На правах рукописи


Павлова Светлана Ивановна
иммуносупрессивные и противоопухолевыЕ
фармакодинамические эффекты
флавоноидов корней солодки

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология


Автореферат
диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

МОСКВА • 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ и Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздравсоцразвития РФ

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Иван Генрихович Козлов

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, профессор Николай Львович Шимановский

доктор медицинских наук, профессор Даниил Борисович Утешев
доктор медицинских наук Алексей Викторович Тутельян
Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится «19» марта 2012 года в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ им. Н.И. Пирогова по адресу: 117997 г. Москва, ул. Островитянова, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ по адресу: 117997 г. Москва, ул. Островитянова, д.1.
Автореферат разослан «14» декабря 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Н.Г. Потешкина
введение

Актуальность проблемы

За последние десятилетия в медицине произошел переход исследований на молекулярный уровень, и появились более детальные сведения о патогенезе многих заболеваний, существенно изменившие представления о фармакотерапевтических подходах к их лечению [Козлов И.Г., 2006]. Важнейшим достижением этого этапа исследований стало выявление молекул, которые играют ведущую роль в возникновении или прогрессировании патологического процесса. Это сформировало концепцию мишень-направленной терапии и обосновало актуальность разработки инновационных «таргетных» препаратов, способных селективно корригировать ключевые звенья патогенеза.

В связи с завершением интенсивных исследований в биотехнологии и иммунологии, а также молекулярной биологии и генетике рака, во второй половине XX века были разработаны и внедрены принципиально новые иммуносупрессанты и противоопухолевые препараты. Примерами таковых лекарственных средств являются моноклональных антитела и низкомолекулярные ингибиторы сигнальных молекул (циклоспорин, макролидные антибиотики, «тинибы») [Кренски А. с соавт., 2006]. Механизмы действия таких лекарственных средств основаны не на неспецифическом уничтожении активно пролиферирующих клеток, а целенаправленной элиминации/угнетении опухолевых или иммунокомпетентных клеток идентичной природы.

Перспективы развития данных областей фармакотерапии тесно связаны с открытием более специфичных мишеней. Так, несомненно, актуальным является изыскание высоко избирательных иммуносупрессантов, не оказывающих влияния на клетки, которые не участвуют в иммунном ответе в момент терапевтического использования препаратов. Мишенью для этой подгруппы может являться запущенный в активированных лимфоцитах конкретный регуляторный или эффекторный механизм [Козлов И.Г., 2006]. Идеальный иммуносупрессант должен обладать избирательным действием на отдельные субпопуляции лимфоцитов, не вызывая повреждения как других клеток организма, так и клонов лимфоцитов, осуществляющих реакции противоинфекционного и противоопухолевого иммунитета. На место подобных иммуносупрессантов на сегодняшний день претендуют так называемые «регуляторы/переключатели» иммунного ответа.

Безусловно, «таргетные» лекарственные средства кардинально изменили стратегию фармакотерапии, продемонстрировав высочайшую эффективность в отношении отдельных заболеваний (например, некоторых онкогематологических). Однако довольно часто эффект такого препарата оказывается ниже ожидаемого, а резистентность к нему развивается так же, как и при стандартной терапии. Таким образом, в большинстве случаев современные средства служат лишь дополнением к стандартным схемам лечения, в которых классические «нетаргетные» противоопухолевые и иммуносупрессивные препараты все еще занимают лидирующее положение.

С точки зрения разработки новых лекарственных препаратов, большой интерес представляет класс полифенольных соединений растительного происхождения, поскольку многие флавоноиды демонстрируют разнообразные биологические эффекты на организменном уровне [Donfack J.H. et al., 2010; Lee J.Y. et al., 2009; Lu J. et al., 2011; Nishizuka T. et al., 2011]. Изучение их механизмов действия на клеточном и молекулярном уровнях показывает, что некоторые флавоноиды способны селективно влиять на активность протеинкиназ [Atluru D. et al., 1991; Akiyama T. et al., 1987; Trevillyan J.M. et al., 1990], а, как следствие, и на активацию сигнальных путей в клетках млекопитающих [Chen C.C. et al., 2004; Funakoshi-Tago M. et al., 2008; Hirao K. et al., 2010]. На наш взгляд, на этом механизме действия может базироваться не только противоопухолевый, но и селективный иммуносупрессивный эффекты флавоноидов. Это требует экспериментального обоснования возможности применения полифенольных соединений в клинической иммунологии и онкологии. В связи с чем представляется актуальным исследования иммунотропной и противоопухолевой эффективности веществ флавоноидной структуры, а также прицельное изучение селективности их влияния на различные звенья (адаптивное и врожденное) иммунной системы.

Цель и задачи

Цель: экспериментальное обоснование перспективы создания новых иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств на основе соединений флавоноидной структуры, выделенных из экстракта корней солодки.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. 
   Отработать технологию выделения и стандартизации биологически активной фракции флавоноидов корней солодки (ФКС).
   
2. 
   Оценить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) и функциональную активность (продукция цитокинов) клеток адаптивного иммунитета в моделях активации T- и B-лимфоцитов in vitro.
   
3. 
   Исследовать фармакологическую эффективность ФКС в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов T- и B-клеточной направленности (контактной чувствительности, индуцированной 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ); реакции трансплантат против хозяина; овальбумин-индуцированной бронхиальной астме).
   
4. 
   Изучить молекулярные и клеточные механизмы иммунотропных эффектов ФКС, используя модель ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности у мышей.
   
5. 
   Оценить влияние ФКС на некоторые функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета in vitro: экспрессию поверхностных маркеров активации, продукцию активных форм кислорода, а также поглотительную и бактерицидную активность фагоцитов.
   
6. 
   Провести оценку влияния ФКС на некоторые показатели врожденного иммунитета in vivo в экспериментальных моделях пептон-индуцированной миграции фагоцитов в брюшную полость и острой стафилококковой инфекции у мышей.
   
7. 
   Изучить влияние ФКС на ростовые характеристики (пролиферация, апоптоз) клеток различных опухолевых линий и оценить прямую цитотоксичность флавоноидов солодки по отношению к опухолевым клеткам in vitro.
   
8. 
   Провести оценку эффективности ФКС в моно- и комбинированной с циклофосфамидом экспериментальной терапии в модели перевиваемого лимфолейкоза P388 у мышей.
   
9. 
   Наметить пути выделения фармакологически активных соединений суммарной фракции ФКС.
   

Основные положения, выносимые на защиту

1. 
   ФКС подавляют пролиферацию активированных T- и B-лимфоцитов in vitro. Возможными механизмами отмены активации лимфоцитов являются как прямое антипролиферативное действие, так и изменение баланса T-хелперных цитокинов, но не индукция апоптоза.
   
2. 
   ФКС проявляют иммуносупрессивные эффекты в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов T- и B-клеточной направленности у мышей: ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуцированной бронхиальной астмы.
   
3. 
   Механизмами иммуносупрессорного действия ФКС in vivo являются: ингибирование пролиферации лимфоцитов; изменение цитокинового баланса, свидетельствующее о «переключении» дифференцировки субпопуляций T-лимфоцитов-хелперов при индукции иммунного ответа; а также непрямая отрицательная регуляция функций зрелых T-лимфоцитов-эффекторов.
   
4. 
   ФКС практически полностью отменяя активацию клеток адаптивного иммунного ответа, незначимо изменяют функциональные показатели клеток-эффекторов врожденного иммунитета: экспрессию активационных маркеров, миграционную, поглотительную и микробицидную функцию фагоцитов.
   
5. 
   ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в культуре опухолевых клеток различного гистогенеза, а также повышают эффективность циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии.
   

Научная новизна исследования

В работе был отработан и модифицирован метод выделения фармакологически активных полифенольных соединений из экстракта корней солодки. Для повышения репрезентативности исследований многокомпонентного препарата каждую новую серию выделенных флавоноидов в дополнение к общеизвестному фотохимическому методу (цветная реакция с галловой кислотой) предложено стандартизовать в биологической системе (по выраженности угнетения пролиферации опухолевой линии).

Используя стандартизированный препарат флавоноиднов корней солодки, впервые было проведено исследование его фармакодинамических эффектов в моделях, рекомендованных для доклинического изучения новых фармакологических веществ с иммунотропной и противоопухолевой активностью.

Впервые был продемонстрирован антипролиферативный эффект ФКС in vitro в отношении митоген-активированных человеческих и мышиных Т- и B-лимфоцитов. Было доказано, что антипролиферативный эффект ФКС не связан с индукцией апоптоза. Одним из механизмов антипролиферативного эффекта является модулирующее влияние ФКС на продукцию цитокинов: подавление секреции ИЛ-2 и ИФНγ, и повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-17.

Впервые было показано, что ФКС при парентеральном введении проявляют фармакологическую эффективность в экспериментальных моделях иммунопатологических процессов T- и B-клеточной направленности у мышей: подавляют характерные проявления ДНФБ-индуцированной контактной чувствительности, реакции трансплантат против хозяина и овальбумин-индуцированной бронхиальной астмы.

Впервые было продемонстрировано, что внутривенное введение ФКС на ранних сроках после ДНФБ-сенсибилизации приводит как подавлению пролиферативного ответа, так и к снижению абсолютного числа клеток регионарных лимфоузлов. Это коррелирует с изменением цитокинового баланса: наблюдается уменьшение секреции ИЛ-2, ИФНγ и ИЛ-4 и увеличение продукции ИЛ-10 и ИЛ-17 клетками регионарных лимфоузлов, что может свидетельствовать о способности флавоноидов солодки переключать Th1/Th2 иммунные ответы в процессе развития контактной чувствительности на формирование Th17-лимфоцитов.

Впервые показано, что на поздних сроках после ДНФБ-сенси­билизации, обработка флавоноидами солодки суммарной фракции спленоцитов, а также выделенных из нее с помощью иммуномагнитной сепарации T-клеток, приводит к блокаде адоптивного переноса реакции контактной чувствительности несенсибилизированным сингенным мышам-реципиентам. Впервые установлено, что блокирующий эффект ФКС не наблюдается в случае обработки CD8⁺ лимфоцитов-эффекторов, выделенных из спленоцитов сенсибилизированных животных. Воспроизведение блокирующего эффекта ФКС, происходит только после обработки CD4⁺-популяции (не проявляют свойств эффекторов контактной чувствительности) и последующего ее адоптивного переноса совместно с CD8⁺-эффекторами несенсибилизированным мышам-реципиентам.

Впервые показано, что внутривенное введение флавоноидов солодки мышам с овальбумин-индуцированной бронхиальной астмой на стадиях сенсибилизации снижает уровень сывороточных антиген-специфических IgE и IgG1, а также изменяет спектр синтезируемых спленоцитами цитокинов (уменьшение секреции ИЛ-2, и увеличение продукции ИФНγ и ИЛ-17). Это может свидетельствовать о способности ФКС переключать Th2 иммунный ответ в процессе сенсибилизации к овальбумину на формирование антагонистичных популяций Th1/Th17-лимфоцитов.

Кроме того, продемонстрировано, что введение препарата ФКС на стадии провокации бронхиальной астмы интрафарингеальным введением овальбумина мышам, приводит к значимому уменьшению воспалительной инфильтрации бронхов и уменьшению эозинофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости.

Комплексная оценка влияния ФКС на функции фагоцитов показала, что при использовании их в концентрации (20 мкг/мл), практически отменяющей пролиферацию активированных T- и B-лимфоцитов, не происходит подавления активации, а также миграционной, поглотительной и бактерицидной активности нейтрофилов и моноцитов/макрофагов. Наряду с этим внутрибрюшинное введение ФКС повышает резистентность мышей к острой стафилококковой инфекции. Это позволяет говорить о возможности селективного иммуносупрессивного эффекта ФКС: ингибировании адаптивного звена иммунной системы, без выраженного подавления функций клеток-эффекторов врожденного иммунитета.

С использованием различных опухолевых клеточных культур продемонстрировано, что ФКС подавляют пролиферацию и индуцируют апоптоз в опухолевых клетках различного видового и гистологического происхождения, а также повышают эффективность алкилирующего цитостатика циклофосфамида в экспериментальной противоопухолевой терапии перевиваемого лимфолейкоза P388 у мышей.

На основании сравнительного химического и фармакологического анализа в ходе разделения суммарного препарата ФКС определена наиболее активная фракция флавоноидов солодки.

Практическая значимость работы

В процессе работы был отработан и модифицирован метод, позволяющий без значительных трудовых затрат, получать биологически активные полифенольные соединения из экстракта корней солодки, а также подобран комплекс моделей и методов, позволяющих оценивать иммунотропную и противоопухолевую активность и эффективность новых фармакологических агентов.

Совокупность полученных в работе данных углубляет фундаментальные представления о механизмах развития иммунного ответа и патогенезе иммунопатологических процессов, а также дополняют сведения о ме­ханизмах фармакологического действия биологически активных веществ флавоноидной структуры.

Доказанное в ходе выполнения работы отсутствие прямой цитотоксичности, возможность регуляции иммунного ответа, а также различное влияние препарата ФКС на функции иммунокомпетентных клеток, участвующих в механизмах врожденного и адаптивного звеньев иммунитета открывает возможность селективной фармакологической иммуносупрессии.

Выявленные в исследованиях принципиально новые механизмы иммунотропного и противоопухолевого действия ФКС, низкомолекулярная структура флавоноидов (что определяет возможность их химического синтеза и направленной модификации), а также данные, полученные в ходе анализа отдельных фракций, являются достаточным основанием для рассмотрения флавоноидов корней солодки как перспективной основы для разработки новых иммуносупрессивных и противоопухолевых лекарственных средств.

Внедрение результатов исследования

Результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ. Разработанные в диссертации модели и методы используются в экспериментальной работе кафедры и отдела иммунологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития РФ, отдела молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздравсоцразвития РФ.

Публикации и апробация работы

Материалы диссертации были представлены на III Съезде фармакологов России «Фармакология – практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008); Объединенном Иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008); Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии (Казань, 2009); 2^nd European Congress of Immunology «Immunity for Life, Immunology for Health» (Берлин, Германия, 2009); III World Asthma and COPD Forum and the World Forum of Pediatrics (Дубаи, ОАЭ, 2010); IV World Asthma and COPD Forum, XVI International Congress on Rehabilitation in Medicine and Immunorehabilitation (Париж, Франция, 2011); 30^th Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology (Стамбул, Турция, 2011); 11^th Annual Meeting of the Federation of Clinical Immunology Societies (Вашингтон, США, 2011); III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Достижения молекулярной медицины как основа разработки инновационных лекарственных средств» (Волгоград, 2011).

Работа апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии педиатрического факультета, кафедры иммунологии МБФ и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работы, в том числе статей в изданиях рекомендованных ВАК РФ – 22.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 253 страницах машинописного текста в виде монографии и состоит из введения, главы, посвященной материалам и методам исследований, а также 6 глав, каждая из которых включает обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение. В конце диссертации представлены заключение, выводы и библиографический указатель, включающий 314 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 56 рисунками и содержит 16 таблиц.

Материалы и методы исследования

Объекты исследования

Препарат флавоноидов корней солодки: выделение, верификация,
анализ и стандартизация. Флавоноиды выделяли из сухого коммерческого экстракта корней солодки (ООО «Хармс», С.-Петербург) методом спиртовой экстракции с последующей очисткой с применением адсорбционной колоночной хроматографии на полиамидном сорбенте (Polyamide 6; Fluka, Германия) [Карташова Г.С. с соавт., 1997; Корулькин Д.Ю. с соавт., 2007; Левданский В.А. с соавт., 2006]. Полифенольный состав выделенного препарата ФКС доказывали проведением анализа спектров поглощения в ультрафиолетовом (УФ) и инфракрасном (ИК) диапазонах длин волн.

Фракционирование ФКС проводили методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием хроматографической системы Agilent 1200 (Agilent Technologies, США) со спектрофотометрическим детектором на диодной матрице, автосамплером и программным обеспечением обработки данных при длине волны 254,4 нм. Система снабжалась колонкой J'sphere ODS-M80 (4,6×250) мм (YMC Co. Ltd, Германия). В качестве подвижной фазы использовали смесь растворителей ацетонитрил-вода (23:77 %об.), скорость потока 1 мл/мин.

Препарат ФКС стандартизировали фотометрическим методом Folin-Ciolalteu, используя в качестве стандарта галловую кислоту (Acros Organics, Германия) [Vermerris W. et al., 2006]. Дополнительно проводилась биологическая стандартизация каждой серии выделенного препарата с использованием опухолевой линии U-937. В экспериментах использовали препарат ФКС, который в концентрации 10 мкг/мл (в пересчете на галловую кислоту) ингибировал пролиферацию опухолевых клеток линии U-937 до уровня 44,0±2,4% от контрольного значения.

Лабораторным животным препарат вводили парэнтерально в изотоническом растворе натрия хлорида с 5% содержанием высокоочищенного этанола, однократная доза ФКС составляла 10 мг/кг. Мыши контрольной группы получали соответствующие объемы растворителя. В опытах in vitro в культуру клеток вносили ФКС в диапазоне концентраций 0,1-20 мкг/мл, так, чтобы финальная концентрация этанола не превышала 1%. В контрольные лунки добавляли соответствующие объемы этанола.

Лабораторные животные. Эксперименты проводили на 8-10 недельных (масса 18-22 г.) мышах линий Balb/c, СВА, C57Bl/6, DBA/2, а также гибридах BDF1 (C57Bl/6×DBA/2)F1, полученных из питомника РАМН (Крюково, Московская область).

Клетки периферической крови человека. Выделение лейкомассы [Пинегин Б.В. с соавт., 2001] или мононуклеарных клеток (МНК) [Boyum A., 1968] из периферической крови практически здоровых добровольцев осуществляли в стерильных условиях при температуре таящего льда. Клетки ресуспензировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (полная среда). Количество клеток подсчитывали в камере Горяева по стандартной методике. Для стимуляции Т- и В-лимфоцитов использовали оптимальные концентрации митогенов: фитогемагглютинина (ФГА), анти-CD3 моноклональных антител (анти-CD3) и поквид-митогена (PWM).

Клетки лимфоидных органов мышей. Выделение МНК из селезенки и лимфоузлов мышей производили стандартными методами щадящей гомогенизации лимфоидных органов с удалением эритроцитарной фракции путем осмотического лизиса. Клетки культивировали в полной среде RPMI-1640. Для стимуляции Т- и В-лимфоцитов использовали оптимальные концентрации митогенов: конконавалина А (КонА) и липополисахарида (ЛПС) соответственно. Иммуномагнитную сепарацию субпопуляций лимфоцитов проводили с использованием метода негативной селекции и набора реактивов Dynal Mouse Negative Isolation Kit (Invitrogen Dynal AS, Норвегия).

Клетки бронхоальвеолярной лаважной жидкости мышей. Бронхоальвеолярный лаваж у мышей осуществляли, проводя пункцию и канюлирование трахеи. Легкие промывали стерильным раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Бронхоальвеолярная лаважная жидкость (БАЛ) использовалась для общего и дифференциального подсчета клеток в цитологических препаратах, фиксацию и окрашивание которых осуществляли по технологии, описанной в наборе красителей Диахим-Дифф-Квик (НПФ «Абрис+», Россия). Долю (%) эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов подсчитывали, опираясь на стандартные морфологические критерии.

Клетки опухолевых культур и штаммов. В работе использованы линии опухолевых клеток различного видового (мыши и человека) и гистологического происхождения (A-431, HT-29, U-373, GL-6, U-937, RAW 264.7, L-929), полученные из коллекции банков глубокозамороженных клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева. Для поддержания экспоненциального роста культуру пассировали каждые 3-4 дня. Опухолевый штамм Р388 поддерживали пассированием in vivo на мышах линии DBA/2 [Трещалина Е.М. с соавт., 2005]. В опытах использованы 2-й – 8-й пассажи после размораживания клеток P388.

Бактериальные штаммы. В работе использован штамм Staph­ylococcus aureus (S. aureus) J49 (ATCC 25923), полученный из коллекции музея живых культур ФГБУ ГИСК им Л.А. Тарасевича, а также GFP (Green Fluorescent Protein)-экспрессирующие штаммы Escherichia coli XL-1 Blue (E. coli; трансфицирован на кафедре микробиологии и вирусологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова) и S. aureus RN6390 super-GFP (любезно предоставлен профессором William M. Nauseef, Университет Айовы, США). Бактерии растили в питательном бульоне Brain-Heart Infusion (Gibco, США). Для экспериментальных целей использовали культуру, находящуюся в средней log-фазе, которую отмывали от питательной среды раствором Хенкса. Расчет количества микробных тел производили исходя из соотношения: 1 единица оптической плотности – 8,5·10⁸ микобных тел/мл при длине волны 540 нм.

Методы и модели

Оценка пролиферации клеток. Для оценки пролиферации клетки засевали в 96-луночный планшет для культур клеток и культивировали в полной среде. В процессе культивирования к опухолевым клеткам или митоген-активированным МНК добаляли ³Н-тимидин и тестируемый агент. К клеткам опухолевых линий, которые характеризовались низкими цифрами включения ³H-тимидина, перед внесением радиоактивной метки добавляли АТФ. Пролиферацию оценивали, измеряя радиоактивность ³Н-тимидина, включенного в реплицирующуюся ДНК. Среднее значение для четырех измерений радиоактивности выражали в процентах от контрольного уровня.

Оценка «раннего» и «позднего» апоптоза. При оценке апоптоза использовали аликвоты, содержащие 10⁶ клеток. «Ранний» апоптоз оценивали, окрашивая клетки витально двумя флуоресцентными красителями: пропидий иодидом и ФИТЦ-меченым аннексином, используя Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, США). Долю аннексин-позитивных и, одновременно, пропидий-негативных клеток считали уровнем апоптоза клеточной популяции. Оценку позднего апоптоза проводили путем окрашивания пропидий иодидом ДНК фиксированных клеток [Darzynkiewicz Z. et al., 1994]. Образцы с клетками анализировали методом однолучевой проточной цитофлуориметрии при длине волны 488 нм (Cytomics FC500; Beckman Coulter, США).

МТТ-тест (оценка цитотоксичности ФКС). МТТ-тест проводили по методике, описанной Niks M. с соавт., которая основана на способности митохондриальных дегидрогеназ живой клетки конвертировать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромид (МТТ) в формазан. Оценку цитотоксичности ФКС проводили при 90% конфлюэнтности клеточной культуры в стационарной фазе роста. Оптическую плотность формазана, растворенного в диметилсульфоксиде считывали при длине волны 492 нм, долю жизнеспособных клеток выражали в процентах к контролю.

Оценка экспрессии поверхностных клеточных маркеров. Определение фенотипа лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺), а также оценку экспрессии маркеров активации и трансмиграции (молекулы адгезии CD62L и CD11b) фагоцитами проводили методом проточной цитометрии с использованием флуорохром-меченых моноклональных антител к соответствующим молекулам (Invitrogen или Beckman Coulter, США). Процедуру окрашивания проводили согласно рекомендациям, приведенным в инструкции производителя. Уровень экспрессии молекул (в процентах и/или единицах интенсивности флуоресценции) оценивали, учитывая фоновое связывание клеток с флуорохром-мечеными IgG (изотипический контроль).

Оценка уровня внеклеточных цитокинов. Выделенные МНК культивировали 24-48 ч в полной среде RPMI-1640 в присутствии КонА. Концентрации цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ИФН-γ, ФНО-α, GM-CSF) в супернатантах определяли цитофлуориметрическим методом, используя набор реактивов Mouse Th1/Th2 FlowCytomix Multiplex (Bender MedSystems, Австрия) и анализировали методом проточной цитометрии, используя программное обеспечение FlowCytomix Pro (Bender MedSystems, Австрия).

Оценка уровня сывороточных иммуноглобулинов. Определение содержания овальбумин (ОВА)-специфических иммуноглобулинов (IgG1, IgG2a и IgE) в сыворотке крови мышей проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. Результат выражали в единицах оптической плотности, измеренной при длине волны 450 нм.

следующая страница>