных векторов. Указаны две усиливающие кассеты (pCMV/E-tat и pSurv-tat), которые действуют на промотор LTR ВИЧ-1 и активируют экспрессию гена HSV-tk. Внутри фрагмента LTR ВИЧ-1 обозначен TAR-элемент.

Клетки Calu-1 трансфицировали либо конструкцией ΔLTRep-tk, либо вариантами бинарной системы: pSurv-tat и ΔLTRep-tk, или pCMV/E-tat и ΔLTRep-tk. Количество HSV-tk в клетках, трансфицированных pSurv-tat и ΔLTRep-tk (рис. 8, 4) и в клетках, несущих pCMV-tat и ΔLTRep-tk (рис. 8, 3), примерно совпадало и было существенно выше, чем в клетках, трансфицированных ΔLTRep-tk (рис. 8, 2). В экстрактах нетрансфицированных клеток белок HSV-tk не был зарегистрирован (рис. 8, 1).

Рис. 8. Вестерн-блот анализ белков HSV-tk и GAPDH в клеточных экстрактах Calu-1, трансфицированных: 2 - ΔLTRep-tk, 3 - ΔLTRep-tk и pCMV/E-tat, 4 - ΔLTRep-tk и pSurv-tat. 1 – нетрансфицированные клетки.

Известно, что активность промотора гена сурвивина человека отличается от активности промотора ранних генов цитомегаловируса, усиленного энхансером, примерно в 5-10 раз в зависимости от клеточной линии, используемой в трансфекции. В нашем эксперименте способность к усилению экспрессии конструкций pCMV/E-tat и pSurv-tat отличалась незначительно (рис. 8, 3 и 4). Возможно, что такое поведение промоторов, обладающих разной активностью, в Tat-TAR-системе ВИЧ-1, обусловлено тем, что для трансактивации промотора LTR ВИЧ-1 достаточно небольшого количества белка tat. Вероятно, что это количество может обеспечить промотор гена сурвивина, обладающий сравнительно невысокой активностью. Белок tat, ген которого кодируется в конструкции pCMV/E-tat, синтезируется в избытке и не изменяет уровень трансактивации выше определенного значения.

Чтобы проверить это предположение мы трансфицировали клетки Calu-1 конструкциями ΔLTRep-tk и pCMV/E-tat (рис. 7), изменив стандартное соотношение плазмид в котрансфекции с 1:1 на 1:4 или на 4:1 (рис. 9). Результаты Вестерн-блот анализа представлены на рис. 9. Видно, что повышение концентрации плазмиды pCMV/E-tat в котрансфекции не приводит к увеличению количества HSV-tk (рис. 9, 3), причем белок HSV-tk синтезируется примерно на одном уровне в клетках, трансфицированных стандартным сочетанием плазмид в трансфекции (1:1) (рис. 9, 2), сочетанием 1:4 (рис. 9, 3) и 4:1 (рис. 9, 4). То есть, для проявления наибольшего уровня трансактивации промотору LTR ВИЧ-1 достаточно того количества белка tat, которое синтезируется с плазмиды pCMV/E-tat, находящейся в меньшей концентрации относительно плазмиды ΔLTRep-tk. Возможно, что в случае замены промотора ранних генов цитомегаловируса на промотор, обладающий более слабой активностью, уровень трансактивации при таком соотношении плазмид бинарной системы будет другим.

№ дорожки	1	2	3	4
ΔLTRep-tk	2 мкг	2 мкг	2 мкг	2 мкг
pCMV/E-tat	-	2 мкг	8 мкг	0,5 мкг
соотношение ΔLTRep-tk к pCMV/E-tat	-	1:1	1:4	4:1

Рис. 9. Вестерн-блот анализ белков HSV-tk и GAPDH в экстрактах клеток, трансфицированных указанными в таблице конструкциями ΔLTRep-tk и pCMV/E-tat в разных соотношениях. Во всех вариантах трансфекций концентрация ΔLTRep-tk была одинаковой, а концентрация pCMV/E-tat была выше (3) или ниже (4) стандартной концентрации (2).

При оценке влияния концентрации плазмид в котрансфекции в бинарной системе, несущей ΔLTRep-tk и pSurv-tat, мы наблюдали противоположную картину. Уровень трансактивации промотора LTR ВИЧ-1 в котрансфекции плазмид ΔLTRep-tk и pSurv-tat прямо зависел от концентрации плазмиды pSurv-tat в клетке: чем меньше данной конструкции в клетке, тем слабее уровень экспрессии гена HSV-tk (рис. 10, 2, 3, 4), а значит, избыток плазмиды pSurv-tat над конструкцией ΔLTRep-tk будет приводить к более высокому уровню трансактивации и к значительному повышению синтеза HSV-tk.

№ дорожки	1	2	3	4
ΔLTRep-tk	2мкг	2мкг	2мкг	2 мкг
pSurv-tat	-	2мкг	0,5мкг	0,2мкг
соотношение ΔLTRep-tk к pSurv-tat	-	1:1	4:1	10:1

Рис. 10. Вестерн-блот анализ белков HSV-tk и GAPDH в экстрактах клеток, трансфицированных указанными в таблице конструкциями (ΔLTRep-tk и pSurv-tat) в разных соотношениях. Во всех вариантах трансфекций концентрация ΔLTRep-tk была одинаковой, а концентрация pSurv-tat понижалась в 4 и в 10 раз (3 и 4, соответственно) относительно стандартной концентрации (2).

Клетки Calu-1 были котрансфицированы конструкциями ΔLTRep-tk и pSurv-tat в сочетании плазмид 1:4 (2 и 8 мкг конструкций, соответственно) (рис. 11, 4), а также 1:1 (по 2 мкг каждой конструкции) (рис. 11, 3). Было показано, что избыток конструкции pSurv-tat над ΔLTRep-tk приводит к повышению уровня экспрессии гена HSV-tk, что опосредовано более эффективной трансактивацией промотора LTR ВИЧ-1 (рис. 11, 3 и 4).

Кроме того, мы оценили, какое сочетание плазмид в котрансфекции будет наиболее удачным для трансактивации промотора LTR ВИЧ-1: 5 мкг плазмиды ΔLTRep-tk и 5 мкг pSurv-tat (соотношение плазмид 1:1, стандартно используемое в котрансфекции 25 см²-флакона) (сочетание А) (рис. 11, 6), или 2 мкг ΔLTRep-tk и 8 мкг pSurv-tat (соотношение 1:4) (сочетание Б) (рис. 11, 4). Наибольшее количество HSV-tk было получено в клетках с сочетанием А (рис. 11, 6), однако, в клетках с сочетанием Б количество HSV-tk было снижено незначительно (рис. 11, 4). При этом фоновый уровень экспрессии гена HSV-tk в экстрактах клеток с сочетанием Б был ниже, чем в экстрактах клеток с сочетанием А. Это обусловлено, по-видимому, разным количеством конструкции ΔLTRep-tk в трансфекции (рис. 11, 2 и 5) и, как следствие, попаданием меньшего количества копий плазмид в клетку.

Для того чтобы подавить рост наибольшего числа опухолевых клеток под действием HSV-tk и ганцикловира, необходимо получить максимально высокое количество данного белка после трансактивации промотора LTR ВИЧ-1, поэтому в дальнейших экспериментах было использовано сочетание плазмид ΔLTRep-tk к pSurv-tat, равное 1:1.

№ дорожки	1	2	3	4	5	6
ΔLTRep-tk	-	2мкг	2мкг	2мкг	5мкг	5мкг
pSurv-tat	-	-	2мкг	8мкг	-	5мкг
соотношение ΔLTRep-tk к pSurv-tat	-	-	1:1	1:4	-	1:1
				сочетание Б		сочетание А

Рис. 11. Вестерн-блот анализ белков HSV-tk и GAPDH в экстрактах клеток, трансфицированных указанными в таблице конструкциями (ΔLTRep-tk и pSurv-tat). При проведении трансфекции меняли концентрацию как ΔLTRep-tk (2-4 и 5-6), так и pSurv-tat (3 и 4).

Сравнительный анализ уровня экспрессии гена HSV-tk, направляемой различными промоторными системами

Чтобы продемонстрировать преимущество использования Tat-TAR-системы, в сочетании с опухолеспецифическим промотором, перед прямым использованием опухолеспецифических промоторов, необходимо сравнить уровень экспрессии гена HSV-tk, находящегося под регуляцией этих промоторных систем. Кроме того, интересно выяснить, насколько эффективность разработанной нами системы отличается от эффективности сильного неспецифического промотора, такого как pCMV/E.

В следующем эксперименте были исследованы активности двух опухолеспецифических промоторов: гена сурвивина человека (BIRC5) и гена обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT). Оба промотора имеют широкий диапазон опухолевой специфичности и низкую активность в нормальных клетках. Альтернативное использование одного из этих промоторов для терапии разных видов рака может расширить спектр опухолей, в которых Tat-TAR-система имеет высокую эффективность.

Для сравнения активностей указанных выше промоторов, кроме полученных ранее векторов ΔLTRep-tk и pSurv-tat, дополнительно было создано четыре конструкции, указанные на рис. 12. Первые две (А и Б) содержат ген tat под контролем промотора гена сурвивина человека (pSurv) или гибридного промотора phTERT-СMV, состоящего из минимальных промоторных элементов гена hTERT и ранних генов CMV. Показано, что промотор phTERT-CMV обладает более высокой активностью по сравнению с немодифицированным промотором гена hTERT, сохраняя при этом опухолевую специфичность. Конструкции pSurv-tat и phTERT-CMV-tat были использованы в качестве усилителей экспрессии гена HSV-tk, который находился под контролем ΔLTRep (рис. 12В, рис. 3). Таким образом, были исследованы две бимодальные системы: А+В, Б+В (рис. 12). Для сравнения и оценки усиливающей эффективности опухолеспецифических промоторов были получены три конструкции, в которых ген HSV-tk находится под управлением либо промотора pSurv, либо phTERT-CMV (рис. 12Г и Д, соответственно), либо сильного неспецифического промотора pCMV/E (рис. 12Е). Во всех конструкциях за геном HSV-tk и геном tat помещен сигнал полиаденилирования вируса SV40 (рис. 12А–Е).

Рис. 12. Схема экспрессионных векторов pSurv-tat (А), phTERT-CMV-tat (Б), ΔLTRep-tk (В), pSurv-tk (Г), phTERT-CMV-tk (Д), pCMV/E-tk (Е). Представлены экспрессионные кассеты, каждая из которых включает в себя промоторный элемент (pSurv, phTERT-CMV, ΔLTRep, pCMV/E), трансген (ген tat или HSV-tk) и сигнал полиаденилирования (поли-А сигнал). Внутри фрагмента LTR ВИЧ-1 выделен TAR-элемент.
Как известно, функция белка p53, продукта гена-супрессора опухоли, нарушается при формировании многих онкологических заболеваний. Мы проверили эффективность Tat-TAR-системы в p53(+) и p53(-) клеточных линиях с тем, чтобы определить, насколько разработанная система зависит от p53-статуса клетки и является ли она универсальной. Уровень экспрессии гена HSV-tk анализировали в клетках линий Calu-1 и HT1080, первые из которых содержат делецию в гене p53, а вторые несут дикий тип этого гена. Клетки транзиентно трансфицировали либо вариантами бинарных систем В, А+В, Б+В (рис. 12), либо по отдельности конструкциями pSurv-tk (рис. 12Г), phTERT-CMV-tk (рис. 12Д), pCMV/E-tk (рис. 12Е). В качестве контроля использовали экстракты нетрансфицированных клеток, а также экстракты клеток, трансфицированных контрольной плазмидой pEGFP-N1.

Рис. 13. Вестерн-блот анализ белков HSV-tk и GAPDH в экстрактах клеток Calu-1 и HT1080. 1 – нетрансфицированные клетки; 2 – клетки, трансфицированные контрольной плазмидой pEGFP-N1; 3, 4, 5, 6 – клетки, трансфицированные pCMV/E-tk, pSurv-tk, phTERT-CMV-tk, ΔLTRep-tk, соответственно; 7 – клетки, трансфицированные pSurv-tat и ΔLTRep-tk; 8 – phTERT-CMV-tat и ΔLTRep-tk.

Было показано, что в отличие от высокого уровня экспрессии гена HSV-tk под контролем pCMV/E (рис. 13, 3), его экспрессия под контролем pSurv и phTERT-CMV в обеих клеточных линиях была очень низкой (рис. 13, 4 и 5). Однако при котрансфекции клеток бимодальными системами происходило усиление экспрессии HSV-tk с промотора LTR ВИЧ-1, что приводило к значительному повышению уровня экспрессии данного гена (рис. 13, 7 и 8).

Интересно, что в клетках Calu-1 белок tat, синтез которого направлялся либо промотором гена сурвивина, либо промотором ранних генов цитомегаловируса, трансактивировал промотор LTR ВИЧ-1 примерно с одинаковой эффективностью (рис. 13, 7 и 3). В клетках HT1080 трансактивация промотора LTR ВИЧ-1 при котрансфекции с кассетой pSurv-tat была несколько ниже, чем в Calu-1; а количество белка HSV-tk в клеточных экстрактах составляло примерно пятую часть от его количества в экстрактах соответствующих клеток, трансфицированных pCMV/E-tk (рис. 13, 7 и 3).

В случае, когда ген tat находился под контролем промотора phTERT-CMV, также происходила эффективная трансактивация промотора LTR ВИЧ-1. В обеих клеточных линиях уровень экспрессии гена HSV-tk в бинарной системе с промотором phTERT-CMV был сопоставим с уровнем экспрессии этого гена в конструкции pCMV/E-tk (рис. 13, 8 и 3), при этом как в клетках Calu-1, так и в HT1080 эффективность трансактивации промотора LTR ВИЧ-1 под действием экспрессионной кассеты phTERT-CMV-tat либо превышала, либо совпадала с эффективностью трансактивации кассеты Surv-tat (рис. 13, 8 и 7).

Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования бимодальных систем для получения уровня экспрессии подконтрольного гена, который сравним с уровнем одной из самых сильных среди известных на сегодняшний день промоторных систем pCMV/E.

Для эффективной работы Tat-TAR-системы необходимо присутствие белка tat. Эффект этого белка, по-видимому, проявляется при низких концентрациях, на пределе чувствительности используемых нами антител, в результате чего наши попытки детектировать белок tat в экстрактах, несущих конструкты pSurv-tat и phTERT-CMV-tat, оказались безуспешными, а в экстрактах, несущих конструкцию pCMV/E-tat, белок детектировался крайне слабо (данные не представлены). По-видимому, наличие белка tat даже в очень небольших количествах позволяет системе эффективно работать как в р53(+), так и в р53(–) клетках. В противном случае можно было ожидать существенного подавления уровня экспрессии HSV-tk в р53(+) клетках, где белок р53 ингибирует работу обоих использованных опухолеспецифических промоторов.

Определение активности HSV-tk

Нами была проведена оценка активности HSV-tk в линиях клеток Calu-1 и HT1080, трансфицированных описанными ранее конструкциями (рис. 12А-Е) с помощью метода, который позволяет определить количество фосфорилированного ганцикловира, образующегося в результате ферментативной реакции под действием HSV-tk. Высокий уровень фосфорилирования достигался в экстрактах клеток, трансфицированных вектором pCMV/E-tk, а также конструкциями ΔLTRep-tk и pSurv-tat, ΔLTRep-tk и phTERT-CMV-tat (рис. 14, 3, 7 и 8). В экстрактах клеток, несущих pSurv-tk, phTERT-CMV-tk и ΔLTRep-tk количество фосфорилированного ганцикловира практически не отличалось от контрольного уровня (рис. 14, 4–6). Активность HSV-tk, синтезируемой в экстрактах Calu-1 под действием кассет pSurv-tat и phTERT-CMV-tat, отличалось незначительно (рис. 14, столбцы 7 и 8 черного цвета). В то же время в клетках HT1080 промотор phTERT-CMV оказался эффективнее промотора pSurv (рис. 14, столбцы 7 и 8 белого цвета), что полностью согласуются с результатами Вестерн-блот анализа белка HSV-tk в этих же экстрактах (рис. 13).

Интересно, что ферментативная активность HSV-tk отличается в клеточных линиях Calu-1 и HT1080. Так, фосфорилирование ганцикловира в клетках Calu-1 достигает высокого уровня в течение 1 ч, тогда как в клетках HT1080 за этот период продукт фосфорилирования зарегистрировать не удается. Поэтому ферментативную активность HSV-tk мы оценивали в клетках Сalu-1 через 1 ч, а в клетках HT1080 – через 1 сутки.

Различная активность HSV-tk в разных клеточных линиях согласуется с данными, свидетельствующими о различной чувствительности к ганцикловиру разных типов клеток, содержащих ген HSV-tk; причем разброс в чувствительности клеток к ганцикловиру не коррелирует с уровнем экспрессии в них гена HSV-tk. Причины такого различия в чувствительности не известны. Очевидно, что это не связано с различной проницаемостью мембран клеток к ганцикловиру, поскольку в нашем эксперименте ганцикловир добавляли к клеточным экстрактам, а не к цельным клеткам. По этой же причине исключено влияние «эффекта свидетеля», показанного для системы HSV-tk/GCV, суть которого заключается в проникновении ганцикловира, преобразованного под действием HSV-tk и клеточных киназ в токсичный метаболит в клетки, соседние с трансфицированными, в результате чего они гибнут. Одинаковое количество клеток в эксперименте отвергает влияние разной скорости роста клеток Calu-1 и HT1080. В основе разной чувствительности клеток к ганцикловиру могут лежать процессы, происходящие с HSV-tk внутри клетки, например, такие как компартментализация или экзоцитоз этого белка в клетках HT1080. Учитывать механизм различной чувствительности крайне важно при выборе стратегии генной терапии, поэтому необходимо проведение специальных исследований в этой области.

Рис. 14. Тест на способность HSV-tk фосфорилировать ганцикловир в клетках линий Calu-1 и HT1080. 1 – нетрансфицированные клетки; 2 – клетки, трансфицированные контрольной плазмидой pEGFP-N1; 3, 4, 5, 6 – клетки, транфицированные pCMV/E-tk, pSurv-tk, phTERT-CMV-tk, ΔLTRep-tk, соответственно; 7 – клетки, трансфицированные pSurv-tk и ΔLTRep-tk; 8 – phTERT-CMV-tk и ΔLTRep-tk. По оси ординат указаны единицы активности HSV-tk, выраженные в пкмоль фосфорилированного ганцикловира за 1 час реакции для Calu-1 и за 24 часа – для HT1080 в пересчете на 1 мг тотального белка.
Функциональный тест на способность HSV-tk подавлять рост опухолевых клеток

Клетки линий Calu-1 и HT1080, трансфицированные указанными выше конструкциями (рис. 12), были обработаны ганцикловиром (GCV) в трех различных концентрациях: 2 мкМ, 20 мкМ и 200 мкМ. На рис. 15 представлены микрофотографии трансфицированных клеток после инкубации в среде, содержащей ганцикловир, в течение трех суток. Наблюдалась массовая гибель клеток, несущих оба конструкта бинарной системы Tat-TAR, по величине сравнимая с гибелью клеток, трансфицированных конструкцией pCMV/E-tk (рис. 15), причем клетки HT1080 оказались менее чувствительными к ганцикловиру, чем Calu-1, что согласуется с данными по активности HSV-tk (рис. 14). Таким образом, эффективность Tat-TAR-системы близка к эффективности промотора ранних генов цитомегаловируса.

Рис. 15. Микрофотографии клеток Calu-1 и HT1080, трансфицированных следующими конструкциями: 1 - pEGFP-N1, 2 - pCMV/E-tk, 3 - ΔLTRep-tk, 4 - ΔLTRep-tk и pSurv-tat, 5 - LTRep-tk и phTERT-CMV-tat, спустя трое суток инкубации на среде, содержащей ганцикловир (GCV).

Способы снижения базального уровня экспрессии гена HSV-tk в Tat-TAR-системе

Функциональный тест на активность HSV-tk показал, что, несмотря на низкий, фоновый уровень синтеза и активности HSV-tk (рис. 13 и 14), количества данного белка, синтезируемого с промотора LTR ВИЧ-1 в отсутствии белка tat, достаточно для подавления роста заметного числа клеток (рис. 15, 3). Для снижения базального уровня экспрессии HSV-tk были выбраны две стратегии, первая из которых предполагает использование «укороченного» фрагмента LTR ВИЧ-1, а вторая сводится к изменению соотношений плазмид в котрансфекции с 1:1 на 1:4.

Рис. 16. Схема ΔLTRep и ΔLTRp ВИЧ-1. Прямоугольниками обозначены районы 5'LTR ВИЧ-1: U3, R, U5; Enh - энхансерный, Pr - промоторный участки, TAR-элемент; стрелками в нижней части рисунка обозначены участки ΔLTRep и ΔLTRp, используемые в экспрессионных конструкциях. Цифрами указано положение нуклеотидных остатков на кДНК ВИЧ-1.

Известно, что фрагмент LTR ВИЧ, отличающийся от полноразмерного LTR отсутствием модуляторного и энхансерного районов, обладает высокой способностью к трансактивации и сниженным примерно в 10 раз фоновым уровнем экспрессии подконтрольного гена. Для получения конструкции, несущей ген HSV-tk под контролем такого фрагмента LTR, названного нами ΔLTRp (рис. 16), из конструкции ΔLTRep-tk был удален энхансерный участок LTR ВИЧ-1.

Далее было проведено сравнение трех бимодальных систем, представленных в табл. 1. Системы 1 и 2 отличаются вариантом LTR ВИЧ-1, системы 2 и 3 – соотношением плазмид в трансфекции.

Таблица 1. Варианты бимодальных систем, использованных в трансфекции клеток с целью определения наиболее эффективной системы, имеющей сниженный фоновый уровень экспрессии и высокий уровень трансактивации.

№ бимодальной системы	экспрессионная конструкция	экспрессионная конструкция	соотн-е плазмид в трансф-и	количественное соотношение плазмид при трансфекции 25 см2-флакона
1	ΔLTRp-tk	pSurv-tat или phTERT-CMV-tat	1:1	5 мкг:5 мкг
2	ΔLTRep-tk	pSurv-tat или phTERT-CMV-tat	1:1	5 мкг:5 мкг
3	ΔLTRep-tk	pSurv-tat или phTERT-CMV-tat	1:4	2 мкг:8 мкг

Клетки Calu-1 и HT1080 были трансфицированы конструкциями бинарных систем

(табл. 1). Для определения фонового уровня транскрипции гена HSV-tk в системе №1 клетки трансфицировали отдельно конструкцией ΔLTRp-tk, в системе №2 - ΔLTRep-tk в количестве 5 мкг, а в системе №3 - ΔLTRep-tk в количестве 2 мкг. Оказалось, что количество синтезируемой HSV-tk в бинарной системе под регуляцией разных вариантов LTR различается незначительно (рис. 17, 4, 5, 7, 8, 10 и 11), фоновый уровень экспрессии HSV-tk детектируется очень слабо и только в экстрактах, трансфицированных Δ LTRep-tk в количестве 5 мкг (рис. 17, 6).

Трансфицированные клетки культивировали в среде, содержащей ганцикловир в концентрации 2 мкМ, 20 мкМ или 200 мкМ, в течение шести суток, после чего проводили МТТ-тест и определяли IC50 (концентрацию, при которой достигается 50% от максимального ингибиторного ответа) (рис. 18). Оказалось, что в клетках Calu-1 оба опухолеспецифических промотора одинаково эффективно усиливают экспрессию гена HSV-tk, направляемую как вариантом ΔLTRеp, так и ΔLTRp; значение IC50 в этих клетках практически совпадало. Бинарная система № 3 в клетках Calu-1 работала менее универсально: под действием конструкции phTERT-CMV-tat синтезировалось меньшее количество активной HSV-tk, чем вследствие попадания в клетку конструкции pSurv-tat. При фоновом уровне экспрессии HSV-tk токсический эффект взаимодействия HSV-tk с GCV в системе № 3 был в несколько раз ниже, чем эффект, оказываемый системой № 2. Система № 1 также показала хорошие характеристики в отсутствии потенциаторных кассет: ее токсический эффект был снижен более чем в 6 раз относительно эффекта системы № 2. Таким образом, для клеток Calu-1 наиболее удачным вариантом оказалась система с «укороченным» вариантом LTR (система № 1), которая также эффективна после трансактивации, как и система № 2, и имеет более низкий фоновый уровень экспрессии относительно системы № 2 (рис. 18).

Рис. 17. Вестерн-блот анализ клеточных экстрактов Calu-1 и HT1080, трансфицированных следующими конструкциями: 1 – нетрансфицированные клетки; 2 – клетки, трансфицированные pEGFP-N1; 3, 6, 9 – клетки, трансфицированные ΔLTRp-tk, ΔLTRep-tk (в количестве 5 мкг) и ΔLTRep-tk (в количестве 2 мкг), соответственно; 4, 7, 10 – клетки, трансфицированные бинарными конструкциями № 1, 2 и 3, соответственно, в качестве плазмиды-потенциатора была использована pSurv-tat; 5, 8, 11 - клетки, трансфицированные бинарными конструкциями № 1, 2 и 3, соответственно, в качестве плазмиды-потенциатора была использована phTERT-CMV-tat.

В клетках линии HT1080 значения IC50 для бинарных систем после трансактивации, как и ожидалось, были несколько выше, чем в клетках Calu-1. Во всех трех вариантах бинарных систем конструкция phTERT-CMV-tat усиливала синтез HSV-tk с большей эффективностью, чем конструкция pSurv-tat. В присутствии ганцикловира токсичность систем № 1 и № 3 была немного ниже токсичности системы № 2, однако фоновый уровень экспрессии HSV-tk в этих системах был заметно снижен: для системы № 1 – в 2,5 раза, для системы № 3 – в 3,5 раза (рис. 18). Более универсальной системой в клетках HT1080, также как и в Calu-1, оказалась бинарная система № 1.

А

Б

линия клеток	№ бинарной системы	IC50, мкМ
		до трансактивации	после трансактивации
			потенциатор – pSurv-tat	потенциатор – phTERT-CMV-tat
Calu-1	1	53	4	4
	2	8	5	5
	3	118	3	25
HT1080	1	102	36	30
	2	38	23	16
	3	137	46	25

Рис. 18. Результаты подсчета IC50 для клеток, трансфицированных конструкциями pEGFP-N1, ΔLTRep-tk, ΔLTRp-tk, pSurv-tat, phTERT-CMV-tat. Представлены графики, демонстрирующие различие в IC50 для разных бинарных систем (А), и сами значения IC50 (Б). Обозначения бинарных систем указаны в табл. 1.

Таким образом, нами было показано, что среди исследованных вариантов фрагмент LTR ВИЧ-1, соответствующий ΔLTRp, обладает наилучшими характеристиками: эффективно трансактивируется под действием конструкций pSurv-tat и phTERT-CMV-tat и имеет сниженный фоновый уровень экспрессии трансгена. Наши результаты показывают, что бинарные системы могут модифицироваться дальше. Для дальнейшего снижения фонового уровня экспрессии можно удалять из состава LTR дополнительные регуляторные элементы, либо использовать гибридный вариант LTR с элементами, блокирующими синтез трансгена в отсутствии белка tat.

Исследование возможности применения гена протеиназы ВИЧ-1 в генной терапии раковых заболеваний

Ранее было показано, что протеиназа ВИЧ-1 ингибирует рост клеток. Мы использовали это свойство для подавления роста опухолевых клеток. Ген протеиназы ВИЧ-1 PR_HIV был амплифицирован и клонирован в экспрессионный вектор pEGFP-N1 под контроль усиленного энхансером промотора ранних генов цитомегаловируса, либо промотора гена сурвивина человека таким образом, чтобы в результате экспрессии формировался слитный белок, содержащий EGFP с протеиназой ВИЧ-1 на N-конце. Таким образом, были получены конструкции pCMV-PR_HIV-EGFP и pSurv-PR_HIV-pEGFP (рис. 19). Наличие свечения в ультрафиолетовом свете после трансфекции клеток данной конструкцией позволяет говорить об экспрессии гена PR_HIV. «Киллерные» свойства PR_HIV можно оценить при введении в клетку ингибитора ее активности, например, саквинавира (Saq). При сравнении микрофотографий клеток в присутствии и в отсутствии саквинавира была определена эффективность подавления роста клеток, трансфицированных конструктом с геном протеиназы ВИЧ-1.

Рис. 19. Схема конструкций pCMV-PR_HIV-EGFP и pSurv-PR_HIV-EGFP. Обозначены усиленный энхансером промотор ранних генов цитомегаловируса (pCMV) и промотор гена сурвивина человека (pSurv), гибридный ген PR_HIV и EGFP.

Полученные конструкции были использованы для трансфекции клеток линий HeLa, HEK293, A549 и Calu-1. Трансфицированные клетки культивировали в среде без саквинавира, а также в среде, содержащей 2 мкМ саквинавира, в течение 48 часов, после чего клетки фотографировали. В качестве контроля были использованы клетки, трансфицированные плазмидой pEGFP-N1. В клетках, трансфицированных контрольной плазмидой, мы наблюдали сильное свечение, демонстрирующее высокую эффективность трансфекции (рис. 20, 1). В присутствии ингибитора активности протеиназы количество клеток, имеющих свечение, было меньше (рис. 20, 3). Такой эффект не был связан с токсичностью самого саквинавира (данные не представлены) и, по-видимому, обусловлен свойствами самого гибридного белка PR_HIV-EGFP. Практически полное отсутствие свечения мы наблюдали в клетках, трансфицированных pCMV-PR_HIV-EGFP, что говорит о высокой эффективности PR_HIV как гена-«убийцы» (рис. 20, 2).

Рис. 20. Микрофотографии клеток HEK293 и HeLa, трансфицированных pEGFP-N1 (1), pCMV-PR_HIV-EGFP (2, 3). 3 - клетки культивировали в среде, содержащей специфический ингибитор протеазы саквинавир (2 мкМ). Представлены фотографии клеток в фазовом контрасте и в ультрафиолетовом свете.

Использование конструкции pSurv-PR_HIV-pEGFP в трансфекции клеток линий HeLa, HEK293, A549 и Calu-1 показало практически полное отсутствие свечения клеток как в среде с саквинавиром, так и без него. Это свидетельствует о низком уровне экспрессии гена протеиназы ВИЧ в данном векторе, и не позволяет определить эффективность протеиназы ВИЧ-1 в подавлении роста опухолевых клеток.

Использование сильных индуцибельных систем дает возможность контролировать экспрессию трансгена и «включать» ее только при определенных условиях. Нами были выбраны и проверены две индуцибельные системы для контроля экспрессии гена протеиназы ВИЧ-1: Tet-off-система и Tat-TAR-система ВИЧ-1.

Для определения эффективности работы PR_HIV в Tet-off-системе была получена конструкция PR_HIV-pBI-EGFP (рис. 21А). Индукция экспрессии генов PR_HIV и EGFP происходила после удаления из среды доксициклина.

A

Б


Рис. 21. Схемы индуцибельных систем экспрессии протеиназы ВИЧ-1. А – схема экспрессионной кассеты конструкции PR_HIV-pBI-EGFP. Обозначены два разнонаправленных минимальных промотора ранних генов цитомегаловируса (pCMV min) и гены EGFP и PR_HIV. Б - схемы векторов, используемых для индукции синтеза протеиназы ВИЧ-1 с помощью Tat-TAR-системы ВИЧ-1. Указаны две усиливающие кассеты (pCMV/E-tat и pSurv-tat), которые действуют на промотор LTR ВИЧ-1 и активируют экспрессию гибридного гена PR_HIV-EGFP. Внутри фрагмента LTR ВИЧ-1 обозначен TAR-элемент.
Конструкция PR_HIV-pBI-EGFP и контрольная плазмида pBI-EGFP были использованы для трансфекции клеток HEK293 Tet-Off G7, стабильно экспрессирующих трансактиваторный белок tTA, полученных в лаборатории Кострова С.В. в Институте молекулярной генетики РАН. В клетках, трансфицированных конструкцией, несущей ген протеиназы ВИЧ-1, мы наблюдали индукцию синтеза данного белка после удаления доксициклина, однако PR_HIV не вызывала подавления роста клеток, количество светящихся клеток в присутствии и отсутствии саквинавира было практически одинаковым. Таким образом, несмотря на очевидно высокое количество синтезированной PR_HIV, нам не удалось получить активную протеиназу ВИЧ-1 при использовании Tet-off-системы.

Для работы с Tat-TAR системой ВИЧ-1 была получена экспрессионная конструкция ΔLTRep-PR_HIV-EGFP, в которой ген слитного белка PR_HIV-EGFP находился под управлением фрагмента LTR ВИЧ-1 (ΔLTRep). Кроме того, в данном эксперименте использовались конструкции pCMV/E-tat и pSurv-tat (рис. 21Б). Полученные конструкции доставляли в клетки линий Calu-1, HEK293, HeLa и A549. Фоновой экспрессии гена PR_HIV- EGFP мы практически не наблюдали, что, по-видимому, говорит о низком уровне экспрессии PR_HIV- EGFP до трансактивации. При наличии в клетке векторов ΔLTRep-PR_HIV-EGFP и pCMV/E-tat происходила индукция синтеза протеиназы. Однако разница в свечении трансфицированных клеток, культивируемых на среде без саквинавира и в его присутствии, была слабой. Это свидетельствует о том, что протеиназа ВИЧ-1 в Tat-TAR-системе вызывает гибель клеток, однако ее «киллерный» эффект выражен гораздо слабее, чем в векторе pCMV-PR_HIV-EGFP. В случае, когда в клетке находились вектора pSurv-tat и ΔLTRep-PR_HIV-EGFP, различие в свечении в присутствии и отсутствии ингибитора активности протеиназы практически не детектировалось, а значит, не представляется возможным определить, активна ли в них протеиназа ВИЧ-1.

Таким образом, несмотря на то, что протеиназа ВИЧ-1 обладает активностью, способной подавить рост большинства трансфицированных клеток, если ее ген находится под контролем сильного вирусного промотора, пока не удается специфически активировать ее в клетках опухолей. Причины такого поведения данного фермента неясны.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе Tat-TAR-взаимодействия, используемого ВИЧ для усиления транскрипции собственных генов, нами разработана бимодальная система, позволяющая получить высокий уровень экспрессии трансгена. Показано, что два исследованных опухолеспецифических промотора, обеспечивающие только слабую экспрессию гена tat, позволяют на два порядка увеличить экспрессию гена HSV-tk под контролем фрагмента LTR ВИЧ-1, содержащего TAR-элемент. Эффективность разработанной системы близка к эффективности сильного неспецифического промотора ранних генов цитомегаловируса, усиленного энхансером.

Подтверждена высокая активность белка HSV-tk, синтезируемого в бинарной системе Tat-TAR. Существенно, что эффект усиления экспрессии HSV-tk мало зависит от р53-статуса трансфицируемых клеток, будучи практически одинаковым как в р53(+), так и в p53(–) клетках. Это позволяет рассчитывать на то, что разработанная система может быть востребована при терапии различных раковых опухолей, многие из которых дефектны по белку р53, тогда как другие, будучи р53-позитивными, ингибируют действие опухолеспецифических промоторов.

Показано, что фоновая активность промотора LTR ВИЧ-1 может быть снижена при удалении энхансерных регуляторных элементов из состава LTR. Стоит отметить, что уровень базальной экспрессии трансгена в случае возникновения необходимости можно дополнительно снижать, удаляя из состава LTR дополнительные регуляторные элементы.

ВЫВОДЫ

1. Разработана и получена бинарная система, позволяющая оценить способность Tat-TAR-системы ВИЧ-1 усиливать экспрессию генов в клетках человека. Показана эффективность и индуцибельное действие полученной системы.

2. Показано, что под действием опухолеспецифического промотора, регулирующего активность гена tat, происходит эффективная трансактивация промотора LTR ВИЧ-1 и усиление экспрессии подконтрольного гена.

3. Продемонстрирована способность разработанной бинарной системы усиливать активность опухолеспецифических промоторов более чем на два порядка. Показано, что эффективность системы близка к эффективности сильного, но неспецифического промотора ранних генов цитомегаловируса, усиленного энхансером.

4. Полученная система эффективно работает как в p53(+), так и p53(-) клетках при использовании промоторов широкого профиля опухолевой специфичности (промотора гена сурвивина человека или промотора гена обратной транскриптазы теломеразы человека).

5. На примере тимидинкиназы вируса простого герпеса показано, что Tat-TAR-система в сочетании с опухолеспецифическим промотором может эффективно использоваться для специфического подавления роста опухолевых клеток.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

Статьи:

1. Р. Н. Мингалеева, И. П. Чернов, Е. П. Копанцев, Е. А. Стукачева, Н. В. Скапцова, Е. Д. Свердлов. Исследование эффекта трансактивации транскрипции с помощью Tat-TAR-системы вируса иммунодефицита человека HIV-1 в нелимфоидных клетках HEK293 и Calu-1. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2009, №2, с. 11-15.

2. Р. Н. Мингалеева, И. П. Чернов, Е. П. Копанцев, Л. Л. Завалова, А. В. Сасс, Е. Д. Свердлов. Сравнительный анализ потенциации экспрессии гена тимидинкиназы вируса простого герпеса при использовании Tat-TAR-системы вируса иммунодефицита человека HIV-1 и опухоль-специфических промоторов в p53(+) и p53(-) клетках. Молекулярная биология, 2010, №3, с. 507-514
Тезисы конференций:

1. Р. Н. Мингалеева, И.П. Чернов, Е. П. Копанцев, Е. А. Стукачева, Е. Д. Свердлов. Создание Tat-TAR системы HIV-1 для индуцированной экспрессии гена tk-HSV в клетках HEK293 и Calu-1. II международная научно-практическая конференция «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», Казань, 15-16 сентября 2008 г., сборник трудов молодых ученых, стр. 79-80.

2. Р. Н. Мингалеева, И. П. Чернов, Е. П. Копанцев, Е. А. Стукачева, Е. Д. Свердлов. Исследование эффекта трансактивации транскрипции с помощью TAT-TAR-системы вируса иммунодефицита человека HIV-1 в нелимфоидных клетках HEK293 и CALU-1. XXI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 9-11 февраля 2009 г., сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр. 19.

3. Р. Н. Мингалеева. Разработка системы усиления активности раково-специфичных промоторов на основе Tat-TAR-системы HIV-1. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Москва, 28 сентября – 1 октября 2009 г., сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр. 141-144.