МУСІЄНКО М.М.

ПАНЮТА О.О.

БІОТЕХНОЛОГІЯ РОСЛИН

Рекомендовано Міністерством освіти і науки України

як навчальний посібник для студентів біологічних спеціальностей

вищих навчальних закладів

Київ – 2005
УДК 581.085:573.086.83:577.21

ББК 28.5я73

М91

Мусієнко М.М., Панюта О.О.

Біотехнологія рослин. Навчальний посібник. – К.: Видавничо-поліграфічний центр «Київський університет», 2005. – 114 с.

Висвітлено сучасні положення та методи біотехнології рослин. Наведено основні етапи історії дисципліни, особливості організації біотехнологічної лабораторії, відомості про живильні середовища та методи стерилізації рослинного матеріалу. Розглянуто питання мікроклонального розмноження рослин, клітинної селекції, кріозбереження рослин, одержання біологічно активних речовин, клітинної та генетичної інженерії. Наведено визначення найуживаніших в біотехнології рослин термінів.

Для студентів біологічних спеціальностей, викладачів, аспірантів, спеціалістів у галузі біотехнології, клітинної біології, фізіології рослин.

Рецензенти:

Я.Б. Блюм, д-р біол. наук, членкор НАН України;

О.Л. Кляченко, канд. біол. наук, доцент.

УДК 581.085:573.086.83:577.21

ББК 28.5я73

Гриф надано Міністерством освіти і науки України

(лист №14/18.2-1415 від 23.06.2004)

ISBN 966-594-662-5

ЗМІСТ

ТЕОРЕТИЧНИЙ КУРС
ПРЕДМЕТ, ЗАВДАННЯ І МЕТОДОЛОГІЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ РОСЛИН	5
ІСТОРІЯ РОЗВИТКУ МЕТОДУ КУЛЬТУРИ КЛІТИН, ТКАНИН ТА ОРГАНІВ РОСЛИН	7
ОРГАНІЗАЦІЯ І ОБЛАДНАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНОЇ ЛАБОРАТОРІЇ	9
ЖИВЛЕННЯ КУЛЬТУРИ ТКАНИН	13
АГАР	20
рН–СЕРЕДОВИЩА	20
ПРИГОТУВАННЯ ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ	21
СТЕРИЛІЗАЦІЯ ЖИВИЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩ	22
СТЕРИЛІЗАЦІЯ РОСЛИННОГО МАТЕРІАЛУ	22
КУЛЬТУРА ІЗОЛЬОВАНИХ ОРГАНІВ І ЗАРОДКІВ	26
КУЛЬТУРА ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН І ТКАНИН	32
КУЛЬТУРА КАЛЮСНИХ ТКАНИН	34
КУЛЬТУРА КЛІТИННИХ СУСПЕНЗІЙ	38
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН	43
КРІОКОНСЕРВАЦІЯ КЛІТИН РОСЛИН	50
КЛІТИННА СЕЛЕКЦІЯ	55
КУЛЬТУРА РОСЛИННИХ КЛІТИН І РЕЧОВИНИ ВТОРИННОГО СИНТЕЗУ	59
КУЛЬТУРА ІЗОЛЬОВАНИХ ПРОТОПЛАСТІВ І СОМАТИЧНА ГІБРИДИЗАЦІЯ	64
ВИДІЛЕННЯ І ОЧИСТКА ІЗОЛЬОВАНИХ ПРОТОПЛАСТІВ КАРТОПЛІ	66
КУЛЬТИВУВАННЯ ІЗОЛЬОВАНИХ ПРОТОПЛАСТІВ	68
ЗЛИТТЯ ІЗОЛЬОВАНИХ ПРОТОПЛАСТІВ	71
СЕЛЕКЦІЯ СОМАТИЧНИХ ГІБРИДІВ	74
ГЕНЕТИЧНА ТРАНСФОРМАЦІЯ	75
ВЕКТОРИ ДЛЯ ГЕНЕТИЧНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ РОСЛИН	77
МЕТОДИ ПЕРЕНЕСЕННЯ ЧУЖИННИХ ГЕНІВ У РОСЛИНИ	80
ТРАНСГЕНИ І ЕКОЛОГІЯ	84
ПРАКТИЧНИЙ КУРС
Приготування і стерилізація живильних середовищ	86
Робота 1. Приготування маточних розчинів для середовища Мурасиге і Скуга (МС)	87
Робота 2. Приготування середовища Мурасиге і Скуга (МС). Стерилізація середовища автоклавуванням	88
Робота 3. Стерилізація рідких середовищ пропусканням через бактеріальний фільтр (холодна стерилізація)	88
Стерилізація рослинного матеріалу	89
Робота 4. Стерилізація насіння і вирощування асептичних рослин	89
Робота 5. Стерилізація бульб, коренеплодів і кореневищ	91
Робота 6. Стерилізація листків	92
Робота 7. Стерилізація меристем	93
КАЛЮСНА КУЛЬТУРА	94
Робота 8. Отримання первинного калюсу із різних експлантатів асептичних рослин	94
Робота 9. Дослідження явища фізіологічної полярності	95
Робота 10. Отримання перевивної калюсної культури	96
Робота 11. Дослідження впливу співвідношення ауксин:цитокінін у живильному середовищі на ріст калюсної тканини та її тип	97
КлітиннА суспензіЯ	98
Робота 12. Отримання клітинної суспензії з калюсної тканини	98
МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН	99
Робота 13. Мікроклональне розмноження рослин живцями	99
Робота 14. Стебловий органогенез із листкових дисків тютюну	99
Робота 15. Ризогенез із листкових дисків тютюну	100
Робота 16. Прямий ембріогенез	101
Робота 17. Непрямий ембріогенез	102
культура ізольованих протопластів вищих рослин	103
Робота 18. Виділення і культивування ізольованих протопластів вищих рослин	103
СЛОВНИК ТЕРМІНІВ	107
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ	110

ПРЕДМЕТ, ЗАВДАННЯ І МЕТОДОЛОГІЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ РОСЛИН
За останні 50 років площі земель, які використовуються у сільському господарстві залишились практично без змін, тоді як населення Землі зросло більше ніж у двічі. Забезпечення зрослої кількості населення продуктами харчування відбувалося у ці роки за рахунок поліпшення існуючих та створення нових високопродуктивних, стійких до біотичних і абіотичних факторів сортів рослин, порід тварин, корисних штамів мікроорганізмів. Важливу роль у вирішенні цих питань відіграє біотехнологія і особливо сучасна біотехнологія.

Біотехнологія – напрямок сучасної науки і техніки, основним завданням якого є використання живих організмів і біологічних процесів у виробництві. Термін “біотехнологія” походить від грецьких слів “bios” – життя, “techne” – майструвати, “logos” – вчення. Отже, це науковий напрямок, який поєднує можливості біології і техніки, коли біологія стає основою численних технологій.

Широкого поширення термін “біотехнологія” набув у середині 70^х років ХХ ст., хоча такі галузі біотехнології як хлібопечення, виноробство, пивоваріння, сироваріння, які базуються на використанні мікроорганізмів, відомі з давніх часів.

Сьогодні до складу біотехнології входять промислова мікробіологія, технічна біохімія, генетична інженерія, клітинна інженерія. Сучасна біотехнологія характеризується використанням біологічних методів для боротьби з забрудненням довкілля, захисту рослин від шкідників та хвороб, виробництва цінних біологічно активних речовин (антибіотиків, ферментів, гормональних препаратів тощо).

Сфера використання біотехнологічних процесів постійно розширюється, особливо у сільському господарстві, в охороні здоров’я (сюди можна віднести медицину, фармакологію, охорону навколишнього середовища), харчовій промисловості (харчові та кормові добавки).

Одним із важливих завдань, які має вирішити біотехнологія є пошук природно відновлювальних джерел енергії за рахунок фотосинтезу.

Провідною ідеєю сільськогосподарської біотехнології є отримання повноцінних харчових продуктів безпосередньо із рослинної сировини, без участі тварин. Очікують вирощування повноцінних кормів (багатих на білок, лізин) безпосередньо у процесі фотосинтезу. Можливі шляхи вирішення цієї проблеми це:

1) створення нових азотфіксуючих систем на основі соматичних гібридів між найбільш перспективними сортами рослин і азотфіксуючими рослинами або азотфіксуючими бактеріями (це будуть не соматичні гібриди, а азотфіксуючі симбіотичні асоціації);

2) введення в рослини генів, які забезпечують фіксацію азоту;

3) зміна структурних генів запасних білків за допомогою мутагенезу, щоб включити нові кодони для дефіцитних амінокислот (додавши додаткові кодони або замінивши деякі існуючі на корисніші з точки зору поживності);

4) генетична трансформація.

Не менш важливим напрямком біотехнологічних досліджень є отримання препаратів, які використовуються в охороні здоров’я. За допомогою сучасних біотехнологічних методів отримано понад 70 білкових біологічно активних речовин, у тому числі гормонів, білків крові, імунорегуляторів та імуномедіаторів. Створені сучасні принципи одержання вакцин; розробляються принципово нові методи діагностики та лікування інфекційних, онкологічних та інших захворювань.

Тут слід звернути увагу на те, що добре відомо: дріжджі, „харчуючись” вуглеводнями нафти, синтезують кормовий білок, за участю мікроорганізмів отримують ферменти, фармацевтичні препарати, вітаміни тощо. А те що фізіологічно активні речовини, які містяться в женьшені, раувольфії, маці

снодійному та інших культурах, можна виділяти не лише із відповідних рослин, але й із їхніх клітин, які вирощують на штучних живильних середовищах в умовах in vitro, залишається поки що мало відомим фактом для широкого загалу.

Перспективним є вилучення хімічних елементів із руд та гірських порід під впливом мікроорганізмів або їхніх метаболітів. Целюлозна та паперова індустрія також потребують допомоги біотехнології: так встановлено, що біологічна обробка деревини покращує механічну якість паперу і зменшує витрати енергії на виробництво.

Продемонструвати значення біотехнології у сучасному житті можна на прикладі Японії. Виявилося, що із 113 опитаних компаній у 30 з них (26 %) уже ведуть дослідження з біотехнології, а 55 (49 %) - планують взяти в них участь у найближчий час. Досягнення біотехнології планується використовувати для виявлення або створення мікроорганізмів, які можуть бути використані для запобігання забрудненню навколишнього середовища і збагачення корисних копалин.

Біотехнологію прийнято поділяти на традиційну, або класичну і нетрадиційну, або сучасну.

Традиційні біотехнології, які існують тисячоліттями використовують для отримання необхідних людині продуктів мікроорганізми, організми тварин та рослин.

Об’єктами дослідження нетрадиційної біотехнології, розвиток якої розпочався наприкінці ХІХ століття, стали тканини і клітини вищих багатоклітинних організмів, а також мікроорганізми, створені методами генної інженерії. Вищим досягненням сучасної біотехнології є генетична трансформація – перенесення чужорідних генів та інших носіїв спадковості у клітини рослин, тварин і мікроорганізмів, отримання трансгенних організмів з новими або покращеними властивостями і ознаками. Саме цей напрямок біотехнології дозволить вирішити докорінні завдання селекції біологічних об’єктів на стійкість, високу продуктивність і якість продукції. Уже сьогодні у багатьох лабораторіях світу, у тому числі і в Україні, за допомогою методів генетичної трансформації створені принципово нові трансгенні рослини, тварини і мікроорганізми, які отримали комерційне визнання.

Лауреат Нобелівської премії Норман Борлауг вважає, що лише нові біотехнології можуть врятувати світ від голоду та екологічних катастроф. І суттєва роль у цьому належить біотехнології рослин.

Біотехнологія рослин – це сукупність технічних прийомів для модифікації, покращення, створення та розмноження рослинних організмів, одержання з них корисних речовин.

Вирощування і маніпуляції з клітинами, тканинами і органами рослин поза організмом на штучних живильних середовищах у строго контрольованих умовах дозволяє:

- отримувати результати незалежно від клімату, сезону, ґрунтових умов;

- вивчати такі складні процеси як ріст, клітинна диференціація і розвиток рослинного організму, метаболізм і його регуляція у клітинах і тканинах цілої рослини;

- проводити швидке розмноження у дуже великих кількостях;

- отримувати безвірусний рослинний матеріал;

- створювати принципово нові технології для промисловості і сільського господарства;

- скоротити селекційний процес у 2, а той і 3 рази.

ІСТОРІЯ РОЗВИТКУ МЕТОДУ КУЛЬТУРИ КЛІТИН, ТКАНИН ТА ОРГАНІВ РОСЛИН

Ідея про можливість культивування клітин поза організмом – in vitro – була висловлена стосовно клітин рослин. Однак вперше в культуру було введено клітини тварин. Дослідникам довго не вдавалося культивувати рослинні клітини на штучних живильних середовищах. Перших успіхів у цій області досягли у 30^-х роках ХХ століття, а бурхливого розвитку новий напрямок досліджень набув у 60 – 70^-х роках того ж століття. В історії розвитку цього методу можна виділити декілька періодів.

Період з 1892 по 1902 – перші роботи в області розвитку методу культури ізольованих тканин рослин. Цей період пов’язаний з іменами трьох видатних німецьких вчених: Х. Фьохтінга, К. Рехінгера та Г. Габерландта. Не отримавши експериментальних успіхів, ці дослідники висунули ряд ідей та гіпотез, які були реалізовані значно пізніше.

Х. Фьохтінг, вивчаючи явище полярності у рослин, пробував вирощувати in vitro невеличкі шматочки рослинних тканин. Він показав, що полярність властива навіть самим маленьким фрагментам тканини і припустив, що вона є властивістю самої рослинної клітини.

К. Рехінгер поміщав сегменти стебла тополі, шматочки кореня буряка і кульбаби на вологу поверхню фільтра і спостерігав процес калюсоутворення. Зменшуючи розмір експлантата, він визначив мінімальний розмір фрагмента, здатного утворювати калюс.

Г. Габерландт вперше висловив ідею про можливість культивування in vitro ізольованих клітин рослин та запропонував гіпотезу про тотипотентність будь-якої живої рослинної клітини. Однак його власні спроби культивувати на штучному живильному середовищі групи клітин палісадної паренхіми листка, епідерму традесканції були невдалими. Розрахунок Г. Габерландта на те, що хлорофілоносні клітини паренхіми забезпечать себе органічними речовинами за рахунок фотосинтезу був помилковим. Повністю диференційовані тканини, клітини яких втратили ембріональну активність, не росли і не давали новоутворень in vitro, а способу їх дедиференціації Г. Габерландт не знайшов, фітогормони у той час ще були невідомі.

Період з 1902 по 1922 роки характеризується багаточисельними спробами підібрати оптимальне живильне середовище і умови сприятливі для культивування in vitro ізольованих органів, тканин і клітин рослин.

У цей період були отримані перші результати по культивуванню тканин тварин на живильних середовищах з додаванням сивороток. Однак спроби виростити ізольовані тканини рослин на середовищах з додаванням екстрактів рослинних тканин були невдалими. Помилкою всіх цих досліджень було те, що всі вчені використовували високо спеціалізовані рослинні тканини. Саме вдалий вибір об’єкту визначив успіхи В. Робінса і Котте , які у 1922 році одночасно і незалежно один від одного показали можливість культивування на штучному живильному середовищі меристеми кінчика кореня томатів та кукурудзи. Ці досліди можна вважати початком застосування методу культури ізольованих органів рослин.

Період з 1932 по 1939 роки починається з робіт американського дослідника Ф.Уайта та французького Р.Готре. Успіх цих дослідників обумовили вдалий вибір об’єктів дослідження і ретельний підбір складу живильного середовища для культивування. Вони повторили дослід В.Роббінса і Котте і показали, що ізольовані корені можуть рости у культурі необмежено довго, якщо їх кінчики періодично пересаджувати на свіже живильне середовище. Здатність до необмеженого росту при субкультивуванні була продемонстрована пізніше цими ж авторами для калюсної тканини камбіального та паренхімного походження, а також для тканин рослинних пухлин. Це відкриття дало новий поштовх у роботі по культурі рослинних тканин.

У період з 1940 по 1960 рр. збільшилась кількість видів рослин, тканини яких вирощували in vitro. Їх список становив 142 види. Тривало пересаджувані культури успішно отримували із різних органів і тканин рослини. Були розроблені склади живильних середовищ, вивчено значення макро- і мікроелементів для підтримання нормальної ростової активності тканини. Виявлена потреба культур у вітамінах і стимуляторах росту. Оцінено значення натуральних екстрактів типу ендосперму кокосового горіха, каштана, кукурудзи та інших рослин для підтримання неорганізованого клітинного росту і стимуляції процесів органогенезу і соматичного ембріогенезу у культурі калюсних тканин і клітинних суспензій. Саме у роботі з культурою тканин у 1955 році відкрито новий клас фітогормонів – цитокініни і показано їх значення для поділу клітин in vitro та індукції стеблового морфогенезу.

В цей період розроблено метод отримання і вирощування великих мас клітинних суспензій та метод культивування окремої, виділеної із суспензії клітини, поділ якої індукується за допомогою тканини-няньки.

Період з 1960 по 1975 рр. Найважливішою подією цього періоду була розробка Е.К. Кокінгом методу отримання ізольованих протопластів із тканини кореня і плодів томатів шляхом обробки їх сумішшю пектолітичних та целюлітичних ферментів. Пізніше І.Такебе із співробітниками підібрали умови культивування ізольованих протопластів, за яких вони утворюють нову клітинну стінку, діляться і дають початок клітинним лініям, здатним у ряді випадків до морфогенезу. Вперше отримано і вивчено рослини-регенеранти тютюну, які були сомаклональними варіантами вихідної форми.

Одночасно ізольовані протопласти які ще не утворили клітинну стінку, були використані для розробки методів гібридизації соматичних клітин шляхом злиття протопластів з допомогою поліетиленгліколю (ПЕГ) і введення в них вірусної РНК, клітинних органел, клітин бактерій.

Перші соматичні гібриди були використані як моделі для вивчення поведінки ядерного та цитоплазматичного геномів партнерів у гібридних клітинних лініях і у потомстві соматичних гібридів рослин.

У цей же період французьким вченим Ж.Морелем розроблено метод культури меристем, який дозволяє отримувати безвірусні рослини. За допомогою цього методу оздоровлені рослини розмножуються з високим коефіцієнтом.

Період з 1976 року і до сьогодні – розроблено метод електрозлиття ізольованих протопластів (U.Zimmerman, 1983) і методи селекції гібридних клітин. З використанням ізольованих протопластів і векторів, створених на основі Тi- та Ri–плазмід Agrobacterium tumefaciens і A.rhizogenes розроблено ефективний спосіб перенесення генів для дводольних рослин. Розроблено метод балістичної трансформації або мікробомбардування, який ефективно застосовується і для однодольних рослин.

Методи мутагенезу і клітинної селекції, отримання сомаклональних варіантів застосовують для створення нових форм і сортів сільськогосподарських рослин.

Методи скринінгу біохімічних мутантів привели до появи більш продуктивних і пристосованих до умов культивування клітинних штамів, які використовуються у промисловості.

В Україні експериментальні роботи по культивуванню тканин рослин започатковані 1949 рок в Інституті фізіології рослин АН УРСР. Тут у керованим професором Ф.Л.Калініним відділі росту і розвитку проведено роботи по вивченню фізико-хімічних і біохімічних механізмів пухлинної трансформації рослинних клітин, мікроклональному розмноженню та ін.

Активний розвиток різних напрямків біотехнології рослин припадає на 70-80 роки. У цей період в Інституті ботаніки імені М.Г.Холодного під керівництвом академіка К.М.Ситника проводяться оригінальні роботи з гібридизації протопластів та клітинної селекції.

Сьогодні теоретичні і практичні аспекти біотехнології вирішуються в ряді наукових та вищих навчальних закладів. Серед них – Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Інститут картоплярства УААН, Інститут садівництва УААН, Інститут цукрових буряків УААН, Державний Нікітський ботанічний сад та інші. Українськими вченими охоплене широке коло досліджень, які мають вагоме значення для розвитку вітчизняної та світової біотехнології.

ОРГАНІЗАЦІЯ І ОБЛАДНАННЯ БІОТЕХНОЛОГІЧНОЇ ЛАБОРАТОРІЇ
Культивування рослинних клітин, тканин і органів вимагає дотримання умов стерильності. Ця основна технологічна умова і визначає особливості організації та оснащення лабораторії, де культивують рослинні тканини.

У такій лабораторії мають бути приміщення для проведення наступних операцій:

1) миття і стерилізації посуду;

2) приготування, стерилізації і зберігання живильних середовищ;

3) ізолювання і перевивання культур в асептичних умовах;

4) вирощування культур в термостатованих умовах;

5) біохімічного аналізу матеріалу, кількісного обліку результатів, мікроскопіювання тканин і клітин і т.д., залежно від цілей роботи.

У мийній кімнаті мають бути глибокі раковини з кислотостійкого матеріалу і крани з гарячою і холодною водою, стелажі для сушіння посуду, шафи для зберігання посуду, апарати для дистиляції води та бідистилятори.

Живильні середовища готують в окремій кімнаті, в якій є лабораторні столи, шафи для зберігання реактивів, холодильники для зберігання концентрованих розчинів живильних середовищ, аналітичні, технічні і торсійні ваги, рН-метри, електричні або газові плити, водяні бані, магнітні змішувачі.

Кімната для стерилізації середовищ, інструментів і посуду обладнується автоклавами вертикальними (ВК-60, ВК-75), горизонтальними (ГК-100, АГ-100) і сушильними шафами для стерилізації сухим жаром.

Для проведення робіт в асептичних умовах використовують ламінарний бокс, в який нагнітається стерильне повітря, що проходить через бактеріальні фільтри. Ламінари розміщують в окремій кімнаті. Якщо немає ламінарних боксів, то обладнують спеціальну кімнату-бокс - операційну. Стіни такої кімнати облицьовують кахлем, підлогу застилають лінолеумом. Двері операційної повинні герметично зачинятися і перед ними має бути тамбур (передбоксник). В бокс повинно надходити стерильне кондиціоноване повітря. Бокс оснащують бактерицидними лампами. В операційній кімнаті розміщують покриті легкомиючим матеріалом столи, медичні шафи, бінокулярні мікроскопи, потрібні інструменти, спиртівки.

Ізольовані тканини культивують у термостатованому приміщенні (культуральній) з кондиціонованим повітрям, регульованою температурою (22-28⁰С) і вологістю повітря (70-80%). Регулювання світлового режиму забезпечують за допомогою реле часу.

Лабораторні приміщення оснащують обладнанням, необхідним для біохімічних, гісто- і цитогенетичних та інших досліджень, пов’язаних з основними роботами по вирощуванню рослинних тканин.
Посуд, інструменти і матеріали

Посуд, який використовують при роботі з культурою ізольованих тканин можна розділити на 3 групи:

1. Посуд для приготування і зберігання живильних средовищ: бутлі з темного скла, колби Ерленмейера, колби мірні, колби Бунзена, колби плоскодонні, стакани хімічні, циліндри мірні, піпетки Мора, піпетки градуйовані, часові скельця, лінійки, скляні палички різних розмірів, фільтри Зейтца, скляні та мембранні фільтри.

2. Посуд для вирощування ізольованих тканин: бутлі для культивування клітинних суспензій, колби Ерленмейера, колби Ерленмейера широкогорлі, чашки Петрі різного діаметра, пробірки біологічні, флакони, скельця предметні з ямкою і без ямки, скельця покривні.

3. Посуд, який використовується при пересаджуванні тканин: стакани з кришкою, чашки Петрі, колби Ерленмейера, піпетки, стакани фарфорові для стерилізації інструментів.

Для ізолювання і пересадки тканин на середовища, як правило, використовують скальпелі, пінцети анатомічні, очні пінцети, довгі пінцети з тонкими кінцями, ножиці, пробкові свердла різного діаметра, леза для безпечних бритв і корцанги для їх утримання, металічні петлі, голки анатомічні.

Для роботи з культурою тканин потрібні ряд допоміжних матеріалів: вата, марля, нейлонова тканина, целофан, алюмінієва фольга, обгортковий папір, пергаментний папір, фільтрувальний папір, гумові кільця. Вату використовують для виготовлення пробок, ватних тампонів для піпеток, протирання робочих поверхонь при стерилізації. Марля необхідна для обгортання ватних пробок, фільтрування середовищ, виготовлення мішечків. Для фільтрування клітинних суспензій необхідна нейлонова тканина різної щільності. Із целофану роблять ковпачки для запобігання середовищ від висихання, які закріпляють гумовими кільцями. Алюмінієвою фольгою зручно закривати культуральні посудини замість ватних пробок. Для загортання посуду при стерилізації в автоклаві потрібний обгортковий або пергаментний папір. На фільтрувальному папері підсушують рослинний матеріал після стерилізації.
Миття посуду

Обов’язковою умовою успішного культивування рослинних тканин є чисто вимитий стерильний посуд. Існує два методи миття посуду: кислотний і лужний.

Самим поширеним і надійним методом підготовки скляного посуду, особливо нового, є кислотний – замочування посуду на 4-6 год у хромовій суміші – розчин біхромату калію в концентрованій сірчаній кислоті. Потім посуд багаторазово промивають теплою проточною водою і ретельно ополіскують дистильованою водою.

Використаний посуд звільняють від залишків середовища і ретельно миють з застосуванням звичайних мийних засобів (лужний метод), і ополіскують дистилятом.

Вимитий посуд сушать і стерилізують сухим жаром у сушильній шафі при температурі 170-180⁰С 1-2 год, закривають целофановими ковпачками і зберігають у металевих біксах і пеналах або шафах, захищених від проникнення пилу.
Методи стерилізації посуду

Стерилізація сухим жаром. Культуральний посуд (колби, пробірки, чашки Петрі тощо ) перед наповненням живильним середовищем попередньо стерилізують сухим жаром в сушильній шафі. Тривалість стерилізації: при 150⁰С - 2,5 год, при 160⁰С - 2 год, при 170⁰С - 1 год. Слід пам’ятати, що до цього часу стерилізації необхідно додавати час, який потрібний для нагріву завантажених в шафу предметів до заданої температури.

Стерилізація сухим паром - автоклавування при 2 атм (133⁰С) 30-40 хв в залежності від заповнення автоклава.

Камера автоклава заповнюється не більше як на 2/3 об’єму.

Посуд загорнутий в папір або з ватними тампонами стерилізують автоклавуванням. При автоклавуванні піпеток верхню частину закривають ватним тампоном (приблизно на 2 см) і кожну окремо загортають в папір. Піпетки зручно стерилізувати в скляних пеналах, на дно яких слід покласти вату, щоб запобігти обламуванню носиків піпеток.

Методи стерилізації інструментів

Стерилізація сухим жаром. Інструменти попередньо стерилізують сухим жаром в сушильній шафі. Тривалість стерилізації: при 150⁰С - 2,5 год, при 160⁰С - 2 год, при 170⁰С - 1 год.

Стерилізація полум’ям. В боксі безпосередньо перед роботою інструменти занурюють у фарфоровий стакан з 96⁰ спиртом і стерилізують обпалюванням у полум’ї спиртівки. Стерильний інструмент використовують тільки для одноразової маніпуляції. Перед повторним використанням його слід знову простерилізувати спиртом і обпалити.

Допоміжні матеріали: вату, пробки, марлю, папір, целофан, фольгу стерилізують автоклавуванням.

Перед початком операцій у ламінарному боксі необхідно його підготувати до роботи. Для цього використовують стерилізацію ультрафіолетом 30 хв з послідуючим протиранням робочої поверхні 70-96⁰ спиртом. Іноді досить продування боксу 30 хв стерильним повітрям і протирання спиртом.

Контрольні запитання і завдання

1. Що таке біотехнологія?

2. Чому біотехнологію поділяють на класичну і сучасну?

3. Біотехнологія рослин належить до класичної чи сучасної біотехнології? Відповідь обґрунтуйте.

4. У чому полягає суть методу культури клітин, тканин та органів рослин?

5. Охарактеризуйте основні етапи становлення методу культури клітин, тканин та органів рослин.

6. Яке практичне застосування методу культури тканин?

7. Назвіть загальні принципи організації біотехнологічної лабораторії.

8. Який посуд використовують для роботи з культурою клітин, тканин та органів рослин?

9. Як здійснюється стерилізація посуду та допоміжних матеріалів?

10. Які методи стерилізації інструментів?

ЖИВЛЕННЯ КУЛЬТУРИ ТКАНИН
Живильне середовище для вирощування рослинних тканин і клітин, по аналогії з середовищем для культивування тканин тварин мало б містити все те, що тканини в рослинному організмі отримують від ксилемного та флоемного току речовин. Однак, на практиці з’ясувалося, що рослинні соки не можуть слугувати повноцінним живильним середовищем для вирощування ізольованих тканин і клітин. У цьому проявляється специфіка надходження, транспортування і особливо перерозподілу поживних речовин у рослині.

Основою для підбору різних середовищ для культури рослинних тканин стали живильні розчини, які використовували при вирощуванні цілих рослин. Основоположники методу Р.Готре і Ф.Уайт використали живильну суміш Кнопа і розчин Успенських відповідно.

Ці розчини були доповнені цукрами, мікроелементами, вітамінами. Р.Готре, крім того, зменшив вдвічі концентрацію мінеральних солей вихідного розчину Кнопа. Середовище Ф.Уайта, створене ним у 1943 році на основі розчину Успенських, використовувалось спочатку для вирощування культури ізольованих коренів, а потім без змін – для вирощування рослинних тканин.

З розвитком методу культури тканин і введенням в культуру все нових і нових тканин рослин різних видів виникла необхідність зміни складу живильних середовищ. Найбільш повне дослідження мінерального живлення тканин було проведене Р.Хеллером у 1953 році. Щоб досягти точності роботи, він відмовився від використання твердих агарових середовищ і вирощував тканини лише на рідких живильних середовищах. Р.Хеллер детально дослідив значення окремих іонів для живлення тканин і вплив їх виключення зі складу середовища на подальший ріст тканини при пересаджуваннях. Він запропонував живильне середовище, склад якого суттєво відрізнявся від середовищ, які використовували для цілих рослин, так і від середовищ, які використовували раніше для культивування ізольованих тканин. Це середовище дуже багате на К⁺ і Р⁺. Р.Хеллер запропонував також новий склад суміші мікроелементів.

В результаті ряду досліджень уточнювались вимоги тканин до джерел вуглеводного живлення, вітамінів і фізіологічно активних речовин.

Зараз уже розроблено значну кількість живильних середовищ для культивування in vitro органів, тканин і клітин рослин, більшість з них є модифікаціями основних живильних середовищ (Уайта, Гамборга, Мурасиге і Скуга) (табл. 1). До складу будь-якого живильного середовища для вирощування культури ізольованої рослинної тканини входять слідуючі групи речовин:

мінеральні солі – макро- і мікроелементи;

вуглеводи;

вітаміни;

амінокислоти;

стимулятори росту - синтетичного і натурального походження;

вода;

агар.

У зв’язку з необхідністю змінювати склад живильного середовища під час пошуку оптимуму для нової, ще невипробуваної в культурі, тканини варто зупинитися на характеристиці особливостей живлення ізольованих тканин.

Таблиця 1

Склад живильних середовищ для культивування ізольованих тканин рослин

Компоненти середовища	Концентрація, мг/л
	Гамборга та Евелега	Мурасиге і Скуга	Уайта
Макросолі
NH4NO3		1650
KNO3	2500	1900	80
CaCl22H2O	150	440
Ca(NO3)2 безводний			200
MgSO4 7H2O	250	370	360
KH2PO4		170
KCl			65
NaH2PO42H2O	169,6		18,7
(NH4)2SO4	134
Na2SO4			200
FeSO47H2O	28,0	27,8
Na2EDTA.2H2O		37,3
Fe2(SO4)3			2,5
Мікросолі
H3BO3	3,0	6,2	1,5
ZnSO47H2O	2,0	8,6	3,0
CuSO45H2O	0,025	0,025	0,02
CoCl26H2O	0,025	0,025
KI	0,75	0,83	0,75
Na2MoO42H2O	0,25	0,25	0,0025
MnSO44H2O	13,2	22,3	7,0
Вітаміни
Мезоінозит	100,0	100,0
Гліцин		2,0	3,0
PP	1,0	0,50	0,5
В1	10,0	0,10	0,1
В6	1,0	0,5	0,1
Стимулятори росту
ІОК		2,0
2,4-Д	2,0
Кінетин		0,2
Вуглеводи
Сахароза	20000	30000	20000
Агар	7000	8000	7000
pH	5,5	5,6-5,8

Мінеральне живлення

Макроелементи. Азот. Рослинні тканини, що ростуть в ізольованій культурі, автотрофи у відношенні азотного живлення. Із неорганічного азоту вони синтезують всі необхідні для їх життєдіяльності органічні азотисті сполуки. Джерелами молекулярного азоту є мінеральні солі, амінокислоти.

Кращою формою азотного живлення рослинних тканин є нітрати, які як основне джерело азоту вводяться у середовища у концентраціях 2-25 мМ. Спроби використати джерелом азоту нітрити показали, що вони не могли замінити нітрати: низькі концентрації нітритів були недостатні для оптимального росту рослинних тканин, а великі - токсичні. Кращі результати, ніж при використанні нітритів, отримують при застосуванні, в якості джерела азоту, амонійних солей. Однак, амоній значно менш ефективний як джерело азоту ніж нітрати. Проте, заміна 10-20% нітратів на солі амонію покращує ріст рослинних тканин. Так до складу середовища Гамборга, на якому добре ростуть дводольні і однодольні рослини, крім нітрату (25 мМ) входять і амонійні солі (2 мМ). У деяких випадках для інтенсивного росту калюсних і суспензійних культур сумарну концентрацію нітрату і аміаку доцільно збільшити до 60 мМ.

Азот живильного середовища впливає на морфогенетичні можливості тканини: залежно від нітратної чи амонійної форми азоту індукуються пагони або корені, бруньки або ембріоїди.

При культивуванні рослинних тканин як єдине джерело азоту можна використовувати амінокислоти в L-конформації. Але для більшості культур тканин одна амінокислота або навіть їхня суміш неефективні як єдине джерело азоту, бо ріст цих культур значно повільніший, ніж на середовищах з нітратами. Це може бути обумовлене тим, що амінокислоти не завжди можуть активно дезамінуватися або аміак, що утворився, не може бути використаним для синтезу первинних продуктів. Другою причиною може бути потреба в самих нітратах, оскільки деякі проміжні сполуки відновлення нітратів беруть участь в біосинтезі важливих азотистих метаболітів. Слід зазначити, що ріст ряду ізольованих рослинних тканин активується при введені до складу нітратвмісного середовища окремих амінокислот, найчастіше гліцину, або їхніх сумішей, наприклад, гідролізат казеїну, пектон.

Сірку вводять до складу живильних середовищ у вигляді сульфату, сульфіту, цистеїну, глутатіону або метіоніну. Для більшості тканин найкращим джерелом сірки є сульфати.

Для росту калюсних тканин і ізольованих органів необхідним компонентом середовищ є фосфор. Тканини, які інтенсивно ростуть, особливо чутливі до вмісту фосфору у живильному середовищі і краще ростуть на середовищах багатих фосфором. Як джерело фосфорного живлення, в основному, використовується ортофосфат, але можна використовувати різні фосфати цукрів.

Залізо вводиться у вигляді неорганічних солей (FeCl₃, Fe₂(SO₄)₃) і солей органічних кислот (цитрат і тартрат заліза). Але метаболіти, які виділяють культури тканин, і рН середовища впливають на засвоєння заліза рослинними тканинами. Тому більшість середовищ містять цей елемент в хелатованій формі у комплексі з етилендіамінтетраоцтовою кислотою (ЕДТА). Це покращує доступність заліза при рН до 8,0 впродовж всього періоду росту культури, тоді як відсутність хелатуючого агента може дуже швидко призвести до нестачі його.
Потреба тканини в елементах мінерального живлення залежить від її фізіологічних особливостей. Для молодих швидкоростучих тканин, необхідна наявність у середовищі високих доз калію (К⁺), тоді як старі тканини, навпаки, вибагливі до наявності кальцію (Са²⁺). Так, оптимальна доза кальцію для молодої тканини моркви – 0,25 мМ, для старої тканини ця доза підвищується до 3 мМ.

При відсутності у середовищі калію (К⁺) уже в першому пасажі культури тканин моркви спостерігається пригнічення росту і некрози; у другому пасажі на такому живильному середовищі ріст припиняється і тканина відмирає. Однак перенесення на середовище, яке нормально забезпечене калієм (К⁺), поновлює ріст тканини моркви, навіть якщо перед цим її вирощували на середовищі без калію (К⁺) впродовж двох пасажів.

В результаті ретельного вивчення мінерального живлення ізольованих рослинних тканин дослідники дійшли висновку, що відсутність у живильному середовищі N, K, Ca, Mg, S, P призводить до загибелі культури у першому або у другому пасажі. Наявність Na⁺ і Cl^- не обов’язкова, хоча додавання NaCl в середовище стимулює ріст рослинних тканин. Для більшості елементів існує оптимум концентрації, але його перевищення інколи має токсичну дію.

Крім макроелементів до складу більшості живильних середовищ входять мікроелементи. Додавання до живильного середовища мікроелементів особливо важливе при культивуванні тканин в рідкому середовищі. Відсутність мікроелементів зменшує інтенсивність росту культур на 40 % у першому пасажі і приводить культури до загибелі протягом двох наступних.

При вирощуванні тканин на агаровому живильному середовищі вони не так гостро реагують на відсутність мікроелементів, так як в агарі міститься багато мікроелементів і деякі макроелементи. Однак повнота вмісту мікроелементів в агарі викликає сумніви, а тому більшість дослідників додають повну суміш мікроелементів і до агарових середовищ. Найчастіше використовують суміш мікроелементів середовища Мурасиге і Скуга (МС).

Мікроелементи необхідні для функціонування ферментів та кофакторів.

Вуглеводневе живлення

Культури тканин, навіть ті, що зеленіють на світлі не автотрофні відносно вуглеводневого живлення. При ізолюванні і перенесенні на живильне середовище шматочків хлорофілоносних тканин, вони, як правило, втрачають хлорофіл. При вирощуванні на світлі одні тканини позбавляються хлорофілу (тканина серцевинної паренхіми тютюну), інші тканини на світлі зеленіють (тканини моркви, барвінку рожевого), але не здатні забезпечити себе повністю вуглеводами за рахунок фотосинтезу, і їх необхідно вирощувати на живильних середовищах, які містять вуглеводи.

Найкращим джерелом вуглеводневого живлення для більшості рослинних тканин є сахароза або глюкоза, звичайно у концентрації 2 – 5 %. Але для деяких тканин оптимальними джерелами вуглецю слугують фруктоза, маноза або галактоза. На середовищах з пентозами ізольовані тканини рослин не ростуть, за виключенням ксилози, яка є хорошим джерелом вуглецю для тканини моркви.

Полісахариди, як правило, не використовують як джерело вуглеводневого живлення при вирощуванні культур рослинних тканин. Але, оскільки, деякі тканини здатні виділяти у середовище гідролітичні ферменти, наприклад, амілазу, то вони можуть рости на середовищах з розчинним крохмалем. Здатністю засвоювати полісахариди часто характеризуються тканини деревних рослин, а також тканини пухлинного походження.

Часто оптимальною умовою для росту тканини є наявність в середовищі різних цукрів. Так для підтримання росту тканини топінамбура оптимальною є суміш 0,1 М сахарози та 0,11 М глюкози.

Р.Бутенко із співробітниками отримали цікаві дані щодо характеру росту тканини партеноцисуса на середовищі з глюкозою і сахарозою: якщо на середовищі з глюкозою тканина росла на поверхні агару і розсипалась на окремі шматочки, то на середовищі з сахарозою тканина більш інтенсивно росла у висоту і утворювала загальну компактну масу.

Необхідно особливо відмітити вплив умов стерилізації на дію цукрів. Рядом дослідників було показано, що при автоклавуванні середовища з сахарозою або глюкозою, які спеціально не очищали, відбувається утворення речовин, які стимулюють ріст рослинних тканин.

Досліди по використанню джерелами вуглеводневого живлення спиртів або органічних кислот показали, що із спиртів тканини можуть використовувати лише гліцерин, а органічні кислоти використовуються погано. Хоча як доповнення до середовища з цукром органічні кислоти у низьких концентраціях (0,015 – 0,125 %) стимулюють ріст тканин. Найбільшу стимулюючу дію мали трикарбонові кислоти циклу Кребса.

Вітаміни

До складу середовищ для культивування рослинних клітин, тканин і органів рослин входять вітаміни. Хоча більшість тканин, що культивуються in vitro, здатна до синтезу всіх потрібних для їх життєдіяльності вітамінів, але вони синтезують вітаміни в субоптимальних кількостях і при додаванні вітамінів до середовища ріст тканини покращується. Крім того, внесення вітамінів в живильне середовище може мати формативний ефект. Найважливішу роль у рості культури тканин відіграють вітаміни групи В (тіамін, піридоксин, нікотинова кислота), мезоінозит. Іноді до середовища вводять Са-пантотенат і холінхлорид. Більшість вітамінів, що додають до живильного середовища, входять до складу ферментів, які каталізують різні важливі реакції.

Тіамін (вітамін В₁) – бере участь у процесах перетворення вуглеводів (входить до складу піруватдекарбоксилази). До середовища вводиться у кількості 0,1 – 10 ^мг/_л.

Піридоксин (вітамін В₆) – входить до складу ферментів декарбоксилювання і переамінування амінокислот. В середовища вводиться 0,1 – 1 ^мг/_л В₆.

Нікотинова кислота (вітамін РР) – входить до складу окисно-відновних ферментів дегідрогеназ. В живильне середовище РР вводиться в концентрації 0,5 – 1 ^мг/_л.

Найкращий вплив на ріст культури ізольованих тканин має додавання до середовища суміші вітамінів. Найчастіше використовують суміші вітамінів Уайта (складається з 3 компонентів), Мореля (6 компонентів), Хендерсона (10 компонентів).

Стимулятори росту

Для росту і диференціації будь-яких рослинних тканин і клітин при культивуванні їх на штучних живильних середовищах необхідна наявність у живильному середовищі стимуляторів росту. Без додавання до живильного середовища стимулюючих речовин в культурі здатні рости тільки пухлинні тканини (галові пухлини – їх утворення викликають галові кліщі; пухлини вірусного походження) і камбіальні тканини обмеженої кількості видів рослин (певних сортів моркви, а також верби і ожини). Однак при тривалому культивуванні тканини і ці останні потребують додавання до живильного середовища стимуляторів росту.

Окрему, групу гормоннезалежних тканин становлять, так звані, „звиклі” тканини. Такі тканини утворюють клітини, що виникають у популяції нормальних клітин під час культивування. Вважають, що їхня поява пов’язана зі зміною активності генів.

До речовин, які стимулюють ріст ізольованих тканин належать фітогормони: ауксини, цитокініни та гібереліни.

Багато дослідників для отримання первинної проліферації тканини в культурі і для підтримки інтенсивного недиференційованого росту тканини в пасажах додають до живильного середовища речовини невизначеного хімічного складу. Найчастіше використовують ендосперм кокосового горіха (кокосове молоко), кінського каштана, грецького горіха, кукурудзи, пшениці. Також широко використовують дріжджовий та солодовий екстракт (із пророслих зернівок ячменю), екстракти із різних частин рослин (листків, молодих частин стебла, плодів – томату, апельсину і кавуна). Ці екстракти виявляють рістактивуючі властивості.

следующая страница>