На правах рукописи

МЕРКУШКИНА

Ирина Владиславовна
КОРРЕКЦИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ

ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЭНДОТОКСИКОЗЕ
14.00.16 – патологическая физиология

14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Саранск 2009
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор

Власов Алексей Петрович;

доктор фармацевтических наук профессор

Бунятян Наталья Дмитриевна

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РФ

доктор медицинских наук профессор

Воложин Александр Ильич;

доктор медицинских наук профессор

Козлов Иван Генрихович;

доктор медицинских наук профессор

Козлов Сергей Александрович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится «23» октября 2009 года на заседании диссертационного совета Д 212.117.08 при ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н. П. Огарева» (430000, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мордовского государственного университета имени Н.П. Огарева.
Автореферат разослан «___» ____________ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук доцент А.Г. Голубев
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Исследуемая в работе тема отражает современное направление развития патологической физиологии и фармакологии, а именно углубленное изучение патогенеза различных заболеваний на клеточном и молекулярном уровнях и на основе чего разработку новых фармакологических схем регуляции расстройств гомеостаза.

В настоящее время концепция эндогенной интоксикации получила абсолютное признание клиницистов, так как именно эндотоксикоз, в конечном итоге, становится основополагающим фактором развития полиорганной и полисистемной недостаточности, определяющей в подавляющем большинстве случаев исход заболевания (Deventer S.J. et al., 1998). Синдром эндогенной интоксикации сопровождается чаще всего деструкцией тканей, нарушением обмена веществ, снижением функциональной активности систем естественной детоксикации (Федоровский Н.М. и др., 1997; Буянов В.М. и др., 1998; Миронов П.И. и др., 1999; Малков И.С. и др., 2000; Власов А.П. и др., 2008).

Неоспорим тот факт, что важную роль в молекулярной организации и функционировании живых структур играют липиды (Степанов А.Е. и др., 1991; Рад М.Р., 1993; Трофимов В.А., 2004; Montalto G. et al., 1994; Zhou W., Ohashi K., 1994). Состав липидов мембран определен так, чтобы оптимизировать функциональную деятельность клеток и органов. Распределение индивидуальных липидов и направленность их обмена во многом обусловлены специфическими особенностями липидного состава клеточных структур (Кулагина Т.П. и др., 1994; Тарасова Т.В., 2004).

С учетом значимости нарушений липидного метаболизма в формировании полиорганной недостаточности при синдроме эндогенной интоксикации (Савельев В.С. и др., 2005), особое значение в настоящее время придается изучению обмена липидов в ЦНС при ее поражении, в частности токсического генеза. Известно, что перекисное окисление липидов – один из важных и физиологически значимых механизмов модификации липидного состава и, следовательно, функциональной активности клеточных образований головного мозга (Азизова О.А., Власова И.И., 1993; Кулагина Т. П. и др., 2004; Simmet Th. et. al., 1990).

Однако проблемы патогенетических механизмов поражения головного мозга с акцентом на динамическую оценку липидных изменений в составе клеточных структур при эндотоксикозе и векторной терапии данного патологического состояния недостаточно освещены в современной литературе. Особый интерес представляет изучение влияния фармакологических и физических агентов, способных модифицировать липидный метаболизм, на структурно-метаболическое состояние головного мозга при его токсическом поражении. Приведенные доводы свидетельствуют о том, что избранная тема является актуальной и имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение метаболических процессов в тканевых структурах головного мозга при эндогенной интоксикации с акцентом на исследование расстройств липидного обмена; определение роли антиоксидантной и лазеротерапии в восстановлении метаболических процессов в органе при токсическом поражении.

Достижение поставленной цели предполагало решение следующих задач.

1. Изучить в динамике при эндогенной интоксикации перитонеального генеза качественный и количественный липидный состав тканевых структур головного мозга и печени, а также эритроцитов и тромбоцитов.

2. Исследовать состояние коагуляционно-литической тканевой системы головного мозга, функционального состояния эритроцитов и тромбоцитов при эндотоксикозе, посредством корреляционного анализа установить их связь с нарушениями липидного обмена.

3. Оценить зависимость метаболических нарушений в тканевых структурах головного мозга от выраженности интоксикационного процесса, активности перекисного окисления липидов и фосфолипазы А₂.

4. Установить зависимость липидных дестабилизаций головного мозга от морфофункционального состояния печени.

5. Исследовать влияние производных 3-оксипиридина, обладающих антиоксидантным действием (эмоксипин, мексидол, этоксидол), и лазеротерапии на выраженность эндогенной интоксикации.

6. Изучить в динамике экспериментального перитонита действие исследованных схем терапии на липидный обмен головного мозга, печени, эритроцитов и тромбоцитов и на основные процессы, участвующие в его регуляции.

7. Определить эффект влияния схем терапии на коагуляционно-литические процессы плазмы крови и тканевых структур головного мозга при эндогенной интоксикации.

8. Дать патофизиологическое обоснование целесообразности совместного использования антиоксидантной и лазерной терапии в коррекции метаболических нарушений головного мозга при эндогенной интоксикации.

9. На основе полученных фактических материалов по нарушению липидного обмена в головном мозге и печени, интоксикационному процессу на различных этапах острого перитонита, в том числе при использовании различных схем терапии, охарактеризовать патофизиологическое значение нарушений липидного обмена в токсическом поражении головного мозга в целом.

Научная новизна

При эндогенной интоксикации перитонеального генеза проведено комплексное изучение количественного и качественного состава липидов головного мозга, печени, эритроцитов и тромбоцитов, что позволило в динамике установить направленность и продолжительность мембранодестабилизирующих явлений в исследованных тканевых структурах.

Экспериментальными исследованиями показано, что деструкция липидов клеточных мембран головного мозга коррелирует с выраженностью эндогенной интоксикации, состоянием органной коагуляционно-литической системы, нарушением функционального состояния печени, эритроцитов и тромбоцитов. Повреждающим фактором фосфолипидного бислоя мембран клеточных структур головного мозга при эндотоксикозе выступает резкое возрастание стационарного уровня эндогенных пероксидов липидов и активности фосфолипазы А₂.

Установлено, что наиболее значимыми проявлениями нарушений липидного обмена головного мозга при эндогенной интоксикации являются рост уровней лизоформ фосфолипидов, свободных жирных кислот, понижение содержания суммарных фосфолипидов, холестерола и фосфатидилхолина.

Выявлена закономерность, что восстановление липидного метаболизма клеточных структур головного мозга по сравнению с печенью происходит замедленно и в стадии разгара воспаления не сопряжено с падением уровня токсических продуктов в плазме крови.

Показано, что производные 3-оксипиридина (эмоксипин, мексидол, этоксидол) обладают способностью существенно повышать емкость антиоксидантной защиты липидов биомембран, тем самым быстро (в течение 3-х суток) модифицировать химический состав липидов клеточных структур головного мозга, печени, а также эритроцитов и тромбоцитов. При использовании же лазеротерапии коррекция липидного метаболизма в исследованных объектах происходит замедленным темпом.

Обнаружено, что темп восстановления фосфолипидов мембран клеток головного мозга определяется способностью исследованных лечебных агентов уменьшать уровни эндогенных пероксидов и детергентных форм липидов, активность фосфолипазных систем: при действии антиоксидантов происходит резкое снижение их стационарного уровня, при лазеротерапии – замедленное.

Выявлено, что восстановление химического состава мембран клеточных структур печени под влиянием исследованных схем терапии по сравнению с головным мозгом происходит быстрее. Это является важнейшей составляющей в процессе уменьшения эндогенной интоксикации при остром перитоните.

Показано, что при комбинации лечебных агентов (антиоксидант + лазеротерапия) восприимчивость тканевых структур головного мозга к их регуляторным воздействиям повышается, что проявляется не только в коррекции липидного метаболизма, но и в восстановлении состояния коагуляционно-литической системы.

Практическое значение работы

Установлен факт сохранения расстройств липидного обмена клеточных структур головного мозга при снижении уровня эндогенной интоксикации (в то время как в печени отмечается восстановление липидного метаболизма), что является свидетельством высокой чувствительности и лабильности липидов головного мозга к воздействиям токсических продуктов при остром перитоните и диктует необходимость своевременного повышения их толерантности.

Обнаружено, что применение антиоксидантов при эндогенной интоксикации перитонеального генеза направлено на стабилизацию структуры липидного бислоя мембран клеточных структур головного мозга. Это явилось важнейшей составляющей предупреждения прогрессирования токсического поражения головного мозга.

Выявлено, что гелий-неоновое лазерное облучение крови не обладает способностью быстро корригировать нарушения липидного обмена головного мозга, хотя отмечаются положительные его влияния на коагуляционно-литическую систему.

Доказано, что при комбинированном применении исследованных лечебных агентов отмечается наиболее полное воздействие на патогенетические компоненты, лежащие в основе липидных дестабилизаций головного мозга, что предупреждает прогрессирование токсического поражения органа.

Экспериментальные данные, посвященные изучению действия различных лечебных агентов на структурное состояние клеточных структур головного мозга, расширяют современные представления о механизмах регуляции биологических процессов при токсическом поражении головного мозга и могут быть использованы для разработки других патогенетических схем мембранопротекторной терапии с целью ослабления проявлений дизрегуляционной патологии со стороны головного мозга при эндогенной интоксикации.

Положения, выносимые на защиту

1. В патогенезе токсического поражения головного мозга при остром перитоните одними из ведущих компонентов выступают количественные и качественные изменения в спектре липидов, свидетельствующие о структурных преобразованиях фосфолипидного бислоя мембран клеточных структур головного мозга.

2. Изменения липидного обмена головного мозга, по сравнению с печенью, отличают высокая стойкость, продолжительность, отсутствие четкой положительной динамики при уменьшении уровня токсических продуктов в плазме крови на ранних этапах воспалительного процесса в брюшной полости.

3. Нарушения липидного метаболизма головного мозга происходят на фоне не только возрастания интенсивности свободнорадикальных реакций липопереокисления, но и повышения активности фосфолипазы А₂, коагуляционного потенциала, снижения фибринолитической активности тканевых структур органа.

4. Использование антиоксидантов – производных 3-оксипиридина при эндогенной интоксикации предупреждает прогрессирование изменений и способствует восстановлению качественного и количественного состава липидов клеточных структур головного мозга, печени, а также эритроцитов и тромбоцитов, тем самым обусловливая мембранопротекторный эффект.

5. Лазеротерапия не обладает способностью быстро корригировать нарушения липидного обмена головного мозга. Положительное ее действие определяется влиянием на коагуляционно-литическую систему тканей органа.

6. При комбинированном применении исследованных лечебных агентов отмечается наиболее полное воздействие на патогенетические компоненты, лежащие в основе липидных дестабилизаций головного мозга, что предупреждает прогрессирование токсического поражения органа.

7. В коррекции нарушений липидного метаболизма головного мозга при остром перитоните важное значение имеет эффект антиоксидантной и квантовой терапии восстанавливать липидный обмен в печени, что обусловливает повышение детоксикационной ее способности и снижение эндогенной интоксикации.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на научной конференции молодых ученых (Саранск, 2000–2008), III Международной конференции «Прогрессивные технологии в медицине» (Пенза, 2001), I Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2001), IV Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в ХХI веке» (Москва, 2003), Х Всероссийской конференции «Актуальные вопросы анестезиологии и реаниматологии» (Санкт-Петербург, 2003), II Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), ХIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), XIII Международной конференции хирургов-гепатологов стран СНГ (Санкт-Петербург, 2007), Юбилейной научной конференции, посвященной 175-летию со дня рождения С.П. Боткина (Санкт-Петербург, 2007), IХ–ХII Российских конференциях «Гепатология сегодня» (Москва, 2004–2007), X–XIV Российских гастроэнтерологических неделях (Москва, 2004–2008), Огаревских чтениях – научно-практической конференции Мордовского университета (Саранск, 2001–2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 46 работ, из них 17 (11 статей и 6 тезисов) в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 343 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы (І-я глава), описания материалов и методов исследования (ІІ-я глава), результатов собственных исследований (ІІІ–VІІ-е главы), обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, который включает 287 отечественных и 145 иностранных источников. Работа содержит 121 таблицу и 92 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования

Основой работы явились экспериментальные исследования на 120 взрослых беспородных половозрелых собаках обоего пола массой от 8,5 до 19,5 кг.

Первая группа (I) – контрольная (n = 20), собакам моделировали острый каловый перитонит. В ди­намике заболевания исследовали выраженность эндогенной интоксикации по ее гидрофильному и гидрофобному компонентам, качественный и количественный состав липидов, интенсивность ПОЛ, активность ФА₂, каталазы и СОД тканей головного мозга, печени, эритроцитов и тромбоцитов, морфофункциональное состояние форменных элементов крови, некоторые показатели гуморального компонента системы гемостаза в органном кровотоке и тканевых структурах головного мозга.

Вторая–шестая группы (ІІ – VІ) – опытные (n = 20 в каждой группе). Изучали вышеуказанные компоненты гомеостаза при остром перитоните при условии включения в комплексную терапию препаратов с антиоксидантным действием – производных 3-оксипиридина (эмоксипин, мексидол и этоксидол) (II, III, IV группа), лазеротерапии (V группа) и комбинации этоксидола и лазеротерапии (VI группа).

Модель острого перитонита. Под общим обезболиванием (тиопентал натрий в дозе 0,04 мг/кг) животным в брюшную полость шприцем вводили 20% каловую взвесь из расчета 0,5 мл на 1 кг массы тела животного (Власов А.П., 1991). Че­рез сутки после этой манипуляции вы­полняли срединную лапаротомию, оценивали возникшие патологические изменения в брюшной полости и санировали ее, наглухо ушивали брюшную стенку. В контрольные сроки (1-е, 3-и, 5-е сутки) под наркозом животным производили забор крови из яремной вены, релапаротомию, биопсию ткани печени, затем после умерщвления животных путем введения летальных доз тиопентала натрия выполняли трепанацию черепа, забор тканей головного мозга (преимущественно серого вещества).

В послеоперационном периоде животным проводили антибактериальную (внутримышечные инъекции два раза в сутки раствора гентамицина из расчета 0,8 мг/кг массы тела), инфузионную (внутривенные введения 5% раствора глюкозы и 0,89% раствора хлорида натрия из расчета 50 мл/кг массы животного) терапию.

В опытных группах животным в комплексную терапию включали внутривенные введения 1% раствора эмоксипина из расчета 10 мг/кг (II группа), 5% раствора мексидола из расчета 10 мг/кг (III группа), 5% раствора этоксидола из расчета 10 мг/кг (IV группа); низкоэнергетическое гелий-неоновое лазерное облучение крови при мощности излучения на выходе световода 5 мВт и времени воздействия 15 мин. (доза 0,1 Дж/см²) (V группа), комбинированное применение этоксидола и лазеротерапии в тех же дозах (VI группа).

Дозы антиоксидантов подобраны на основании многолетних исследований лаборатории кафедры факультетской хирургии медицинского института Мордовского университета (0,4 % LD₅₀).

Экспериментальные исследования проведены в соответствии с этическими требованиями по работе с экспериментальными животными («Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1987) и Федеральный закон о защите животных от жесткого обращения от 01.01.1997).

Методы исследования. Липиды из ткани головного мозга, печени и форменных элементов крови экстрагировали хлороформметаноловой смесью (Хиггинс Дж.А., 1990). Липиды фракционировали методом тонкослойной хроматографии. Полярные фосфолипиды разделяли на пластинах фирмы «Merk» на стеклянной основе, нейтральные липиды – на силикагелевых пластинах для обращенно-фазной тонкослойной хроматографии (Хиггинс Дж. А., 1990; Vaskovsky V.E. et al., 1975). Молекулярный анализ проводили на денситометре Model GS-670 (BIO-RAD, США) с соответствующим программным обеспечением (Phosphor Analyst/PS Sowtware). Показатели интенсивности ПОЛ: диеновые конъюгаты определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 232-233 нм (Ганстон Ф.Д., 1986), уровень спонтанного МДА – спектрофотометрическим методом в реакции с тиобарбитуровой кислотой (Sigma), антиокислительную активность липидов оценивали в модельных условиях (Егоров Д.Ю., Козлов А.В., 1988), активность СОД – в реакции с нитросиним тетразолием (Гуревич В.С. и др., 1990), активность каталазы исследовали спектрофотометрическим методом, основанным на способности перекисей образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс (Королюк М.А., 1988). Активность ФЛ А₂ исследовали в среде, содержащей 10 ммоль трис-HCL-буфер (рH 8,0), 150 ммоль тритон Х-100, 10 ммоль CaCl₂ и 1,2 ммоль субстрата, в качестве которого использовали фосфатидилхолины яичного желтка (Трофимов В.А., 1999). Выраженность эндогенной интоксикации оценивали по следующим показателям: содержание молекул средней массы выявляли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-46 при длинах волн 254 и 280 нм (Пикуза О.И., Шакирова Л.З., 1994), общую и эффективную концентрацию альбумина в сыворотке крови – флуоресцентным методом на специализированном анализаторе АКЛ-01 «Зонд» (Грызунов Ю.А., Добрецов Г.Е., 1994). Определяли мочевину (Досон Р. и др., 1991), креатинин, билирубин, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз в сыворотке крови (Досон Р. и др., 1991. Для анализа состояния гемостаза применялись методики, позволяющие оценить как общую коагуляционную способность крови, так и отдельные звенья свертывающей системы крови: время спонтанного свертывания крови по R.J. Lee и P.D. White (1913), время рекальцификации обычной плазмы – по Bergerhof и Roka (1954), толерантность плазмы к гепарину – по Poller в модификации В.П. Балуды (1954), протромбиновое время плазмы – по A.J. Quick (1966), концентрация фибриногена – по Р.А. Рутберг (1961), уровень антитромбина III – по N. A. Hense и Е.А. Loelige в модификации К.М. Бишевского (1963), фибринолитическую активность крови – по H. Kowarzyk, L. Buluck (1954), продукты деградации фибриногена и фибрина (ПДФ) в плазме – по N. Guest. Состояние тканевой коагуляционно-литической системы головного мозга оценивали указанными тестами при добавлении в реагирующую смесь тканевого экстракта головного мозга, для получения которого использовали способ В.П. Скипетрова (1969). Агрегацию тромбоцитов регистрировали оптическим методом с помощью двулучевого агрегометра THROMLITE 1006 производства СП «БиоХимМак» (Москва). Определяля сорбционную способность эритроцитов (Тогайбаев А. А. и др., 1988), деформабельность эритроцитов (Федорова З. Д., 1986). Изучение жесткости эритроцитарных мембран производилось по способу О. М. Моисеевой с соавт. (1990). Психосоматический статус животных оценивали по Л.М. Мочкиной и Е.Н. Осиповой (2006) в собственной модификации.

Статистическую обработку полученных данных производили общепринятыми методами статистики с определением достоверности различий между данными в опытных и контрольной группах на основе расчета критерия Стьюдента и χ², корреляционную связь оценивали по критерию r. Выявленные закономерности и связи изучаемых параметров между группами и признаками были значимыми при вероятности безошибочного прогноза р = 95 % и более.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследованиями установлено, что модель острого перитонита была адекватной для решения поставленных задач: у животных развивался тяжелый синдром эндогенной интоксикации. Показатели молекул средней массы ( = 254 нм и  = 280 нм) существенно превосходили норму на 77,04–136,54 и 54,66–137,05 % (р < 0,05) соответственно. Достоверно возрастало содержание гидрофобных токсинов в плазме крови: отмечалось снижение общей и эффективной концентрации альбумина, а также резерва его связывания относительно нормы на 18,96–30,63 и 34,11–52,60, 22,21–50,00 % (р < 0,05) соответственно. Определение индекса токсичности плазмы крови показало увеличение данного параметра на 158,18–336,36 % (р < 0,05).

В последние десятилетия заметно возрос интерес исследователей к нарушениям липидного обмена при различных патологических процессах (Тимушева Ю.Т. и др., 1998; Кацадзе М.А., 2001; Савельев В.С. и др., 2008; Luo Z.Y. et al., 1992). Особое место среди органов-мишеней эндотоксинов занимает головной мозг. Особенности микроструктурной организации и химизма его ткани определяют важнейшую роль липидов в функционально-метаболическом статусе органа. Теме нарушений в липидном гомеостазе и выявлению причин и механизмов разбалансировки в системе «прооксиданты – антиоксиданты» в мозге в современных научных публикациях уделяется большое внимание. Однако вопросы патогенеза, особенности развития нарушений в мозге, а также системы регулирования этого процесса остаются открытыми (Шустанова Т.А. и др., 2001). Кроме того, недостаточно изучена проблема дислипидных явлений в головном мозге при эндотоксикозе.

Известно, что лабильность возбудимых нервных структур связана с интенсив­ностью свободнорадикальных реакций. Перекисное окисление липидов является одним из важных и физиологически значимых механизмов модификации липидного состава и, следовательно, функциональной активности клеточных образований головного мозга (Азизова О.А., Власова И.И., 1993). Изучение выраженности процессов липопепреокисления и активизации ферментов в ткани головного мозга при синдроме эндогенной интоксикации показало существенное увеличение содержания продуктов липопереокисления (уровни спонтанного и индуцированного МДА в ткани головного мозга на фоне развития выраженного эндотоксикоза возрастали на 28,14–188,33 и 21,35–72,99 % (р<0,05) соответственно) и активности ФЛ А­₂ на 92,31–117,95 % (р < 0,05). Было установлено и достоверное снижение активности собственного антиоксидантного фермента СОД на 31,90–59,05 % (р < 0,05). Следует отметить, что при выбранной модели эндотоксикоза данные процессы достигали апогея уже на 1–3-и сутки течения патологического процесса, что было сопоставимо с динамикой эндогенной интоксикации.

Неоспорим тот факт, что липопереокисление и активность фосфолипаз являются одними из основных факторов модификации липидного состава биомембран различных тканевых структур (Владимиров Ю.А., 1980). Изучение липидного спектра биомембран клеточных структур головного мозга показало существенное его нарушение на фоне выраженного эндотоксикоза, что проявилось в увеличении уровней лизоформ фосфолипидов на 97,08–155,85 % (р < 0,05), СЖК – на 12,34–70,43 % (р < 0,05), понижении содержания СФ на 12,55–20,72 % (р < 0,05), ХС – на 10,49–26,40 % (р < 0,05), ФХ – на 18,24–27,22 % (р < 0,05). Особо выделим значительные модификации фосфолипидного состава биомембран клеточных структур головного мозга, которые были зафиксированы в виде прогрессивного снижения содержания ФХ и роста удельного веса фракции ЛФЛ (рис. 1).

следующая страница>