На правах рукописи


КОЛОБОВ

Александр Александрович


СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

γ-D-глутамил-L-триптофана (Бестима)

14.00.36 – аллергология и иммунология

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

2008

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства России.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Полевщиков Александр Витальевич

доктор биологических наук, профессор Самойлова Кира Александровна

доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна

Ведущая организация:

Государственный научный центр Российской Федерации Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России

Защита состоится «__»___________2008г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 001.022.01 при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан «__»___________2008 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования:

В настоящее время гуморальные регуляторные факторы иммунной системы, действующие как местно, так и на системном уровне, находятся в центре внимания клинических иммунологов как потенциальные лекарственные препараты. Они используются для модуляции активности иммунной системы с целью лечения целого ряда патологических состояний и заболеваний (Кетлинский и др., 1992; Кетлинский, Калинина, 1998; Новиков, 1999; Jeffery, 2004). Особое место среди биорегуляторов иммунной системы занимают низкомолекулярные медиаторы полипептидной природы. Их особая роль заключается в тесной функциональной взаимосвязи с другими гормонами, особенно с гормонами гипоталамуса, гипофиза, надпочечников и половых желез, обеспечивающей один из механизмов реализации нейроиммуноэндокринных взаимодействий (Blalock, 1989, Jiang et al., 1998, Dantzer, 2004).

Действие низкомолекулярных пептидных биорегуляторов селективно и высокоспецифично, их эффективные концентрации лежат в зоне микро- наномолярных значений. Как правило, они нетоксичны и неиммуногенны, время их действия ограничено, они быстро разлагаются до аминокислот под действием протеолитических ферментов. Совокупность уникальных биологических свойств и возможности промышленного получения низкомолекулярных пептидов с помощью методов химического синтеза делают этот класс соединений одним из наиболее перспективных кандидатов для разработки новых лекарственных препаратов (Шабанов, 2006).

Одной из задач современной иммунофармакологии является изучение структурно-функциональной организации биорегуляторов, т.е. зависимости проявления биологической активности от структуры молекул, которое помогает установить механизмы их действия на молекулярном и клеточном уровнях. Знание структурно-функциональной организации позволяет целенаправленно подходить к конструированию новых аналогов, обладающих селективной активностью и уникальными фармакологическими свойствами, стимулирует разработку лекарственных препаратов на их основе. В тоже время понимание механизмов функционирования лекарственных препаратов позволяют более обоснованно и эффективно применять их в иммунокорригирующей терапии (Козлов и др., 2001; Нестерова и др., 2002). В связи с этим, разработка новых синтетических иммуномодуляторов пептидной природы и изучение механизмов их действия является актуальной теоретической и практической задачей.

Настоящее исследование посвящено изучению иммунотропной активности нового семейства иммуномодулирующих препаратов – γ-глутамил содержащих дипептидов, исследованию их структурно-функциональной организации, установлению механизма действия и клинико-иммунологической характеристике наиболее активного по совокупности использованных тестов соединения γ-D-глутамил-L-триптофана.

Результаты проведенных исследований положены в основу включения лекарственного препарата Бестим, в котором γ-D-глутамил-L-триптофан используется в качестве фармакологически активной субстанции, в терапию заболеваний, сопровождающихся дисбалансом Тх-1/Тх-2 звеньев иммунитета и снижением функциональной активности макрофагов.

Цели исследования:

Изучение закономерностей структурно-функциональной организации γ-глутамил содержащих дипептидов, исследование спектра иммуномодулирующей активности и механизма действия γ-D-глутамил-L-триптофана, разработка нового иммунотропного препарата пептидной природы на его основе.

Основные задачи исследования:

1. 
   исследовать взаимосвязь структура-активность в ряду γ-глутамил содержащих дипептидов и осуществить дизайн структуры с наиболее высокой иммуномодулирующей активностью;
   
2. 
   изучить влияние γ-D-глутамил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку, пролиферативную и функциональную активность иммунокомпетентных клеток;
   
3. 
   провести исследование взаимодействие Бестима с клеточными рецепторами;
   
4. 
   исследовать фармакокинетические свойства Бестима при различных путях введения препарата;
   
5. 
   изучить иммуномодулирующее действие Бестима в экспериментальных моделях с преимущественной активацией иммунного ответа по Тх-1 или Тх-2 типу при различных путях введения препарата;
   
6. 
   провести клинико-иммунологическую характеристику лекарственного препарата Бестим в ходе клинических испытаний.
   

Научная новизна:

Впервые показано, что дипептиды, содержащие глутаминовую кислоту, соединенную γ-связью со следующим аминокислотным остатком, а также их аналоги с β-связью по аспарагиновой кислоте обладают выраженным иммуномодулирующим действием. Проведенные исследования выявили такие структурные особенности нового семейства иммуномодуляторов как предпочтительность глутаминовой кислоты по отношению к аспарагиновой в первом положении, наличие триптофана с немодифицированным индольным кольцом и глутаминовой кислоты в D-конфигурации, отсутствие модификаций на N- и С-концах молекулы. Доказано, что наибольшей иммуностимулирующей активностью обладает активностью γ-D-глутамил-L-триптофан (Бестим, от BE(neficial) ST(imulator) of IM(munity)).

Установлено, что [³H]Бестим с высоким сродством связывается с перитонеальными макрофагами и тимоцитами мыши, а также плазматическими мембранами, выделенным из этих клеток. В концентрациях 10^-10–10^-6М Бестим снижает аденилатциклазную активность мембран макрофагов и тимоцитов мыши.

Фармакологическое действие препарата определяется усилением дифференцировки и пролиферации предшественников Т-лимфоцитов. При действии in vitro Бестим усиливает продукцию ИЛ-2 и экспрессию его рецептора лимфоцитами, усиливает их пролиферативную активность. В модельных системах in vivo Бестим стимулирует Т-клеточное звено иммунитета, активирует макрофаги и естественные киллерные клетки. Установлено, что иммуномодулирующее действие Бестима идентично как при парентеральном, так и пероральном применении.

В модели экспериментального генерализованного туберкулеза у мышей Бестим обладает противоинфекционным и иммуномодулирующим действием, усиливая антиген-специфический иммунный ответ с преимущественной активацией Т-хелперов 1 типа. В модели аллергической бронхиальной астмы показано ингибирующее действие препарата на местные и системные проявления патологического процесса.

Иммуномодулирующее действие Бестима изучено при его применении в комплексной терапии пациентов с гнойно-септическими процессами, больных распространенными и локализованными формами мочеполового хламидиоза и инфильтративным туберкулезом легких. Динамика клинико-иммунологических показателей после курса препарата свидетельствует о стимуляции антиген-специфического иммунного ответа, функциональной активности Т-клеток, преимущественной активации Т-хелперов 1 типа.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. 
   γ-D-гутамил-L-триптофан (Бестим) обладает дозозависимым, невидоспецифичным иммуномодулирующим действием и наиболее активен среди γ-глутамил содержащих пептидов.
   
2. 
   Биологическая активность Бестима обусловлена высокоаффинным селективным взаимодействием со специфическими сайтами на мембранах макрофагов и тимоцитов.
   
3. 
   Биодоступность препарата при внутрибрюшинном и пероральном путях введения одинакова и составляет 55-60%.
   
4. 
   Механизм иммуностимулирующего действия Бестима связан с увеличением дифференцировки и преимущественным усилением функциональной активности Т-хелперов 1 типа.
   
5. 
   Введение Бестима приводит к усилению антиген-специфического иммунного ответа.
   
6. 
   Бестим обладает противоинфекционным и иммуномодулирующим действием в модели экспериментального генерализованного туберкулеза.
   
7. 
   В модели экспериментальной аллергической бронхиальной астмы Бестим снижает титры аллерген-специфических IgE и тканевые проявления аллергического иммунного ответа.
   
8. 
   Бестим эффективен при комбинированном лечении больных со вторичными иммунодефицитами различной этиологии, причем положительная клиническая динамика сопровождается иммуномодулирующим действием препарата.
   

Практическая значимость:

Практическая ценность работы заключается в установлении закономерностей структурно-функциональной организации нового семейства иммуномодулирующих соединений – γ-глутамил содержащих пептидов; дизайне структуры нового иммуномодулирующего соединения и создании на ее основе нового отечественного лекарственного препарата Бестим; демонстрации иммуномодулирующего эффекта Бестима, связанного с преимущественной активацией Т-хелперов первого типа и нормализацией баланса между Тх-1 и Тх-2, при парентеральном и пероральном применении; установлении механизмов его действия; определении оптимальных схем использования препарата; изучении эффективности включения иммуномодулирующей терапии с помощью препарата Бестим в стандартные схемы лечения инфекционных заболеваний.

Результаты, полученные в ходе выполнения исследования, использованы для регистрации и получения разрешения на выпуск в обращение препарата «Бестим, 100 мкг, лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения» (рег.уд. PN03335/03 от 29.12.2006). В настоящее время препарат выпускается ФГУП Гос.НИИ ОЧБ ФМБА России.

Личный вклад автора в проведенные исследования:

Работа выполнена лично автором на базе ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России. Вклад автора состоит в организации и проведении экспериментальных исследований, теоретическом обобщении и интерпретации полученных результатов. Ряд исследований выполнен совместно с сотрудниками ГосНИИ ОЧБ к.х.н. Смирновой М.П., к.х.н. Колодкиным Н.И., Шпенем В.М., к.х.н. Прусаковым А.Н., Афониной И.В., Трофимовым А.В., Родиным С.В., к.м.н. Пигаревой Н.В., к.м.н. Петровым А.В., Демьяновым А.В., Боковановым В.Е. и другими. Работы по радиорецепторному анализу Бестима проводились на базе Филиала института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Пущино) под руководством д.б.н. Наволоцкой Е.В. Работы по изучению влияния Бестима в модели экспериментального генерализованного туберкулезного процесса проводились на базе Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи под руководством д.м.н. Виноградовой Т.И. Обработка результатов фармакокинетических исследований проведена совместно с сотрудником Института токсикологии ФМБА России (Санкт-Петербург) Трефиловым В.В. Клинические испытания Бестима в терапии хламидиоза проведены на базе клиники кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской Академии им. С.М.Кирова МО России (Санкт-Петербург) под руководством д.м.н. Позняка А.Л., в терапии туберкулеза легких – на базе клиники Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии под руководством д.м.н. Скворцовой Л.А., в терапии гнойно-воспалительных хирургических заболеваний – на базе клинической больницы №83 ФУ МБ и ЭП при МЗ РФ (Москва) под руководством к.м.н. Захарченкова В.А. По всем полученным совместно результатам имеются совместные публикации. Соискатель приносит своим соавторам искреннюю благодарность.

Апробация работы:

Основные результаты исследований и положения диссертационной работы были представлены и доложены на: 25 Европейском пептидном симпозиуме (Будапешт, Венгрия, 1998), 16 Американском пептидном симпозиуме (Миннеаполис, США, 1999), 17 Международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Сидней, Австралия, 2000), 26 Европейском пептидном симпозиуме (Монпелье, Франция, 2000), 42 Междисциплинарной конференции по антимикробным агентам и химиотерапии (Сан-Диего, США, 2002), 27 Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), 12 Международном иммунологическом конгрессе (Монреаль, Канада, 2004), VIII и Х Всероссийском научном форуме им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2006), XIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта, 2005), 29 Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск, Польша, 2006), 6-ой ежегодной Конференции Американского Общества Клинических Иммунологов (Сан Франциско, 2006), 13 Международном иммунологическом конгрессе (Рио де Жанейро, Бразилия, 2007).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 44 научные работы, в их числе 13 российских и международных патентов и 10 работ, изданных в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, включая 86 таблиц и 32 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 8 глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 355 работ (40 отечественных и 315 зарубежных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Химический синтез пептидов. γ-глутамил содержащие дипептиды и их аналоги с аспарагиновой кислотой синтезированы методами классического пептидного синтеза в растворе или твердофазным способом. Все полученные соединения были индивидуальны по данными тонкослойной хроматографии, их чистота по данным ОФ ВЭЖХ была не менее 95%, аминокислотный состав соответствовал теоретическому (±10%), расчетные молекулярные массы совпали с экспериментально определенными (±0.5%).
Экспериментальные животные и введение препаратов. В работе были использованы лабораторные мыши линий CBA, Balb/c, C57Bl/6 и F1 (CBA×C57Bl/6) весом 18-20 г и белые беспородные крысы весом 160-180 г (питомник лабораторных животных Рапполово). Кроме того, использовались также SPF мыши линии Balb/c и аутбредные SPF мыши Swiss Webster (питомник лабораторных животных Пущино). Изучаемые соединения разводили в стерильном физиологическом растворе (ФР) и вводили внутрибрюшинно (в/б) в различных дозах в объеме 200 мкл. Для перорального (п/о) введения препараты разводили в дистиллированной воде и вводили с помощью желудочного зонда в объеме 200 мкл. Контрольным животным вводили ФР в/б или дистиллированную воду п/о в тех же объемах.
Методы оценки иммуномодулирующей активности препаратов. Уровень экспрессии маркеров дифференцировки на клетках костного мозга (CD90.1, CD117), тимуса (CD4, CD8) и селезенки (CD3, CD4, CD8) мышей и лимфоцитах периферической крови человека (CD16, CD25) определяли с помощью комплемент-зависимого лимфоцитотоксического теста с соответствующими моноклональными антителами (Terasaki et.al., 1972) или с помощью проточной цитофлюориметрии с флюоресцеин- или фикоэритрин-меченными МАТ на цитофлюориметре EPICS XL (Beckman Coulter). Пролиферативную активность тимоцитов и спленоцитов оценивали по включению [³H]-тимидина в реакции бласттрансформации лимфоцитов после стимуляции митогенами или специфическими антигенами. Спонтанную или митоген-(антиген)стимулированную продукцию цитокинов в супернатантах культур клеток или цельной крови оценивали с помощью соответствующих ИФА тест-систем. Активность интерлейкина-2 (ИЛ-2) определяли с помощью ИЛ-2 зависимой линии CTLL-2. Функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов определяли в тесте люминолзависимой хемолюминисценции. Для изучения хемотактической активности использовали метод миграции лейкоцитов под агарозой (Nelson et al., 1975). Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали по отношению к предварительно опсонизированным пекарским дрожжам. В качестве мишеней для естественных киллеров использовали клетки мышиной В-клеточной линии Yac-1 (банк клеточных культур Института цитологии РАН), меченные [³Н]-уридином. В качестве моделей иммунного ответа in vivo использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа, иммунизацию растворимым (овальбумином) и корпускулярным (эритроциты барана) антигенами.
Фармакокинетические исследования. Содержание Бестима в системном кровотоке мышей после внутривенного, внутрибрюшинного или перорального введения определяли в динамике, используя разработанный нами набор «ИФА-Бестим» на основе твердофазного конкурентного иммуно-ферментного анализа. В наборе использованы моноспецифические поликлональные антитела кролика к Бестиму, конъюгаты Бестим-биотин и авидин-пероксидаза.

Cвязывание [³H]Бестима с перитонеальными макрофагами и тимоцитами мыши. Взаимодействие Бестима с макрофагами и тимоцитами мыши, а также с плазматическими мембранами этих клеток исследовали с помощью радиорецепторного анализа, используя [³Н]-Бестим, полученный методом твердофазного радиоизотопного обмена, в качестве лиганда. Активность аденилатциклазы определяли с помощью [³²P]ATФ по методу (Saltarelli et al., 1985).

Модель экспериментального туберкулезного процесса. Экспериментальный генерализованный туберкулез (ТБ) вызывали инокуляцией в хвостовую латеральную вену второй генерации 3-х недельной культуры M. bovis штамм 8 (0,1 мг влажной культуры на мышь) или M. tuberculosis Erdman (110⁷ микробных тел на мышь). Начиная с седьмого дня после инокуляции инфекта, каждые два дня проводились пробные вскрытия мышей из группы контроля заражения с визуальной оценкой легких с целью выявления фокусов специфического воспаления. Лечение начинали при появлении в легких множественных субмилиарных или единичных милиарных очагов. Мышей всех опытных групп лечили противотуберкулезными препаратами в средних терапевтических дозах, животных, получавших иммунотерапию, – дополнительно Бестимом в течение 5 или 10 дней, начиная с первого дня лечения противотуберкулезными препаратами. Бестим вводили как в/б, так и п/о. Результаты лечения регистрировали на 5, 12, 19 и 33 дни от начала лечения. Сравнение проводили с зараженными нелечеными животными (контроль заражения) и с группой контроля лечения, получавшей только противотуберкулезные препараты (контроль лечения). Тяжесть течения ТБ процесса оценивали по макроскопическому исследованию легких и селезенки, рассчитывая индекс поражения (ИП) легких и коэффициенты массы (КМ) селезенки и легких, по высеваемости микобактерий из селезенки и легких, выражая в колониеобразующих единицах (КОЕ), по гистологическому изучению легких. Параллельно оценивали субпопуляционный состав тимуса и селезенки, митоген- и антиген-специфическую пролиферацию спленоцитов и продукцию цитокинов, уровень цитокинов в сыворотке крови.
Модель иммунного ответа аллергического типа. Использовали модель, описанную в (Kato et al., 1999). В качестве аллергена для двукратной иммунизации и трехкратного аэрозольного бустирования использовали овальбумин (OVA). Бестим вводили после повторной иммунизации перед первой экспозицией аэрозолю в течение 5 дней в дозе 0,1 и 1 мкг/кг. При оценке тяжести экспериментальной аллергической астмы исследовали клеточность и цитологический состав бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ), титры анти-OVA IgE в БАЛ и сыворотке и проводили гистологическмй анализ тканей легких.
Клинико-иммунологическая характеристика Бестима. Исследование проводилось на клиническом материале, полученном от больных, которые участвовали в клинических исследованиях эффективности и безопасности применения Бестима в сочетанной терапии гнойно-воспалительных хирургических заболеваний, хламидиоза и инфильтративного диссиминированного туберкулеза легких в рамках 2 фазы клинических испытаний. Бестим применяли в виде курса из 5 или 10 ежедневных, или проводимых через один день инъекций по 100 мкг. Во всех случаях иммунотерапия Бестимом проводилась на фоне стандартной этиотропной терапии соответствующих заболеваний. При хламидиозе и туберкулезе химиотерапия назначалась с учетом устойчивости возбудителя бактериостатическим препаратам. Периферическую кровь анализировали до начала терапии, по ее окончании и через 3 месяца после окончания курсов этиотропной терапии. Оценивали общее количество лимфоцитов, процентное и абсолютное число зрелых CD3⁺ Т-лимфоцитов, CD4⁺ и CD8⁺ клеток, В-лимфоцитов, ответ Т-лимфоцитов на ФГА или специфический антиген в РБТЛ, экспрессию «активационных маркеров» на Т-лимфоцитах, уровни спонтанной и индуцированной продукции цитокинов, уровни неспецифических иммуноглобулинов, циркулирующих в крови иммунных комплексов, бактерицидную и фагоцитарную активность нейтрофилов.
Статистическая обработка результатов. Выполнялась стандартными методами с помощью t критерия Стьюдента, критериев Вилкоксона и Манна-Уитни, критерия χ², точного критерия Фишера. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ γ-ГЛУТАМИЛ СОДЕРЖАЩИХ ДИПЕПТИДОВ

γ-глутамил содержащие дипептиды и их аналоги получены методами химического синтеза. Все соединения были гомогенны по данным аналитической ОФ ВЭЖХ, имели аминокислотный состав и молекулярную массу, соответствовавшие теоретическим. Биологическую активность аналогов оценивали в тестах in vitro изменению экспрессии Thy-1 (CD90.1) антигена на пре-Т-клетках костного мозга мыши, пролиферации клеток тимуса мыши, стимулированных субоптимальной дозой лектинов, и продукции ИЛ-2 митоген-стимулированными спленоцитами мыши.

Сравнительное изучение биологической активности α-; β- и γ-пептидов показало, что замена α- пептидной связи на γ-связь приводит к значительному усилению иммуностимулирующей активности соединений. Так, γ-L-Glu-L-Trp стимулировал экспрессию Thy-1 антигена в более широком диапазоне концентраций (0,01 - 100 мкг/мл), и его активность была более выражена, чем у соответствующего α-соединения. Принимая во внимание, что γ-пептид был значительно более активным, в качестве соединения-лидера был выбран γ-L-Glu-L-Trp, и во всех последующих полученных аналогах мы сохранили этот тип соединения двух аминокислотных остатков. Исследование структурно-функциональной организации γ-дипептидов проведено методом заместительной модификации. Список синтезированных и исследованных аналогов приведен в таблице 1.

Таблица 1

Структура синтезированных и исследованных соединений

Химическое название	Химическая структура	Химическое название	Химическая структура
α-L-глутамил- L-триптофан		g-L-глутамил- L-тирозин
g-L-глутамил- L-триптофан		g-L-глутамил- L-фенилаланин
b-L-аспартил- L-триптофан		g-L-глутамил- L-гистидин
α-L-аспартил- L-триптофан		g-L-глутамил- L-лейцин
b-D-аспартил- L-триптофан		g-L-глутамил- L-пролин
α-D-аспартил- L-триптофан		g-L-глутамил- Nin-формил- L-триптофан
g-L-глутамил- L-триптофан		N-метил-g-D-глутамил- L-триптофан
g-D-глутамил- L-триптофан		N-ацетил-g-D-глутамил- L-триптофан
g-L-глутамил- D-триптофан		γ-D-глутамил- L-триптамин
g-D-глутамил- D-триптофан		g-D-глутамил- L-триптофил-амид

Суммировав результаты проведенных исследований, мы сделали следующее заключение о структурно-функциональной организации нового семейства иммуномодулирующих соединений: аминокислоты должны быть соединены γ- или β-амидной связью; в первом положении глутаминовая кислота предпочтительна по сравнению с аспарагиновой кислотой; аминокислота в первом положении должна быть в D-конфигурации; во втором положении должен находиться остаток триптофана с немодифицированным индольным кольцом; N- и С-концы молекулы должны быть немодифицированными.

Структуру нового семейства иммуномодуляторов можно описать общей формулой:
R – NH – CH - (CH­₂)­_n - C - X , где n=1,2;

ï çç

СООН O

R: H, низший ацил или низший алкил;

X: ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное.

Для дальнейшего расширенного изучения был выбран g-D-глутамил-L-триптофан, как наиболее активный из исследованных представителей семейства γ-глутамил содержащих дипептидов (рис.1). Две структурные особенности этого дипептида - гамма связь между аминокислотными остатками и стереоконфигурация аминокислоты в первом положении - обуславливают его устойчивость к действию протеолитических ферментов, а также предопределяют возможность перорального применения.

γ

α

Рис.1. Структурная формула g-D-глутамил-L-триптофана.
Бестим - это натриевая соль g-D-глутамил-L-триптофана, или согласно международной номенклатуре IUPAC натриевая соль 2-амино-4-[[1-кабокси-2-(1Н-индол-3-ил)этил]карбомоил] бутановой кислоты. Брутто формула этого соединения С₁₆Н₁₈N₃O₅Na, молекулярная масса - 355,3. С органолептической точки зрения это бесцветный аморфный порошок без запаха. Разработан метод крупномасштабного классического синтеза Бестима и аналитические методики, совокупность которых позволяет подтвердить структуру полученного соединения и оценить степень его чистоты. На основе этих данных, а также изучения стабильности препарата при хранении, была разработана и утверждена Фармакопейная статья ФСП-42-0303140301 на субстанцию препарата Бестим. Оценка качества препарата производится по следующим показателям: растворимость образцов; прозрачность, цветность, рН, удельное вращение и удельное поглощение их растворов; содержание воды, наличие посторонних примесей и остаточных органических растворителей; микробиологическая чистота и пирогенность.

следующая страница>