Роль свободнорадикальных процессов в формировании устойчивости к окислительному стрессу у потомков предадаптированных животных 03. 00. 04 биохимия

На правах рукописи

Волосовцова Галина Ивановна
РОЛЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ФОРМИРОВАНИИ УСТОЙЧИВОСТИ К ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ У ПОТОМКОВ ПРЕДАДАПТИРОВАННЫХ ЖИВОТНЫХ
03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону

2009

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биологии Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Шкурат Татьяна Павловна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Эмирбеков Эмирбек Зиядович

доктор медицинских наук

Шестопалов Александр Вячеславович
Ведущая организация: Государственный научный центр – Институт медико-биологических проблем Российской академии наук, г. Москва.

Защита диссертации состоится «____»________2009 г. в___часов на заседании диссертационного совета Д. 212.208.07 по биологическим наукам в ФГОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105/42, ауд. 203.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Южного федерального университета по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148.
Автореферат разослан «_____» _____________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Т. С. Колмакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Cвободныe радикалы кислорода и его активные метаболиты играют ключевую роль во многих биохимических и генетических процессах, протекающих в клетке (Владимиров и др., 1973; Кричевская и др., 1980; Лукаш и др., 1981; Ames, 1983, Halliwell, 1985; Gutteriadge, 1995; Allen, 2000; Kohen еt аl., 2002; Singh, 2004, Benz еt аl., 2008 ). С одной стороны, клетка использует активные метаболиты кислорода для регуляции энергетических систем, с другой – их уровень увеличивается при стрессе различной этиологии, злокачественном росте, атеросклерозе, диабете, бронхиальной астме и др. (Boros et al., 1989; Kasai et al., 1991; Halliwell, 1998; Sahnoun et al., 1998; Лукаш и др., 1999; Шустанова и др., 2001; Yonei et al., 2002; Wu et al.; 2003; Cooke et al., 2003; Reddy, 2008). Свободные радикалы кислорода могут индуцировать деструкцию мембран, снижать активность ферментов и гормонов, вызвать повреждения ДНК, нарушение клеточного цикла и, в конечном итоге, инициировать гибель клетки (Внуков и др., 1983; Chiu et al., 1989, Гуськов и др., 1985; Kang et al., 1999; Jackson et al., 2001; Шустанова и др, 2001; Klein et al., 2003; Djordjevic et al., 2004; Fang et al., 2004; Valco et al., 2005; Милютина и др., 2005). В связи с этим, проблема повышения устойчивости организма к окислительному стрессу является достаточно актуальной.

Ранее было показано, что токсическое действие на организм разнообразных физических, химических и биологических факторов может быть снижено предварительным воздействием малых доз токсического агента. Это явление получило название предварительной адаптации или предадаптации (Ригер и Михаэлис, 1978). Феномен повышения устойчивости организма в результате предадаптации получил название адаптивного ответа (Samson, 1977). Показана неспецифичность феномена адаптивного ответа для различных факторов, условий воздействия (in vivo и in vitro) и объектов (микроорганизмы, растения и животные) (Спитковский, 1992; Joiner еt аl., 1999; Опритов и др., 1999; Моргун и др., 2002; Васильева, 2004; Busija et al., 2008).

Особой формой адаптивных реакций животных является реакция незрелого организма на окислительный стресс. Презумпивные клетки адаптивнее воспринимают новый режим функционирования, чем клетки взрослого организма. Так, у шпорцевых лягушек этот эффект способен сохраняться и после достижения животными половозрелого состояния (Тимофеева, 1997; Гуськов и др., 1999). У новорожденных крыс после воздействия малых доз гипербарической оксигенации (ГБО) формируется качественно новое соотношение про- и антиоксидантных систем, которое сохраняется и у взрослых животных. Предадаптированные крысы приобретают повышенную устойчивость к токсическим режимам ГБО (Азарова, 2005).

Целью настоящей работы явилось изучение свободнорадикальных процессов у предадаптированных к окислительному стрессу животных и их потомков в условиях нормально функционирующего организма и после развития окислительного стресса, индуцируемого ГБО.

Задачи исследования:

1. Определить интенсивность свободнорадикальных процессов в различных тканях потомства предадаптированных в новорожденный период крыс к окислительному стрессу.

2. Определить интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по уровню содержания молекулярных продуктов и антиоксидантный статус в различных тканях у потомков предадаптированных животных после развития окислительного стресса, индуцированного ГБО.

3. Провести сравнительный анализ изменения активности антиоксидантных ферментов и интенсивности перекисного окисления липидов в мозге, печени и легких в ответ на воздействие токсического режима ГБО у потомков, полученных от предадаптированных родителей.

4. Оценить цитогенетические последствия окислительного стресса, индуцируемого ГБО (0,5 МПа-1ч) в пролиферирующих тканях предадаптированных животных и их потомков.

Научная новизна. Впервые показано, что однократное воздействие повышенного давления кислорода (0,2 МПа-1ч) на новорожденных крыс изменяет внутриклеточный метаболизм, в частности систем, ответственных за перекисное окисление липидов, и формирует качественно новое соотношение про- и антиоксидантных систем в организме, которое сохраняется длительное время и наблюдается у потомков первого поколения. Показана возможность передачи устойчивости к окислительному стрессу от животных, однократно обработанных в новорожденный период низким режимом ГБО. Показано, что ответ на действие токсического режима ГБО у потомков предадаптированных животных зависит от пола предадаптированного родителя. Экспериментально показано снижение стресс-индуцированного ГБО накопления продуктов перекисного окисления липидов во всех исследованных тканях у потомков предадаптированных самок. Представлены доказательства повышенной устойчивости генома к окислительному стрессу у потомков самок, предадаптированных в новорожденный период.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Однократная обработка животных низкой дозой ГБО 0,2МПа в течение 1 часа в новорожденном возрасте изменяет внутриклеточный метаболизм тканей, в частности, систем, ответственных за перекисное окисление липидов.

2) Сформировавшееся качественно новое соотношение про- и антиоксидантных систем в организме предадаптированных животных сохраняется у потомков первого поколения.

3) Первое поколение предадаптированных к окислительному стрессу животных обладает повышенной емкостью антиоксидантных систем, которые обеспечивают устойчивость к токсическому режиму ГБО у потомков предадаптированных самок.

4) Однократная обработка животных низкой дозой ГБО в новорожденный период приводит к стабилизации кластогенного эффекта в ответ на действие токсических режимов ГБО. Эффект кластогенной предадаптации сохраняется у потомков первого поколения предадаптированных самок и не выявлен у потомства предадаптированных самцов.

Теоретическое и практическое значение работы: В общетеоретическом плане, выполненная работа расширяет существующие представления о возможностях предадаптации млекопитающих к окислительному стрессу в ряду поколений. Результаты исследования, представленные в работе, позволяют количественно и качественно оценить влияние предадаптации новорожденных животных на устойчивость к повреждающему воздействию на ткани организма ГБО – индуцированного стресса у потомков предадаптированных животных. Выявлена возможность предадаптировать однократной обработкой ГБО в новорожденный период организм взрослых животных и их потомков к окислительному стрессу. Установлен эффект наследования устойчивости к окислительному стрессу у потомков предадаптированных самок. Полученные в работе данные представляют существенный интерес для раскрытия механизмов приспособления организма к постоянно меняющимся условиям окружающей среды, а также для разработки различных методов повышения резистентности организма к экстремальным условиям среды. Полученные результаты расширяют представления о свободнорадикальных и мутационных процессах в организме при окислительном стрессе, открывают новые перспективы их практического применения в адаптационной, космической и подводной медицине. Полученные в работе новые экспериментальные данные используются при чтении лекций в спецкурсах «Свободные радикалы в живых системах», «Мутагены окружающей среды», «Химический мутагенез», «Экологическая генетика», «Основы патобиохимии», «Генетика окислительного стресса».

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных сессиях биолого-почвенного факультета РГУ (2003, 2005, 2006); на международной конференции «Гипербарическая медицина» (Москва, 2003); на Всероссийском съезде ВОГиС (Москва, 2004); на заседании Ростовского отделения общества ВОГиС (2005, 2006); International Workshops and Scientific Discussion Club «New Thechnology in Integrative Medicine and Biology» (Bangkok-Pattaya, 2006); на ХIV международной конференции «New Information Technologies in medicine, biology, pharmacology and ecology» (Гурзуф, 2006); на международной научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)» (Ростов-на-Дону, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ – 2 статьи. Личный вклад 62,5 %,- 1,58 п.л.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов, списка использованной литературы, включающего 189 отечественных и 204 зарубежных источника. Работа содержит 17 таблиц, иллюстрирована 28 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на белых беспородных крысах Rattus norvegicus обоего пола массой 200-250 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Окислительный стресс моделировали воздействием на животных разными режимами гипербарической оксигенации.

Для предадаптации (ПА) животных к окислительному стрессу на 3-й день после рождения 1/3 часть новорожденных животных была однократно подвержена гипербарической оксигенации в режиме 0,2 МПа в течение 1 часа, поскольку в предыдущих исследованиях, выполненных на базе НИИ биологии РГУ, был показан предадаптирующий эффект именно этого режима (Брень, 1997; Тимофеева, 1997; Гуськов и др., 1999). После достижения половозрелости предадаптированных животных (3 месяца) были проведены следующие скрещивания:

интактная самка х интактный самец (♀К х ♂К)

интактная самка х 0,2 МПа-1ч самец (♀К х ♂ПА)

0,2 МПа-1ч самка х интактный самец (♀ПА х ♂К)

0,2 МПа-1ч самка х 0,2 МПа-1ч самец (♀ПА х ♂ПА).

Половозрелое потомство первого поколения, полученное в результате данных скрещиваний, было подвергнуто обработке ГБО в режиме 0,5МПа в течение 1 часа. Изучение воздействия такого режима представляет особый интерес, поскольку не вызывает гибели животных, что позволяет изучать в динамике изменение основных показателей адаптации крыс к окислительному стрессу.

Новорожденные

Р ♀

♂ ♀

♂

Интактные (К) 0,2МПа-1ч (ПА)

После достижения половозрелости (3месяца)

♀

♂

♀

♀

♂

Х

♂

♀

♂

F₁ ♀Кх♂К ♀Кх♂ПА ♀ПАх♂К ♀ПАх♂ПА

1 группа (n=36) 2 группа (n=48) 3 группа (n=52) 4 группа (n=49)

через 3 месяца - воздействие ГБО 0,5МПа-1ч
в каждом варианте скрещивания

(контроль) до ГБО 24ч после окончания ГБО

сразу после окончания воздействия ГБО

Рис.1. Схема эксперимента.

В каждом варианте потомков исследовали животных, обработанных ГБО (0,5МПа-1ч) сразу и через 24 часа после окончания воздействия. Исследования проводились согласно общепринятым нормам биоэтики и в соответствии со статьей 11-й Хельсинской декларации Второй медицинской ассоциации (1964), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003г).

В соответствии с задачами исследования были изучены биохимические, биофизические показатели плазмы крови, эритроцитов, ткани мозга, печени, легких и генетические показатели эпителиоцитов роговицы глаз. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию молекулярных продуктов – диеновых конъюгатов (ДК) (Стальная, 1977), малонового диальдегида (МДА), шиффовых оснований (ШО) (Bidlack, Tappel, 1973). Активность СОД определяли методом Fried (1975), каталазы - методом Королюка и др., (1988). Определение оксидазной активности церулоплазмина (ЦП) проводили методом Ревина в модификации Колба, Камышникова (1982), суммарной пероксидазной активности по методу Лукаша и др., (1996). Содержание белка в гомогенатах тканей, в плазме и в суспензии эритроцитов определяли методом Лоури (1951). Количество гемоглобина определяли гемоглобинцианидным методом (Каракашов, Вичев, 1973). Определение активности антиоксидантных ферментов проводили в лизате эритроцитов и супернатанте гомогенатов тканей и пересчитывали с учетом содержания в биологическом материале белка или гемоглобина. Определение интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) плазмы крови в системе Н₂О₂ - люминол проводили по методу Шестакова и др. (1979). Регистрировали высоту быстрой вспышки (h) и светосумму (Sm) хемилюминесценции в течение 100 секунд.

Для цитогенетических исследований готовили временные давленные препараты роговицы глаз по стандартной методике (Дарлингтон, 1980). Учет аберраций хромосом проводили анафазно-телофазным методом. Пролиферативную активность клеток учитывали с помощью митотического индекса (МИ). В каждом варианте анализировали не менее 1500 анафаз.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica v. 6.0. Достоверность полученных различий оценивали по t – критерию Стьюдента (Владимирский, 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Интенсивность свободно-радикальных процессов и активность антиоксидантных ферментов у предадаптированных животных и их потомков

Результаты проведенных исследований позволили установить, что обработка новорожденных крыс повышенным давлением кислорода 0,2 МПа -1ч приводит к длительным метаболическим изменениям, которые сохраняются у взрослых животных и их потомков первого поколения. У взрослых животных, подвергавшихся воздействию низкого режима ГБО в трехдневном возрасте, отмечалось повышение интенсивности свободнорадикальных процессов, проявляемое в возрастании параметров Н₂О₂-люминол хемилюминесценции в плазме крови. Высота быстрой вспышки, характеризующая разложение предшествующих гидродиоксидов липидов стала больше на 21%, а величина светосуммы - 38% больше, по сравнению с интактными животными (рис.2).

Исследуемые нами параметры хемилюминесценции плазмы крови крыс, полученных в результате реципрокных скрещиваний предадаптированных особей, различались. Так, у потомков предадаптированных самок и интактных самцов интенсивность высоты быстрой вспышки и светосуммы достоверно выше, чем у потомков контрольной группы родителей, на 115% и 49%, соответственно. Менее выраженная интенсивность свободнорадикальных процессов, регистрируемая ХЛ, отмечалась у потомков предадаптированных самцов - высота быстрой вспышки превышала контроль на 49%. У потомков обоих предадаптированных животных величина светосуммы, отражающая степень окисляемости тканевых липидов стала в 2 раза ниже, чем у потомков предадаптированных самок (♀ПАx♂К), но выше чем у контрольной группы на 30% (рис.2).

Рис.2. Интенсивность Н₂О₂-люминол хемилюминесценции в плазме крови у предадаптированных животных и их потомков

Примечание: на рис.2-4. *- обозначает статистически достоверные различия, по сравнению с К, **- ♀Кx♂К.

Следовательно, повышенный уровень свободнорадикальных процессов у предадаптированных к окислительному стрессу животных передается по наследству первому поколению потомков. Уровень индукции Н₂О₂-люминол хемилюминесценции плазмы крови животных зависит от варианта реципрокных скрещиваний. Наиболее повышена интенсивность ХЛ в плазме крови потомков предадаптированных самок.

Изучение процессов ПОЛ показало, что предадаптация к ГБО приводит к повышению содержания в эритроцитах продуктов ПОЛ у животных и их потомков, по сравнению с контролем. В потомстве предадаптированных самок (♀ПАx♂К) уровень первичных (ДК) и вторичных продуктов ПОЛ выше контрольных значений на 33% и 36% (р<0,05), соответственно. У потомков предадаптированных самцов (♀Кx♂ПА) содержание ДК и ШО было выше контроля на 22% и 26% (р<0,05), а у потомков обоих предадаптированных животных уровень ДК на 114% и МДА на 33% превышал значение таковых у потомков ♀Кx♂К.

А Б

В Г

Рис.3. Уровень продуктов ПОЛ у предадаптированных животных и их потомков по отношению к контролю: А) -эритроциты крови; Б) - мозг; В) - печень; Г) - легкие.

Примечание: обозначения на рис.2.
В головном мозге потомков предадаптированных крыс, как и у самих предадаптированных животных, отмечался повышенный уровень содержания продуктов ПОЛ относительно контроля. У животных, полученных от скрещивания предадаптированных самок увеличение содержания первичных продуктов ПОЛ – ДК составляет 184%. В обратном скрещивании, у потомков предадаптированных самцов (♀Кx♂ПА) отмечалось превышение абсолютных значений конечного продукта – ШО на 205%, у потомков обоих предадаптированных животных содержание ДК и ШО выше контроля на 141% и 140%, соответственно.

В печени у потомков предадаптированных животных также регистрировалось повышенное содержание продуктов ПОЛ, по отношению к интактным животным, но в значительно меньшей степени, чем у родителей. У потомков, полученных от скрещивания предадаптированных самок и интактных самцов, уровень МДА был выше контроля на 48%. У потомков предадаптированных самцов и интактных самок отмечено уменьшение содержания ДК на 28% (р<0,05), тогда как уровень МДА стал выше контроля на 37%. У потомков обоих предадаптированных животных в ткани печени было увеличение содержания первичного продукта ПОЛ - ДК на 34% (р<0,05).

В легочной ткани у потомков предадаптированных самок (♀ПАx♂К) было отмечено увеличение содержания изучаемых продуктов ПОЛ: уровень ДК превышал контроль на 73% и МДА - 29% (р<0,05) (рис. 3), тогда как у потомков предадаптированных самцов содержание продуктов ПОЛ в легочной ткани достоверно не отличалось от контроля. У животных, полученных от скрещивания предадаптированных самок и самцов (♀ПАx♂ПА) зарегистрировано увеличение уровня МДА на 50%, по отношению к контролю.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что у предадаптированных к окислительному стрессу животных и их потомков, интенсивность процессов ПОЛ в соматических тканях выше, чем у контрольных животных. Степень накопления продуктов ПОЛ в тканях различна, в зависимости от варианта проведенных скрещиваний.

Токсическое действие свободных радикалов на жизнедеятельность клетки привело к повышению емкости антиоксидантной защиты (Лю, 2002, 2004). Ферментные АО являются первым функционально сопряженным звеном защиты от активных кислородных соединений, в связи с этим следующий раздел работы посвящен рассмотрению влияния предадаптации на активность АО ферментов в крови животных и их потомков.

Рис.4. Активность СОД в эритроцитах у предадаптированных животных и их потомков

Примечание: обозначения на рис.2.
Предадаптированные крысы отличались повышенной активностью антиоксидантных ферментов в эритроцитах. Активность СОД в эритроцитах была более чем в 3 раза выше, по сравнению с интактными животными. У потомков, полученных от скрещивания предадаптированных самок (♀ПА x ♂К и ♀ПА x ♂ПА), повышение активности СОД составило 115% и 104% , соответственно. У потомков предадаптированных самцов (♀Кx♂ПА) активность СОД в эритроцитах повышена на 39% (р<0,05).

В отличие от повышенной интенсивности ПОЛ активность антиоксидантных ферментов в соматических тканях потомков предадаптированных животных значительно ниже контроля. Следует отметить, что у потомков предадаптированных самок активность СОД в головном мозге не имела достоверных отличий, по сравнению с потомками контрольных животных, тогда как у потомков предадаптированных самцов в мозге, печени и легких регистрировали угнетение ее активности. Более того, у потомков предадаптированных самцов в печени и легких зарегистрировано угнетение активности как СОД, так и каталазы.

Таким образом, нами установлено, что потомки предадаптированных к ГБО животных наследуют «изменный окислительный метаболизм», сформировавшийся в организме родителей после однократного воздействия повышенного давления кислорода. Новое соотношение про- и антиоксидантных систем, по-видимому, находилось в равновесии. В пользу этого свидетельствует тот факт, что потомки предадаптированных животных были подвижны, носовых кровотечений и диареи не отмечалось, шерсть была густой, белой, блестящей, крысы не теряли в весе. При вскрытии также не было обнаружено какой-либо патологии внутренних органов. В связи с этим представляло интерес изучить, каким образом предадаптация родителей влияет на устойчивость к ГБО - воздействию их потомков при различных вариантах скрещивания. Поскольку метаболический след предадаптации к окислительному стрессу у потомства имеет разнонаправленный характер, в зависимости от пола предадаптированного родителя, в каждой группе потомков контролем служили животные, не подвергавшиеся воздействию ГБО.

Влияние ГБО на интенсивность свободно-радикальных процессов в различных тканях потомков предадаптированных животных

В эксперименте сеанс ГБО вызывал развитие окислительного стресса, который проявлялся в возрастании параметров Н₂О₂-люминол ХЛ у потомков контрольных животных (♀Кx♂К), тогда как у потомков предадаптированных самок наблюдалось четкое снижение интенсивности хемилюминесценции, которое можно

А Б

Рис. 5. Влияние ГБО 0,5МПа-1ч на интенсивность Н₂О₂ - люминол хемилюминесценции у потомков предадаптированных животных: А) сразу после окончания действия ГБО; Б) через 24 час после действия ГБО

Примечание: на рис. 5 – 10 обозначены статистически достоверные различия, по сравнению с контролем * при уровне различий 0,05; ** - 0,01; *** - 0,001.
рассматривать как показатель устойчивости к ГБО воздействию. У потомков предадаптированных самцов ГБО-индуцированный окислительный стресс вызвал повышение показателей Н₂О₂-люминол ХЛ (как сразу после окончания действия стрессирующего агента, так и в последействии), что можно рассматривать как снижение резистентности к воздействию ГБО (рис.5).

Полученные данные были подтверждены результатами исследования активности антиоксидантных ферментов и содержания продуктов ПОЛ в крови. Так, у потомков предадаптированных самок действие ГБО стимулировало активность СОД и каталазы сразу после окончания действия ГБО на 21% и 41%, соответственно. Очевидно, усиление антиоксидантной защиты было достаточным, чтобы ингибировать ПОЛ на стадии зарождения процесса, на что указывает отсутствие изменений в содержании ДК и МДА в крови животных. Снижение уровня ШО сразу после воздействия ГБО может служить тому подтверждением.

А Б

Рис.6. Изменения активности АО ферментов и уровня продуктов ПОЛ в крови у потомков при ГБО-индуцированном стрессе: А)♀ПАx♂К; Б) ♀Кx♂ПА

Примечание: обозначения на рис.5.
В обратном варианте скрещивания, действие ГБО угнетает антиоксидантную защиту и способствует накоплению продуктов ПОЛ в крови крыс (как сразу после действия, так и через 24 часа).

Следующим этапом нашего исследования явилось изучение СПА в плазме крови как одного из показателей дестабилизации мембран эритроцитов при действии токсического режима ГБО. У потомков предадаптированных самок (♀ПАx♂К) отсутствие изменений СПА можно расценивать как показатель резистентности мембран к повреждающему действию ГБО. У потомков предадаптированных самцов следствием усиления ПОЛ в крови, обнаруженном нами при окислительном стрессе, явилась дестабилизация эритроцитарных мембран, зарегистрированная в значительном повышении уровня СПА как в условиях ГБО, так и в постгипероксический период.

А Б

Рис.7. Динамика (А) СПА (усл.ед./мл) и (Б) ЦП в плазме крови потомков предадаптированных животных после ГБО - 0,5 МПа-1час

Примечание: обозначения на рис.2.
Действие ГБО в режиме 0,5МПа-1ч приводит к резкому повышению оксидазной активности ЦП в плазме крови потомков предадаптированных самцов, составляющей 68% (рис.7), по сравнению с контрольным значением (до ГБО воздействия).

Интенсивность свободнорадикальных процессов, состояние антиоксидантной системы, в первую очередь, зависят от характера метаболических процессов в различных тканях. Большое значение имеют не только абсолютные величины активности про- и антиоксидантных систем, но и их соотношение между собой, буферная емкость антиоксидантной защиты.

Как видно из представленных данных, воздействие токсического режима ГБО у потомков предадаптированных самок снизило уровень первичных и конечных продуктов ПОЛ в мозге (рис.8). Уровень содержания МДА, ДК и ШО не изменился

А Б

Рис.8. Изменения активности СОД и уровня продуктов ПОЛ в мозге у потомков: А) ♀ПАx♂К, Б) ♀Кx♂ПА после ГБО (0,5МПа-1ч)

Примечание: обозначения на рис.2.

и остался таким через 24 часа после окончания действия стрессирующего агента. Активность СОД увеличилась на 44%, что, возможно, оказалось достаточным для снижения уровня продуктов ПОЛ - ДК и ШО.

У потомков, полученных в результате скрещивания предадаптированных самцов и интактных самок (♀Кx♂ПА), пребывание в условиях токсического режима ГБО (0,5 МПа-1ч) вызвало ингибирование активности CОД в мозге на 68%. В постгипероксический период отмечалось значительное накопление изучаемых молекулярных продуктов ПОЛ и активность СОД (рис.8). Избыточная выработка перекиси водорода в результате реакции дисмутации ведет к увеличению образования гидроксильных радикалов, взаимодействие которых с ненасыщенными жирнокислотными цепями в молекулах липидов относится к первому типу реакций и может рассматриваться как одна из основных реакций инициирования перекисного окисления липидов в биологических мембранах. Следовательно, можно предположить, что через 24 часа после окончания воздействия ГБО (0,5МПа-1ч) в мозге у потомков предадаптированных самцов происходит инициация свободнорадикальных процессов.

Следующим этапом нашей работы было исследование влияния действия ГБО (0,5МПа-1ч) на интенсивность свободнорадикальных процессов в печени потомков предадаптированных к окислительному стрессу животных. Печень участвует в регуляции практически всех видов обмена веществ и обеспечивает необходимые условия жизнедеятельности для других органов и тканей. Стрессорное действие ГБО характеризуется развитием ПОЛ, занимающего ключевое место в повреждении гепатоцитов.

А Б

Рис.9. Изменения активности СОД, каталазы и уровня продуктов ПОЛ в печени у потомков группе животных: А) ♀ПАx♂К, Б) ♀Кx♂ПА после ГБО (0,5МПа-1ч)

Примечание: обозначения на рис.2.

Сразу после окончания действия повышенного давления кислорода у животных, полученных в результате скрещивания предадаптированных самок и интактных самцов, в печени снизилось содержание молекулярных продуктов ПОЛ: МДА - 40%, ШО - 22% при увеличении активности каталазы на 12% (р<0,05) и осталось без изменений через 24 часа (рис.9).

В условиях токсического режима ГБО у потомков предадаптированных самцов ингибировалась активность антиоксидантной защиты. Сразу после окончания воздействия ГБО (0,5 МПа-1ч) активность каталазы в ткани печени уменьшилась на 45% в сравнении с контролем, что сопровождалось накоплением молекулярных продуктов ПОЛ в постгипероксическом периоде. Уровень МДА, ШО превосходили контроль на 167% и 115%. При этом активность ферментов антиоксидантной защиты (СОД и каталазы) также значительно возрастала (рис. 9).

При контакте с гипероксической средой напряжение кислорода последовательно возрастает в легочной ткани, затем в крови и далее в других органах и тканях. Ткань легких в силу своей специфической функции газообмена и в связи с общепринятым способом оксигенациии подвергается действию относительно более высокого парциального давления кислорода.

Воздействие токсического режима ГБО у потомков предадаптированных самок и интактных самцов (♀ПАx♂К) приводило к снижению уровня ПОЛ в легких, о чем свидетельствует снижение содержания ДК, ШО и активности СОД (рис.10). Через сутки после воздействия ГБО активности СОД стала еще ниже (на 70%), по сравнению с контролем, а активность каталазы повысилась. Восстановление функционального равновесия процессов пероксидации и антиоксидантной защиты проявилось снижением уровня продуктов перекисного окисления липидов (рис.10).

А Б

Рис. 10. Изменения активности СОД и уровня продуктов ПОЛ в легких у потомков группе животных: А) ♀ПА x ♂К, Б) ♀К x ♂ПА после ГБО (0,5МПа-1ч)

Примечание: обозначения на рис.2.
У потомков предадаптированных самцов (♀Кx♂ПА) сразу после окончания воздействия ГБО (0,5 МПа-1ч) в ткани легких достоверных изменений изучаемых показателей не наблюдалось. Однако через 24 часа отмечали резкое смещение равновесия про- и антиоксидантной активности в сторону усиления процесса перекисного окисления липидов, о чем свидетельствует значительное накопление молекулярных продуктов ПОЛ на фоне чрезмерного напряжения антиоксидантной системы защиты клетки – повышение активности антиоксидантных ферментов. Уровень ДК, МДА и ШО превышал контрольные значения на 154%, 437% и 210%, соответственно, а активность СОД и каталазы – на 217% и 120%, соответственно.

Таким образом, ответ на действие токсического режима ГБО у потомков предадаптированных животных зависит от пола предадаптированного родителя. Полученные результаты свидетельствуют, что мозг, кровь и периферические ткани потомков предадаптированных самок более устойчивы к развитию окислительного стресса, индуцированного ГБО, по сравнению с потомками предадаптированных самцов.

Аберрации хромосом и пролиферативная активность эпителиоцитов роговицы глаз у потомков предадаптированных животных

Степень кластогенного действия какого-либо фактора может отражать направленность и выраженность протекающих в организме процессов свободнорадикального окисления, поскольку основной причиной нарушения целостности ДНК при различных стрессорных воздействиях является прямое и опосредованное действие активных метаболитов кислорода. Снижение уровня аберраций хромосом после воздействия токсической дозы агента у любых организмов составляет суть кластогенной адаптации и неотьемлимую часть реакции адаптивного ответа (Riger et al., 1990). Во всех вариантах эксперимента у животных, полученных от реципрокных скрещиваний, уровень аберраций хромосом находился в пределах спонтанного (1,7-2,6%). После действия токсического режима ГБО (0,5МПа-1ч) уровень аберраций хромосом в эпителиоцитах роговицы глаз вырос в 3 раза и через сутки оставался на высоком уровне (табл.1, 2).

Таблица 1.

Уровень аберраций хромосом в эпителиоцитах роговицы глаза у потомков предадаптированных животных

ВАРИАНТ		До ГБО	ГБО	Через 24ч после ГБО
F₁	♀Кх♂К	1,7 ± 0,16	6,7 ± 0,31*	5,4 ± 0,29*
	♀ПАх♂К	2,5 ± 0,27	2,3 ± 0,27	2,4 ± 0,34
	♀Кх♂ПА	2,6 ± 0,47	1,9 ± 0,17	4,3 ± 0,27*

Примечание: достоверность * при Р<0,05

У животных первого поколения, полученных в результате различных вариантов скрещиваний адаптированных и неадаптированных к окислительному стрессу родителей, ответ на действие повышенного давления кислорода различен. Так у потомков предадаптированных самок (♀ПАx♂К) при воздействии токсического режима ГБО уровень аберраций хромосом остается неизменным. Пролиферирующая активность клеток не нарушена. Одинаковый уровень хромосом (как до воздействия, так и после) можно рассматривать как свидетельство кластогенной адаптации к повреждающему агенту.

Таблица 2.

Уровень пролиферативной активности эпителиоцитов роговицы глаза у потомков предадаптированных животных

ВАРИАНТ		До ГБО	ГБО	Через 24ч после ГБО
F₁	♀К х ♂К	1,6±0,14	1,6±0,13	1,6±0,11
	♀ПА х ♂К	2,5±0,24	2,1±0,18	0,7±0,11
	♀К х ♂ПА	1,6±0,15	0,8±0,09*	1,0±0,09

Примечание: достоверность * при Р<0,05

Совершенно иную реакцию на окислительный стресс, индуцируемый действием ГБО в режиме 0,5МПА-1час, зарегистрировали при обратном скрещивании. В результате действия повышенного давления кислорода у потомков предадаптированых самцов и интактных самок практически в 2 раза вырос уровень аберраций хромосом, при этом пролиферативность эпителиальных клеток роговицы глаза животных снизилась. Следовательно, у потомков предадаптированных самцов отмечались отрицательные последствия действия окислительного стресса на геном.

Динамика некоторых биохимических показателей может дать существенную информацию о процессах, определяющих возможности адаптации животных к экстремальным воздействиям ГБО. Показатели стрессорного состояния организма и цитогенетический анализ процента аберраций хромосом в эпителиоцитах глаз позволяют комплексно оценивать реактивность организма к повреждающему агенту. Анализируя данные реципроктных скрещиваний (предадаптированная самка и интактный самец, интактная самка и предадаптированный самец), можно говорить о материнском эффекте в наследовании адаптивной реакции практически по всем исследуемым показателям.

Согласно концепции протекторного катаболизма (Гуськов и др., 1989), механизм, обеспечивающий адаптацию на молекулярном уровне, заключается в следующем. При действии стрессорных факторов на организм наименее стабильные продукты биополимеров клетки подвергаются деструкции, продукты которой увеличивают резистентность организма, т.е., обеспечивают адаптацию. При длительном и многократном воздействии экстремального фактора возможности цитоплазматического протекторного катаболизма исчерпываются и необратимому повреждению подвергаются ядерные структуры части соматических клеток. Ephrussi (1959) описал «эпигенетическую изменчивость» у многоклеточных организмов и показал, что константное вегетативное наследование приобретенных признаков связано не с изменением генотипа, а с изменением детерминант цитоплазмы. Ранее была показана роль митохондрий в повышенной устойчивости к окислительному стрессу у новорожденных животных, по сравнению с более взрослыми животными. Так при изучении активности митохондриальной аконитазы и 8-ОНdG как индикаторов уровня митохондриального супероксида и окислительных повреждений ДНК, соответственно, было выявлено, что при окислительном стрессе у взрослых животных активность фермента и содержание 8-ОНdG увеличивались, в отличие от незрелых крыс. При этом активность MnSOD и CuZnSOD не изменялась ни у взрослых, ни у незрелых животных. Эти результаты позволили предположить, что митохондриальный окислительный стресс может быть ключевым фактором, который обеспечивает устойчивость развивающегося организма к АФК индуцированному повреждению (Patel et al., 2003).

Известно, что в митохондриях находится примерно 90% клеточного кислорода, из них 2% конвертируется в супероксидные радикалы. В условиях гипероксии нарушение функционирования электрон транспортной цепи митохондрий может приводить к повышению уровня свободных радикалов. Металлосодержащие белки дыхательной цепи митохондрий – один из основных источников эндогенных активных форм кислорода в клетке (Melovs et al., 1998). Частота спонтанных митохондриальных мутаций в 5–10 раз выше, по сравнению с ядерными (Brown et al., 1982), и при этом в условиях окислительного стресса наиболее часто регистрируются трансверсии. Более того, показана способность повреждений в митохондриальной ДНК персистировать, т. е., сохраняться в ряду клеточных поколений, в то время как повреждения ядерного генома эффективно репарируются. Вероятность возникновения новых изоформ белковых молекул после действия ГБО достаточно велика. Особое значение при этом будут иметь те белки, которые участвуют в контроле уровня АФК.

Возможно, в наших экспериментах материнский эффект устойчивости к окислительному стрессу может быть обусловлен появлением новых изоформ митохондриальных цитохромоксидаз.

На основании результатов проведенных исследований и данных литературы по исследуемой проблеме, мы предполагаем следующие возможные механизмы наследуемой адаптации новорожденных животных к окислительному стрессу: геномный импринтинг материнских хромосом как следствие метилирования ДНК после окислительного стресса; изменения экпрессии генов адаптивных признаков; неспецифическая активация генов, контролирующих интенсивность свободнорадикальных процессов в ядрах ооцитов; формирование новых изоформ митохондриальных цитохромоксидаз; селекция митохондрий в гетероплазматических клетках овариальных животных.

Выводы:

Однократное воздействие гипербарической оксигенации в режиме 0,2 МПа-1ч на новорожденных крыс вызывает изменения в окислительном метаболизме взрослых животных, характеризующиеся качественно новым соотношением про- и антиокисдантных систем организма. Эти изменения наследуются потомками первого поколения.
Уровень повышенной индукции Н₂О₂-люминол хемилюминесценции плазмы и молекулярных продуктов ПОЛ в крови животных первого поколения зависит от пола предадаптированного родителя. Наиболее существенно повышен уровень ХЛ в плазме крови потомков предадаптированных самок и интактных самцов.
Характер скрещивания влияет на систему антиоксидантной защиты крови, что проявляется в более высокой активности СОД у потомков предадаптированных самок, по сравнению с потомками предадаптированных самцов.
Воздействие ГБО 0,5 МПа-1ч снижает уровень молекулярных продуктов ПОЛ в мозге и печени у потомков предадаптированных самок (F₁♀ПАx♂К) и увеличивает - у потомков предадаптированных самцов (F₁ ♀Кx♂ПА).
Во всех вариантах эксперимента у потомков, полученных от реципрокных скрещиваний предадаптированных животных, уровень аберраций хромосом в соматических тканях находится в пределах адаптивной нормы. Воздействие токсического режима ГБО (0,5МПа-1) не изменяет уровня аберраций хромосом в эпителиоцитах роговицы глаза у потомков предадаптированных самок и увеличивает у потомков предадаптированных самцов.

Список работ, опубликованных работ по теме диссертации в издании, рекомендованных ВАК РФ:

Шкурат Т.П., Волосовцова Г.И., Прокофьев В.Н. Влияние предварительной обработки животных окислительным стрессом на состояние антиоксидантных систем у потомков первого поколения.//Валеология. 2009. – №1. – С. 76-82. – 0,29 п.л.,- личный вклад 90%.
Гуськов Е.П., Машкина Е.В., Беличенко Н.И., Вардуни Т.В., Волосовцова Г.И., Гуськов Г.Е., Шкурат Т.П. Мутационные процессы у животных, предадаптированных к окислительному стрессу. //Экологическая генетика. 2009. – Т.VII.-№1. –С. 40-47. – п.л., - 0,36 личный вклад 45%.

Список работ, опубликованных работ по теме диссертации

Guskov E.P., Shkurat T.P., Milutina N.P., Mashkina E.V., Prokofiev V.N., Pokudina I.O., Timofeeva I.V., Belichenko N.I., Volosovceva G.I. Resistance to oxidative stress maternal effect //VIII International meeting on high pressure biologi.-Moscow, 2-6 june, 2003., P. 24-25.- 0,08 п.л.,- личный вклад 45%.
Гуськов Е.П., Шкурат Т.П., Милютина Н.П., Прокофьев В.Н., Машкина Е.В., Беличенко Н.И., Волосовцова Г.И., Азарова А.Э. Устойчивость к окислительному стрессу: материнский эффект.//III Съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». М., 6-12 июня 2004 г., С. 429.- 0,04 п.л.,- личный вклад 35%.
Волосовцова Г.И., Азарова А.Э., Машкина Е.В., Беличенко Н.И., Гутникова Л. В., Шкурат Т.П., Гуськов Е.П. Цитогенетическая адаптация к окислительному стрессу.//III Съезд ВОГиС “Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития». М., 6-12 июня 2004., С. 449. - 0,04 п.л., - личный вклад 80%.
Азарова А.Э., Машкина Е.В., Беличенко Н.И., Волосовцова Г.И., Шкурат Т.П., Гуськов Е.П. Кластогенная адаптация к ГБО - индуцированному стрессу//. В сб. «Актуальные проблемы биологии и медицины», Томск, 2004 - С.16-19.-0,17 п.л.,- личный вклад 35%.
Азарова А. Э., Волосовцова Г.И., Прокофьев В.Н., Милютина Н.П., Шкурат Т.П.. Свободнорадикальные процессы в тканях животных, предадаптированных к окислительному стрессу.//"Известия Высших учебных заведений Северо-Кавказский регион", Естественные науки, приложение №3 (27). Ростов-на-Дону. 2005г.- C. 63-67.- 0,22 п.л.,- личный вклад 40%.
Shkurat T.P., Mashkina E.V., Volosovcova G.I., Milutina N. P., Guskov E.P. Mutation and free-radical processes in animals, pre-adapted to oxidative stress.//International Workshops and Scientific Disscussion Club « New Technology in Integrative Medicine and Biology» «Stress and extreme conditions» //Bangkok-Pattaya, Thailand, 1-13 march, 2006.- Р. 84.-0,04 п.л.,- личный вклад 65%.
Гуськов Е.П., Волосовцова Г.И., Прокофьев В.Н., Шкурат Т.П. Устойчивость к окислительному стрессу у предадаптированных животных и их потомков. «Открытое образование» Международная конференция и дискуссионный научный клуб: Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии, IT + M&E;’ 2006» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, июнь 2006. –С. 427-429.- 0,17 п.л.,- личный вклад 90%.
Волосовцова Г.И. Антиоксидантный статус потомков крыс предадаптированных к окислительному стрессу. Тез. докл. Научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)».Ростов н/Д., 2006.-С. 167.-0,04 л.,-личный вклад 100%.

ЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АО - антиоксиданты

АФК – активные формы кислорода

АХр – аберрации хромосом

ГБО – гипербарическая оксигенация

ДК – диеновые конъюгаты

К - контрольные животные

МДА – малоновый диальдегид

МПа - мегапаскаль (в международной системе единиц давления принят

паскаль (Па); I Па=1,02x10^-5 ат =2,02x10⁵ ати; I ат (атмосфера

техническая )-0,98x 10⁵; I ати( атмосфера избыточная) = 1,98x10⁵ )

МЭ - мембраны эритроцитов

ПА – предадаптированные животные

ПОЛ – перекисное окисление липидов

СОД – супероксид дисмутаза

СПА – суммарная пероксидазная активность

СРП – свободно радикальные процессы

ХЛ – хемилюминесценция

ЦП - церулоплазмин

ШО - шиффовые основания

Н – высота быстрой вспышки ХЛ

Sm – светосумма ХЛ