Молекулярно-генетическая природа наследственной метгемоглобинемии 03. 02. 07 Генетика

На правах рукописи

ГАЛЕЕВА НАИЛЯ МАНСУРОВНА
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРИРОДА НАСЛЕДСТВЕННОЙ МЕТГЕМОГЛОБИНЕМИИ
03.02.07 - Генетика
Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Медико-генетический научный центр” Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович

Официальные оппоненты:
Дадали Елена Леонидовна, доктор медицинских наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, ведущий научный сотрудник научно-поликлинического отдела

Назаренко Мария Сергеевна, кандидат медицинских наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, научный сотрудник лаборатории популяционной генетики

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится «___» _______ 2012 г. в ___ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «_____»___________________ 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских

и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия (НЭМ) – редкое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное дефицитом системы восстановления метгемоглобина. Наиболее частой причиной НЭМ является нарушение работы фермента NADH-цитохром b₅ редуктазы (метгемоглобинредуктазы). Выделяют первый тип заболевания, обусловленный нарушением работы растворимой формы фермента, и второй тип, обусловленный нарушением работы как растворимой, так и мембраносвязанной форм фермента. Наследственная метгемоглобинемия I типа имеет мягкое клиническое течение. Наследственная метгемоглобинемия II типа имеет более тяжелую клиническую картину и помимо цианоза, характеризуется микроцефалией, нарушением развития когнитивных и двигательных функций.

Клинически метгемоглобинемия I типа проявляется периодическими головными болями, головокружением, одышкой, тахикардией, быстрой утомляемостью, сонливостью, возможно, отставание в физическом и психическом развитии в результате постоянной гипоксии мозга. Повышение метгемоглобина (MetHb) до 10% чаще всего не дает клинически выраженных проявлений. При повышении MetHb в пределах 10–20% появляется цианоз слизистых и кожных покровов, возникают общая слабость, недомогание, ослабление памяти, раздражительность, головные боли. Лечение НЭМ I типа заключается в приеме аскорбиновой кислоты, при этом происходит снижение концентрации метгемоглобина, цианоз почти исчезает, улучшается самочувствие больных. Раннее начало лечения позволяет удержать уровень метгемоглобина сравнительно низким и, по возможности, избежать гипоксии мозга при его развитии. Лечение НЭМ II типа на сегодняшний день направлено только на поддержание нормального уровня метгемоглобина и купирование цианоза (Банщикова Е.С., 2002, Казанец Е.Г., 2009). У гетерозиготных носителей признаки заболевания отсутствуют, однако после приема метгемоглобинобразующих лекарственных препаратов (анальгетики, нитроглицерин, нитрофурагин, анестетики и т.д.) и при соприкосновении с некоторыми химическими веществами повышен риск развития токсической метгемоглобинемии экзогенного и эндогенного характера (Казанец Е.Г., 2009).

На сегодняшний день постановка диагноза НЭМ в РФ чаще всего проводится на основании данных анамнеза, осмотра, повышенного уровня метгемоглобина в крови, а также на основании биохимического анализа определения активности NADH-цитохром-b5-редуктазы в эритроцитах. Определение уровня активности метгемоглобинредуктазы в клинических лабораториях, являющееся важным биохимическим показателем в дифференциальной диагностике наследственной энзимопенической метгемоглобинемии, в настоящий момент затруднено в связи с отсутствием готовых наборов для данного исследования. Кроме того существование у биохимического метода “слепой зоны”, часто не позволяет отличать здоровых людей от гетерозиготных носителей заболевания (Банщикова Е.С., 2002).

Ранее наследственная метгемоглобинемия с заметным с раннего возраста цианозом очень часто давала повод к ошибочной диагностике у больных врожденного “синего” порока сердца (Дервиз Г.В., 1977). Сегодня, в связи с наличием современного оборудования, нарушения со стороны сердечнососудистой системы исключаются достаточно успешно, однако подтверждение диагноза “наследственная метгемоглобинемия” у таких больных затруднено. Наиболее актуальной на сегодняшний день проблемой является гипердиагностика НЭМ у новорожденных детей. Это связано с тем, что становление активности фермента метгемоглобинредуктазы завершается только к первому году жизни ребенка. Таким образом, до года по результатам биохимических исследований невозможно поставить точный диагноз у таких больных (Казанец Е.Г., 2009).

В России высокое распространение метгемоглобинемии I типа зарегистрировано у коренных жителей Республики Саха (Якутия) (Захарова Ф.А.,1982, Токарев Ю.Н., 1983, Банщикова Е.С., 2002). Оценена распространенность НЭМ I типа среди якутов, которая составила 1: 5677 человек (Тарская Л.А., 2004). Учитывая наличие накопления многих наследственных заболеваний у якутов, а также историческую информацию об их миграции и расселении, вероятной причиной распространения НЭМ I типа в Якутии является действие в данной популяции эффекта основателя (Серошевский В.Л., 1993, Банщикова Е.С., 2002). Наибольшее количество обследованных больных наследственной метгемоглобинемией проживает в центральной части Якутии, преимущественно в сельской местности, при этом самая высокая частота зарегистрирована в Вилюйской группе районов. В условиях Якутии гипоксия усугубляется дефицитом поступления витамина С с пищей (Банщикова Е.С., 2002).

В Якутии диагностика НЭМ I типа осуществляется при помощи биохимического исследования. Однако, учитывая наличие у данного метода недостатков часто не позволяющих установить точный диагноз, необходима разработка дешевого и быстрого молекулярно-генетического метода выявления мутации в том числе, в гетерозиготном состоянии, приводящей к НЭМ I типа в республике. ДНК-диагностика будет быстро и точно выявлять больных и гетерозиготных носителей заболевания, что позволит, в связи с наличием дешевого и доступного лечения, избегать нежелательных осложнений.
Цель исследования

Установить молекулярно-генетическую природу наследственной метгемоглобинемии у больных, проживающих в различных регионах Российской Федерации.

Задачи исследования:

В выборке якутских больных провести анализ неравновесия по сцеплению НЭМ I типа с локусом гена CYB5R3.
Установить молекулярно-генетическую причину наследственной метгемоглобинемии I типа в Республике Саха (Якутия) и разработать простые и доступные методы прямой ДНК-диагностики НЭМ I типа, пригодные для проведения популяционных исследований и ДНК-диагностики среди коренного населения республики Саха (Якутия).
Определить частоту гетерозиготного носительства и расчетную частоту НЭМ I типа среди якутов.
Подтвердить наличие эффекта основателя для НЭМ I типа среди якутов и выявить предковый гаплотип хромосом, несущих мутацию. Оценить «возраст» распространения мутации в якутской популяции.
Установить молекулярно-генетическую причину наследственной метгемоглобинемии I и II типов у больных, проживающих в других регионах РФ.

Научная новизна

Впервые в России проведена полномасштабная работа, целью которой явилось выяснение молекулярно-генетических причин возникновения наследственной метгемоглобинемии у больных, проживающих в различных регионах РФ. Выявлены три новые мутации в гене CYB5R3, одной из которых оказалась крупная делеция - первая и единственная на сегодняшний день, обнаруженная в гене CYB5R3.

У народа саха впервые установлена молекулярно-генетическая причина НЭМ I типа. На основе разработанной системы, выявляющей обнаруженную мутацию, определена частота гетерозиготного носительства этой мутации (55:1000 или 1:18 человек) и расчетная частота заболевания (1:1250) в республике. Впервые на основании анализа гаплотипов подтверждено давнее предположение о существовании эффекта основателя для НЭМ I типа в Якутии и проведена оценка возраста распространения обнаруженной мутации (285 135 лет). Полученный возраст не противоречит историческим данным и хорошо соотносится с результатами других работ, посвященных оценке возраста распространения других мутаций среди якутов.

Предложена и успешно применена на примере гена CYB5R3 стратегия поиска границ крупных делеций. Оценена доля крупных делеций в гене CYB5R3.

Практическая значимость

Определение молекулярно-генетической причины НЭМ I типа и последующая разработка методов ранней диагностики, позволяющей выявлять носителей заболевания, даст возможность, при правильном лечении, контроле приема препаратов и соблюдении диеты, избежать нежелательных осложнений. Учитывая очень высокую частоту носительства заболевания у народа саха, данная методика будет служить быстрым и удобным методом диагностики наследственной метгемоглобинемии I типа в Якутии.

Оценка «возраста» мутации, обнаруженной у якутов, внесет дополнительную ясность в понимание процесса этногенеза народа саха.
Основные положения, выносимые на защиту:

Причиной наследственной метгемоглобинемии I типа в Якутии является единственная мутация с.806С>Т в гене CYB5R3.
Популяционная частота мутации с.806С>Т в гене CYB5R3 среди якутов составляет - 55:1000, а расчетная частота заболевания 1:1250.
Распространение мутации среди якутов связано с дрейфом генов, возраст мутации для данной популяции составляет 285 135 лет.
У трех больных НЭМ обнаружены две новые мутации c.22-?_633+?del (делеция экзонов 2-7) и с.339dupC (p.Phe114LeufsX28) и одна ранее описанная мутация c.757 G>A (p.Val253Met).
Предложен универсальный подход для поиска границ делеции, с помощью которого определены границы делеции с.22-1320_633+1224del в гене CYB5R3.
Доля крупных делеций в гене CYB5R3 при НЭМ не превышает 20%.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на I Международной Пироговской конференции в 2006 году (г. Москва), на конференции European Human Genetics Conference 2006 (г. Амстердам, Голландия), на конференции "Генетика человека и патология" в 2007 году (г. Томск), на конференции European Human Genetics Conference 2008 (г. Барселона, Испания), на конференции European Human Genetics Conference 2009 (г. Вена, Австрия), на конференции European Human Genetics Conference 2012 (г. Нюрнберг, Германия).

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором проанализированы данные отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации. Автор принимал участие в планировании и осуществил экспериментальную часть работы. Все этапы молекулярно-генетического исследования (выделение ДНК, генотипирование по полиморфным маркерам, поиск мутаций и создание систем их регистрации, анализ популяционных выборок) автором выполнены лично. Автором проведен анализ полученных результатов: статистическая обработка данных, вычисление возраста мутации, определение частоты гетерозиготного носительства и расчетной частоты заболевания, сформулированы выводы.

Публикации

По материалам исследования опубликованы 9 научных работ, среди них 3 статьи опубликованы в журналах, удовлетворяющих требованиям ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 106 страницах машинописного текста; включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключение, выводы, список использованной литературы. Библиографический указатель включает 92 наименования, из них 27 отечественных и 65 иностранных источника. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 21 рисунком.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования

Для исследования использовали образцы геномной ДНК 16 больных и 8 здоровых родственников из 16 якутских семей с НЭМ I типа. Диагноз верифицировался в ФГБУ «НИИ медицинской генетики» СО РАМН города Томска. Также в работе использованы образцы крови 9 пациентов из 8 семей, страдающих метгемоглобинемией, поступившие в лабораторию ДНК-диагностики ФГБУ МГНЦ РАМН в период с 2006 по 2012 год. Диагноз верифицировался в Медико-генетической консультации самарской областной клинической больницы им. М.И. Калинина г. Самары, Перинатальном кардиологическом центре Городской Клинической Больницы №67 г. Москвы, Воронежской областной детской клинической больнице №1 г. Воронежа.

Популяционную выборку составили образцы ДНК 433 якутов, 32 коряков, 39 канадских эскимосов и 49 чукчей. Все индивидуумы считают себя коренными представителями соответствующих этнографических групп. Также для популяционного исследования использовали ДНК 12 человек из 4 ядерных неродственных семей больных ФКУ.

Образцы крови и ДНК использованы в работе с информированного согласия исследуемых лиц.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью готового набора реактивов фирмы DIAtomтм DNA Prep100 (Isogene Lab.ltd., Россия) по протоколу производителя.

Для исследований использовали 13 полиморфных маркеров, фланкировавших ген CYB5R3 в области размером 11,19 сМ по карте Marshfield (https://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Амплификацию необходимых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров. Дизайн праймеров выполнен в лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ МНГЦ РАМН, фирма производитель – ООО “Синтол”, Москва, ЗАО“Евроген”, Москва.

Для ПДАФ- и ПДРФ- анализа использовали 7 и 8 % гель с соотношением акриламид: бисакриламид –29 : 1 и 29 : 1,3 с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD в УФ-излучении. В работе использовали эндонуклеазу AluI фирмы “Fermentas”, Литва.

Выявление изменений нуклеотидной последовательности гена CYB5R3 проводили путем автоматического секвенирования, которое проводилось согласно протоколу фирмы-производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystem, США).

Прямую идентификацию мутации с.806С>T в гене CYB5R3 осуществляли с помощью разработанных тест-систем: методом ПДРФ-анализа и методом MLPA-анализа. Для лигирования необходимых фрагментов ДНК использовали 3 MLPA-пробы. Дизайн проб выполнен в лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ МНГЦ РАМН, фирма производитель – ООО “Синтол”, Москва. При регистрации продуктов MLPA с помощью ПДАФ-анализа лигирование и последующую амплификацию проводили на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия). При регистрации продуктов MLPA с помощью анализа кривой плавления лигирование и последующую амплификацию проводили на термоциклере с Real-Time PCR детектирующей системой iCycler^ ThermalCycler фирмы BIO-RAD. Результаты оценивали с помощью регистрирующей системы iCycler iQ^ фирмы BIO-RAD.

Для статистической оценки достоверности различия распределений частот аллелей исследованных маркеров в выборке хромосом больных НЭМ I типа и контрольной выборке использовали двусторонний точный критерий Фишера и χ²-тест для двупольной таблицы.

Для оценки неравновесности по сцеплению для полиморфных маркеров использовали оценку  = (P_D – P_N)/(1 – P_N), где  - мера неравновесности сцепления, P_D – частота ассоциированного аллеля среди хромосом с мутацией, P_N – частота этого же аллеля среди хромосом без мутации (Bengtsson et al.,1981).

Для определения возраста мутации использовали подход, оценивающий количество поколений g с момента начала последний волны распространения мутации в популяции до настоящего времени:

где g – число поколений с момента возникновения мутации;  - рекомбинационная фракция (Risch et al.,1995). Возраст мутации вычислялся по формуле a=g*c, где a – возраст мутации, с - средняя продолжительность одного поколения. Продолжительность одного поколения принимали равной 25 годам.
Результаты и обсуждение

Картирование локуса метгемоглобинемии первого типа в Якутии

Опираясь на литературные данные о молекулярно-генетических причинах НЭМ, основным геном-кандидатом для данного заболевания в Якутии был выбран ген CYB5R3. Для подтверждения участия гена CYB5R3 в развитии наследственной метгемоглобинемии у больных народа саха в целом и у больных в выборке, основываясь на предположении о влиянии эффекта основателя на накопление заболевания, были использованы принципы тонкого генетического картирования. Данный подход был выбран в качестве главной стратегии поиска по двум причинам: во-первых, он позволял подтвердить наследственный характер метгемоглобинемии у больных в исследуемой выборке и, во-вторых, позволял оценить единство молекулярно-генетической причины НЭМ в Якутии.

Исследование проводилось с использованием четырех полиморфных маркеров, тесно сцепленных с геном CYB5R3, представляющих собой высокоинформативные динуклеотидные СА-повторы (D22S418, D22S1179, D22S1178 и D22S276). Наиболее удаленные маркеры D22S276 и D22S1179 фланкировали ген в области размером 1581 т.п.н., а генетическое расстояние между ними составило 0,88 сМ.

В результате исследования на 31 из 32 хромосом больных выявлен один гаплотип 4 – 4 – 1 – 5 по маркерам D22S276 – D22S1178 – D22S418 – D22S1179. Оценка статистической достоверности различия распределений частот аллелей и гаплотипов по четырем полиморфным маркерам, сцепленным с геном CYB5R3, проведена на выборке 32 хромосом (16 пациентов), больных метгемоглобинемией, и контрольной выборке, состоящей из 8 хромосом их родственников, не передавшихся больным детям с помощью точного двустороннего критерия Фишера. Таким образом, доказано и статистически подтверждено неравновесие по сцеплению между заболеванием и исследуемым локусом гена CYB5R3, что послужило доказательством причастности гена CYB5R3 в развитии метгемогобинемии в Якутии, а так же подтвердило предположение о наличии эффекта основателя для данного заболевания в указанной популяции (Галеева Н.М., 2006).

Идентификация мутации

Для обнаружения нарушений в гене CYB5R3 методом прямого автоматического секвенирования проведено исследование всей кодирующей области и мест экзон-интронных соединений данного гена образца геномной ДНК одного из пробандов, гомозиготного по гаплотипу D22S276 – D22S1178 – D22S418 – D22S1179 : 4 – 4 – 1 – 5. В результате исследования в экзоне 9 обнаружена ранее не описанная замена с.806 С>Т в гомозиготном состоянии (рис.1). Обнаруженная мутация ведет к замене аминокислоты пролин на лейцин в 269 положении, входящей в состав NADН-связывающего домена белка NADH-цитохром-b5-редуктазы.

Рис. 1. Фрагмент результата автоматического секвенирования области экзона 9 гена CYB5R3 ДНК пробанда с НЭМ I типа (мутация с.806 С>Т)

Методы регистрации мутации p.Pro269Leu

ПДРФ-анализ

Обнаруженная мутация с.806 С>Т приводит к появлению дополнительного сайта узнавания рестрицирующей эндонуклеазы Alu, что позволило разработать систему для идентификации данной мутации на основе ПДРФ-анализа. С помощью указанной методики установлено, что замена с.806 С>Т в экзоне 9 у всех исследуемых больных находится в гомозиготном состоянии, а у всех их родителей - в гетерозиготном (рис.2).

Рис 2. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле при использовании системы идентификации мутации с.806 С>Т в гене CYB5R3 на основе ПДРФ-анализа

m/m – мутация в гомозиготном состоянии;

m/n – мутация в гетерозиготном состоянии;

n/n – мутация отсутствует.

MLPA-анализ

Помимо системы выявления мутации с.806С>Т на основе ПДРФ-анализа, очень удобной в диагностических целях с небольшим количеством исследуемых образцов, разработан другой способ выявления данной мутации, более удобный при работе с выборками большого объема.

В основе данной тест-системы лежит мультиплексная пробозависимая лигазная реакция с последующей амплификацией (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA). Для реакции выбраны три уникальные MLPA-пробы. Прямая проба на норму отличалась от пробы на мутацию не только нуклеотидом в сайте мутации, но и дополнительной GC-богатой вставкой. Данная вставка позволяет отличать продукты реакции для нормы и мутации не только по длине, но и по температуре плавления. Таким образом, разработанная система дает возможность проводить регистрацию продуктов реакции как с помощью ПДАФ-анализа (при использовании электрофореза или капиллярного электрофореза на секвенаторе), так и с помощью анализа кривой плавления (MCA, melting curve analysis), (рис. 3).

А.

Рис.3 Результаты анализа, проведенного с помощью тест-системы на основе MLPA с регистрацией продуктов реакции с помощью ПДАФ – анализа (А) и анализа кривой плавления (Б).

m/m – мутация в гомозиготном состоянии;

m/n – мутация в гетерозиготном состоянии;

n/n – мутация отсутствует.

Б.

Определение аллельного состава гаплотипа хромосомы основателя

Для определения аллельного состава гаплотипа основателя проведен анализ еще девяти дополнительных микросателлитных маркеров (D22S692, D22S1177, D22S1156, D22S272, D22S284, D22S1140, D22S274, D22S928, D22S1141) в семьях с НЭМ и в популяционной выборке. Генетическое расстояние между крайними маркерами D22S692 и D22S1141 составило 11,19 сМ по карте Marshfield. Популяционную выборку составили хромосомы 60-ти здоровых неродственных якутов, не являющихся родственниками больных.

При определении аллеля гаплотипа основателя учитывалось статистически значимое максимальное положительное значение неравновесия по сцеплению. В результате исследования определен наиболее вероятный гаплотип хромосомы основателя: 4-7-6-5-9-4-4-1-5-6-6 по маркерам D22S692-D22S1177-D22S1156-D22S272-D22S284-D22S276-D22S1178-D22S418-D22S1179-D22S1140-D22S274 (табл.1). Сохранная часть гаплотипа основателя показана красным шрифтом на рисунке 4.

Таблица 1. Неравновесие по сцеплению аллелей полиморфных маркеров с НЭМ среди якутов

Маркер	Аллель	р	δ ± 90% ДИ
D22S692	4	<0.001*	0. 64 ± 0.18
D22S1177	7	2.86e^-12	0. 58 ± 0.15
D22S1156	6	3.7e^-11	0. 75 ± 0.14
D22S272	5	0.0009	0. 58 ± 0.22
D22S284	9	1.03e	0.9 ±0.09
CYB5R3	с.806С>Т
D22S1140	6	2.47e^-9	0.86 ±0.13
D22S274	6	0.0000066	0.52 ± 0.17
D22S928	6	0.307	0.2 ± 0.18
D22S1141	4	0.33	0.22 ±0.33

р – значения для двустороннего варианта точного критерия Фишера, звездочкой отмечена ошибка по распределению ²,

 – мера неравновесности сцепления аллелей полиморфных маркеров с локусом заболевания,

ДИ – доверительный интервал

Красным шрифтом выделены маркеры с уровнем значимости p<0,001

“Возраст” мутации

Для вычисления возраста мутации использованы только данные по маркерам D22S692, D22S1177, D22S1156, D22S272 и D22S274, т.к. для других маркеров гаплотипа основателя не выявлено или определено малое количество рекомбинационных событий на хромосомах с мутацией.

При расчете по формуле, впервые предложенной Risch N. et al., среднее значение числа поколений составило 11,4 со среднеквадратичным отклонением 5,4 поколения.

Средняя продолжительность одного поколения принята равной 25 годам (по аналогии с другими работами, посвященными вычислению возраста мутаций у якутов) (Барашков Н.А., 2010, Максимова Н.Р., 2009). Время, за которое произошло накопление мутации в Якутии, оказалось равным 285  135 лет (табл.2). Учитывая, что средний год рождения всех больных 2000, то период начала распространения мутации соответствует концу XVII – началу XVIII века (1715 год  136 лет).

Рис. 4. Полные гаплотипы всех хромосом с мутацией с.806С>T в гене CYB5R3

Примечание: Красным шрифтом выделены аллели, принадлежащие гаплотипу основателя.

Таблица 2. Число поколений и время начала распространения мутации с.806С>T в гене CYB5R3 в Якутии

Маркер	g	возраст
D22S692	6.33	158
D22S1177	9. 86	246.5
D22S1156	7.27	182
D22S272	14.44	361
D22S274	19. 08	477
Среднее значение	11, 4 ± 5.4	285 ±135

Известно несколько работ, в которых проведена оценка возрастов мутаций при различных болезнях, распространенных среди коренного населения Якутии. Наиболее вероятный “возраст” начала экспансии гаплотипа основателя с мутацией q. – 3179 (IVS+1G>A) в гене GJB2, приводящей к нейросенсорной несиндромальной тугоухости, в популяции якутов составил 800 лет (Барашков Н.А., 2010). Времена распространения мутаций с.4582insT в гене CUL7, ответственном за развитие 3М-синдрома, и с.G5741>A в гене NAG, ответственном за развитие SCOP синдрома, равны соответственно 343 и 945 годам (Максимова Н.Р., 2009). Полученные результаты можно разделить на две группы: возраст в районе 900 лет - XI век (q. – 3179 (IVS+1G>A) в гене GJB2 и с.G5741>A в гене NAG) и 300 лет - XVII век (с.4582insT в гене CUL7 и с.806С>T в гене CYB5R3). По историческим данным в X-XI вв. на верхней Лене появились монголоязычные племена, которые вызвали волну миграции аборигенного населения, а также за время совместного проживания оказали заметное влияние на процесс формирования южных предков якутов (Федорова С.А., 2008). Миграция якутского населения наблюдалась также и в XVII веке и вызвана в первую очередь присоединением региона к Русскому государству. Обложение местного населения ясачным гнетом, возникновение эпидемии оспы, стремление к хозяйственному освоению новых, благоприятных для скотоводства и охоты районов, привело к массовой миграции якутского населения и расселению его на обширные территории. Таким образом, полученные данные согласуются с историческими, в которых описаны миграции якутского населения в XI и XVII вв.

Популяционная частота НЭМ в Якутии

Проведен анализ частоты гетерозиготного носительства мутации с.806С>T у представителей центральной (Усть-Алданский улус), вилюйской и северной групп якутов. В ходе работы исследована ДНК 433 здоровых якутов. В результате среди 33 северных якутов обнаружено 2 гетерозиготных носителя, среди 270 центральных якутов - 16 и среди 130 вилюйских якутов – 6 гетерозиготных носителей. При попарном сравнении трех выборок методом χ²-теста, статистически достоверных различий между ними не выявлено. По этой причине три выборки объединены в одну и средняя частота гетерозиготного носительства мутации с.806С>T в гене CYB5R3 составила 55 на 1000 здоровых якутов, т.е. каждый 18 человек является носителем, что необходимо учитывать при выборе терапии в случае какой-либо соматической патологии.

По литературным данным наиболее высокая частота аутосомно-рецессивных болезней в Якутии должна наблюдаться в популяциях центральных и вилюйских якутов. По нашим данным частота гетерозиготного носительства НЭМ I типа у северных оказалась приблизительно равной частоте у вилюйских и центральных якутов. Такая высокая частота носительства среди северных якутов возможно связана с малым объемом используемой в данном исследовании выборки. Таким образом, в результате нашего исследования, частота гетерозиготного носительства мутации с.806С>T среди якутов составила 55:1000. Используя уравнение Харди-Вайнберга, а также опираясь на экспериментальные данные о том, что 2pq= 0,055, определена частота мутантного аллеля в популяции. В нашем случае она составила 0.025, расчетная частота заболевания в Якутии равна 1:1250.

Анализ частоты гетерозиготного носительства мутации с.806С>T проведен в выборках двух географически близких якутской народностях - коряков (64 хромосомы) и чукчей (98 хромосом). В данных выборках мутация не обнаружена. Учитывая географическую и историческую близость, а также сведения о распространенности метгемоглобинемии I типа среди эскимосов Аляски, исследована ДНК представителей канадских эскимосов (78 хромосом). В данной выборке мутация с.806С>T также не обнаружена.

Отсутствие носителей мутации среди представителей коряков и чукчей подтверждает исторически разное происхождение данных народов. Отсутствие мутации у представителей канадских эскимосов, возможно, говорит о существовании другой мутации в гене CYB5R3, вызывающей метгемоглобинемию у данного народа.

Единичные случаи НЭМ в России

В лабораторию ДНК-диагностики ФГБУ «МГНЦ» РАМН в период с 2006 по 2012 год поступили образцы крови 9 пациентов из 8 семей, страдающих метгемоглобинемией. Одна семья чеченской национальности проживает на территории Чеченской республики РФ, все остальные считают себя представителями русской национальности и проживают на территории различных областей РФ. При исследовании всей кодирующей области и мест экзон-интронных соединений гена CYB5R3 изменения выявлены у 4 пациентов из трех семей.

При исследовании ДНК пациента №1, страдающего НЭМ II типа, в экзоне 5 гена CYB5R3 обнаружена ранее не описанная мутация с.339dupC (p.Phe114LeufsX28) в гомозиготном состоянии, приводящая к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стоп-кодона.

При анализе ДНК пациента №2, страдающего НЭМ II типа, обнаружена ранее не описанная крупная делеция экзонов 2-7 гена CYB5R3 в гомозиготном состоянии (c.88-?_301+?del) (Клейменова И.С., Галеева Н.М. и др. 2011). Границы делеции лежали в интронах 1 и 7, и для их точного определения требовалось дополнительное исследование.

При исследовании ДНК пациента №3 и ее сестры, страдающих НЭМ I типа, у обеих обнаружена только одна ранее описанная мутация c.757 G>A (p.Val253Met) в гетерозиготном состоянии в экзоне 9 гена CYB5R3.

Для подтверждения факта гомозиготности пациентов №1 и №2 по выявленным мутациям и подтверждения диагноза наследственная метгемоглобинемия в семье №3, проведено исследование гаплотипов хромосом больных и членов их семей по четырем высокополиморфным маркерам, фланкирующим ген CYB5R3 в области 0.88 сМ по карте Marshfield (рис.5).

В результате исследования у пациентов №1 и №2 подтверждено, что мутации, обнаруженные у них, действительно находятся в гомозиготном состоянии.

Анализ полиморфных маркеров у пациентов в семье №3 выявил два гаплотипа: один из них принадлежал хромосоме, несущей мутацию c.757G>A, а другой, хромосоме с неустановленной мутацией. Один из выявленных гаплотипов сестер (1-4-5-9 по маркерам D22S276-D22S1178-D22S418-D22S1179) совпадал с таковым, обнаруженным на хромосомах, несущих делецию c.88-?_301+?del, пациента №2. При популяционном исследовании частот аллелей и гаплотипов по четырем высокополиморфным маркерам, фланкирующим ген CYB5R3, проведенном в 4 неродственных ядерных семьях, искомый гаплотип 1-4-5-9 не выявлен (рис.5).

Рис.5. Результаты гаплотипирования трех семей с наследственной метгемоглобинемией I и II типов

Примечание: mut 1 - с.448dupC (p.Phe114LeufsX28), mut 2 - c.22-?_633+?del (делеция экзонов 2-7), mut 3 - c.757 G>A (p.Val253Met)

Полученные данные свидетельствуют в пользу наличия у двух сестер из семьи №3 в качестве второй мутации, скорее всего делеции c.88-?_301+?del, которую невозможно зарегистрировать методом прямого секвенирования в гетерозиготном состоянии. Для точного доказательства того, что сестры №3 и №3с действительно являются носителями делеции c.88-?_301+?del было необходимо создать систему для ее выявления в гетерозиготном состоянии, а для этого необходимо определить точные границы данной делеции.

Разработка системы идентификации делеции c.88-?_301+?del в гене CYB5R3

Для поиска границ крупных делеций разработан и предложен универсальный подход, состоящий из нескольких этапов разбиения интронных областей на несколько приблизительно равных по длине фрагментов, проведения мультиплексной ПЦР, содержащей участок каждого из фрагментов, на материале больного гомозиготного по делеции, оценки наличия этих участков в его генотипе и, таким образом, сужения вероятной области расположения границ делеции (рис.6). Наиболее вероятными областями для возникновения делеции представлялись области выделенные красным цветом, содержащие Alu повтор, обнаруженные при помощи программы расположенной на сайте www.repeatmasker.org

Для реализации данного подхода на первом этапе область интрона 1 (10 т.п.н.) разделена на 4 приблизительно равные части, а область интрона 7 (3.5 т.п.н.) - на 3 приблизительно равные части (рис.6). На границе каждой из частей выбраны пары праймеров для амплификации коротких фрагментов данной области интрона. Длины фрагментов и праймеры на каждом этапе исследования подобраны так, чтобы их амплификацию можно проводить в одной пробирке и разделять в одном полиакриламидном геле. По итогам этой части работы у пациента №2 выявлены все искомые фрагменты и, таким образом, сужены области возможной локализации границ делеции.

На втором этапе исследования в оставшейся кандидатной области выбраны три пары праймеров для амплификации коротких фрагментов: две в итроне 1 и одна в интроне 7. В результате анализа у пациента №2 обнаружен только фрагмент интрона 1 (рис.6).

В результате проведения двух последовательных этапов определения границ делеции c.88-?_301+?del, области их возможной локализации максимально сужены до 690 п.о. для правой и 360 п.о. для левой границы, и подтверждено первоначальное предположение о месте возникновения делеции в районе Alu повторов, выделенных на рисунке 6 красным цветом.

Рис. 6. Схема расположения гомологичных областей в интронах 1 и 7 гена CYB5R3 и алгоритм поиска границ делеции c.88-?_301+?del

Примечание: Стрелками схематично указаны места расположения пар праймеров, с которых проводили амплификацию фрагментов, фланкирующих области-кандидаты. + и - выделены пары праймеров, с которых амплификация у пациента с делецией в гомозиготном состоянии прошла и не прошла, соответственно.

На следующем этапе проведено исследование последовательности ДНК пациента №2, амплифицированной с прямого праймера в интроне 1 (int1.4F) и обратного праймера в интроне 7 (int 7.1R), методом прямого секвенирования. Длина полученного фрагмента составила около 800 п.н. и содержала последовательность интронов 1 и 7. Ввиду того, что исследуемые области обладают большой гомологией, установить точные границы этой делеции невозможно (максимальная ошибка составляет 32 п.о.) (рис.7). Учитывая общепринятые рекомендации по номенклатуре мутаций, обнаруженной делеции присвоено название с.22-1320_633+1224del, размер делеции оказался равным 12087 п.о.

На следующем этапе исследования создана система, включающая пару праймеров, фланкирующих область делеции и максимально приближенных к ее границам, пары праймеров, лежащей внутри делеции, и пары праймеров вне делеции. Такая система позволяет выявлять гомо- и гетерозиготных носителей делеции с.22-1320_633+1224del. С ее помощью данная делеция обнаружена в гомозиготном состоянии у пациента №2 и у двух сестер №3 и №3с и их отца №3о в гетерозиготном состоянии.

Рис. 7. Границы делеции с.22-1320_633+1224del

Примечание: А: последовательности ДНК интронов 1 и 7 гена CYB5R3 в норме и при делеции с.22-1320_633+1224del. Места отличий в последовательностях интронов 1 и 7 выделены цветом. Б: схема возникновения мутантной последовательности при делеции.

Анализ наличия делеций в гене CYB5R3

В настоящее время описано около 50 мутаций в гене CYB5R3, следствием которых является дефицит фермента NADH-цитохром-b5-редуктазы, однако ни одной крупной делеции не обнаружено. Данное наблюдение может быть связано с тем, что, действительно, делеции в гене CYB5R3 происходят редко при данном заболевании. Однако нельзя не учитывать вероятность того, что, возможно, до настоящего времени исследователям не попадались пациенты с делециями в гомозиготном состоянии и все исследованные пациенты, несущие делецию, имели в качестве второй мутации замену, лежащую в области этой делеции.

При анализе мировой литературы обнаружено 65 описанных случаев наследственной метгемоглобинемии I и II типов с выявленными мутациями в гене CYB5R3, из них у 44 пациентов мутации обнаружены в предположительно гомозиготном состоянии. При подробном анализе, основанном на предоставленных в работах данных о гетерозиготном носительстве идентифицированной мутации у обоих родителей, кровнородственных браках, а также результатах гаплотипирования, выяснилось, что только у 13 из 44 пациентов можно предполагать наличие в качестве второй мутации крупной делеции, таким образом, крупная делеция может встретиться приблизительно у 20% всех описанных пациентов с метгемоглобинемией. Из 13 пациентов у девяти мутации попадают и у четырех не попадают в область описанной в данной работе делеции с.22-1320_633+1224del.

Доказательством существования крупных делеций в гене CYB5R3 в других популяциях является случай гетерозиготного носительства только одной мутации p.Ala179Thr у двух сибсов из Азиатской части Индии, страдающих метгемоглобинемией I типа. Это свидетельствует в пользу существования в данной семье в качестве второй мутации крупной делеции, которую невозможно зарегистрировать в гетерозиготном состоянии используемыми методами.

Закономерность фенотипических проявлений обнаруженных изменений в гене CYB5R3

По данным мировой литературы первый тип метгемоглобинемии чаще ассоциирован с “мягкими” мутациями (миссенс-мутации), а II тип с “тяжелыми” мутациями (нонсенс-мутации, мутации со сдвигом рамки считывания и мутации сайта сплайсинга) в гене CYB5R3. Для проявления того или иного типа заболевания важна комбинация мутаций у конкретного пациента: мутации, встретившиеся при II типе заболевания всегда являются “тяжелыми”, но в компаунд-гетерозиготном состоянии с “мягкими” мутациями они вызывают I тип заболевания. Три новые, обнаруженные в настоящей работе, мутации у пациентов с НЭМ I и II типов подтверждают общую закономерность гено-фенотипических корреляций наблюдаемых в гене CYB5R3 при наследственной метгемоглобинемии I и II типов (Галеева Н.М., 2012).
ВЫВОДЫ

1. В выборке якутских больных наследственной метгемоглобинемией I типа выявлено статистически достоверное неравновесие по сцеплению с аллелями 4 полиморфных маркеров, фланкирующих ген CYB5R3 на расстоянии 0,88 сМ. Эти данные подтверждают влияние эффекта основателя на накопление НЭМ I типа в Якутии и позволяют картировать локус заболевания в области гена CYB5R3.

2. Установлена причина наследственной метгемоглобинемии I типа в Республике Саха (Якутия) – ранее не описанная однонуклеотидная замена с.806С>Т в гене CYB5R3, приводящая к замене аминокислоты пролин на лейцин в 269 положении белка (p.Pro269Leu). Мутация с.806С>Т выявлена у всех больных в гомозиготном состоянии, у их родителей – в гетерозиготном состоянии.

3. На основе RFLP, MLPA и MCA анализов разработаны высоко эффективные методы регистрации мутации с.806С>Т в гене CYB5R3, пригодные для проведения популяционных исследований и ДНК-диагностики метгемоглобинемии среди коренного населения республики Саха (Якутия) в лабораториях любого уровня оснащения. Определена частота гетерозиготного носительства заболевания среди якутов - 55:1000, расчетная частота заболевания составила 1:1250.

4. Проведена оценка «возраста» мутации в якутской популяции на основе анализа гаплотипов хромосом, несущих мутантный аллель, которая составила 285  135 лет. Полученные данные совпадают с результатами оценки «возраста» распространения мутации, вызывающей 3М-синдром (ген CUL7) в якутской популяции, и со временем присоединения Якутии к России в XVII в.

5. Для двух больных с НЭМ II типа и для одной семьи с НЭМ I типа молекулярно-генетическими методами подтвержден диагноз наследственная метгемоглобинемия и обнаружены две новые мутации: c.22-?_633+?del (делеция экзонов 2-7) и с.339dupC (p.Phe114LeufsX28) и ранее описанная мутация c.757 G>A (p.Val253Met).

6. Предложен и апробирован универсальный подход для поиска границ крупных делеций, определены границы делеции с.22-1320_633+1224del и создана система для выявления ее в гетеро- и гомозиготном состоянии. На основе анализа мировой литературы установлено, что доля крупных делеций в гене CYB5R3 при НЭМ не превышает 20%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ:

Галеева Н.М., Назаренко Л.П., Назаренко С.А., Тверская С.М., Поляков А.В. Молекулярно-генетическая причина наследственной метгемоглобниемии I типа в республике Саха (Якутия)// Медицинская генетика. 2006. Т.5, №9 (51). С.15-20.
Клейменова И.С., Швырев А.П., Середняк В.Г., Сотникова Н.А., Краснокутская А.И., Казанец Е.Г., Галеева Н.М., Волкова З.Г. Врожденная энзимопеническая метгемоглобинемия II типа// Российский вестник перинатологии и педиатрии. – 2011. Т. 56, №6. С. 80-87.
Галеева Н.М., Клейменова И.С., Ненашева С.А., Котлукова Н.П., Поляков А.В. Наследственная метгемоглобинемия I и II типов: описание трех случаев с молекулярно-генетической верификацией//Медицинская генетика. 2012. Т.11, №6 (120). С.39-45.

Публикации в других изданиях:

Галеева Н.М., Назаренко Л.П., Назаренко С.А., Тверская С.М., Поляков А.В. Молекулярно-генеическая причина наследственной метгемоглобинемии первого типа в Республике Саха (Якутия)// Материалы I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции. Вестник РГМУ. 2006. №2. С.49.
Galeeva N.M., Nazarenko L.P., Nazarenko S.A., Tverskaya S.M., Polyakov A.V. Molecular-genetic cause of recessive congenital methemoglobinemia type I in Yakutia”, European Journal of Human Genetics. 2006. V.14, Supp.1. Р. 141-142.
Галеева Н.М., Назаренко Л.П., Назаренко С.А., Тверская С.М., Поляков А.В. Молекулярно-генетическая причина наследственной метгемоглобниемии первого типа в республике Якутии// Генетика человека и патология. 2007. №8. C.140-144.
Galeeva N.M., Spitsin V.A., Polyakov A.V. Recessive congenital methemoglobinemia type I in Yakutia: the frequency of disease gene and age of the mutation// European Journal of Human Genetics. 2008. V.16., Supp.2. Р. 383.
Galeeva N.M., Polyakov A.V. Recessive congenital methaemoglobinaemia type II: a novel mutation in the NADH-cytochrome b5reductase gene in a Russian patient// European Journal of Human Genetics. 2009. V.17. P.334.
Galeeva N.M., Kleymenova I.S., Nenasheva S.A., Poliakov A.V. Novel deletion c.22-1320_633+1224del in gene CYB5R3 in patients with recessive congenital methemoglobinemia in Russia// European Journal of Human Genetics. 2012. V.20.Supp. 1. P.407.

список сокращений

ДИ – доверительный интервал

НЭМ – наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия

ПДАФ – полиморфизм длины амплифицированных фрагментов

ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

т.п.н. – тысяча пар нуклеотидов

п.о. – пара оснований

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ФКУ - фенилкетонурия

CYB5R3 - ген NADH-цитохром b5 редуктазы

NADH—никотинамидадениндинуклеотид

МСА (melting curve analysis) – анализ кривой плавления

MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) – полимеразная цепная реакция с последующей амплификацией

RFLP (restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов