4.2 Методы количественного определения пектиновых
веществ
Количественное определение пектинов всегда производится в растворах, поэтому объект исследования должен находиться в растворенном состоянии.
Переведение в раствор пектиновых веществ, находящихся в твердых смесях, уже описывалось при изложении методов качественного определения, однако чаще приходится иметь дело с их определением в растительных объектах.
Нужно иметь в виду, что при экстрагировании пектиновых веществ из растительных материалов сравнимые результаты могут быть получены только в том случае, если пользоваться одними и теми же приемами экстракции при их строгом соблюдении.
Существуют два метода количественного извлечения пектинов из растительных материалов:
1) фракционное извлечение пектиновых веществ;
2) быстрое получение всего экстракта.
По первому методу подлежащий анализу хорошо измельченный растительный материал экстрагируется на водяной бане десятикратным количеством 95%-ного этилового спирта для удаления сахаров, смолы, воска и т. д. Нерастворившийся осадок отфильтровывается, промывается 95%-ным спиртом, затем смесью спирта и эфира, снова эфиром и сушится при 85°С. Обработанный таким образом материал экстрагируется в приборе, который удобен для многократных последовательных обработок (рисунок 3).
Материал помещается в сосуд А, снабженный фильтром из пористого стекла, и заливается предварительно нагретой до необходимой температуры экстракционной жидкостью. Требуемая для этого температура поддерживается при помощи водяной бани Б.
После завершения процесса жидкость при помощи водяного насоса отсасывается через трубку В в приемник. Если необходимо, проводят несколько экстракций одной и той же пробы одной или несколькими жидкостями. При этом можно собирать либо весь экстракт сразу, либо по фракциям.
При достаточном количестве раствора (около 50 мл на 1 г экстрагируемого материала) и хорошем размешивания можно извлечь 99 % пектиновых веществ за 4, 5 последовательных обработок.
Экстрагирующая жидкость выбирается в зависимости от того, в какой форме пектиновые вещества находятся в объекте исследования. Чаще всего в качестве ее применяют воду или 0,1 Н соляную кислоту.
Рисунок 3 Экстрактор Вейх-Филипса
Но если объект исследования содержит нерастворимые в воде пектинаты и пектаты, экстрагирующей жидкостью должен быть очень слабый раствор щелочи, так как при действии соляной кислоты получились бы нерастворимые низкометоксилированные пектиновые и пектовые кислоты.
По второму методу в трехлитровую колбу помещают 100 г хорошо измельченного испытуемого материала и заливают таким количеством горячей воды, чтобы при добавлении необходимого количества реактивов общий объем не превышал двух литров. Содержимое колбы нагревается на водяной бане до 88…90°С, после чего прибавляется сернистая кислота из расчета, чтобы конечная концентрация ее была 0,4…0,6 %. Экстракция длится 60 мин. при 88…90°С. После этого колба вынимается из водяной бани и быстро охлаждается струей холодной воды. Затем в нее доливается дистиллированная вода до метки 2 л, содержимое размешивается и отстаивается в полном покое. Из отстоявшегося экстракта отбирается необходимое для проведения анализа количество жидкости.
4.3 Количественное определение протопектина
Как известно, протопектин нерастворим в воде. Из растительной ткани или любого другого испытуемого материала сначала экстрагируются водорастворимые пектиновые вещества, затем образец подвергается обработке, которая переводит в растворимое состояние протопектин.
Из хорошо измельченной пробы сначала удаляются растворимые пектины путем экстракции в течение 2 ч тремя последовательными порциями холодной (от 20 до 25°С) дистиллированной воды из расчета 100 мл на 1 г пробы. Такая экстракция удаляет из образца 98 % растворимых пектиновых веществ. Оставшийся протопектин можно перевести в растворимое состояние обработкой 0,5%-ным раствором оксалата аммония при 85°С в течение 2 ч или раствором соляной кислоты обычными приемами и определить методами, принятыми для пектиновой и пектовой кислот, а также для их солей.
Предлагаемый метод количественного определения протопектина является простым и доступным, но ввиду того, что граница между нерастворимыми и растворимыми пектиновыми веществами очень неопределенная, этот метод можно считать до некоторой степени условным.
4.4 Количественное определение пектиновых и пектовых
кислот и их солей
Первой операцией при определении массовой доли пектиновых веществ в растительном сырье является извлечение и перевод в растворенное состояние.
Для этого берут навеску массой 25 г влажного или 10 г сухого исследуемого материала, тщательно растирают его в ступке до однородной массы. Количественно переносят в коническую колбу на 150 мл, смывая ступку водой, затем добавляют в колбу 100 мл дистиллированной воды с температурой 40°С. Колбу с материалом и водой выдерживают на водяной бане при температуре 40°С в течение 30 мин. По истечении этого времени содержимое колбы отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр. Операцию повторяют, заливая твердый остаток в колбе 75 мл, а затем ещё раз 50...60 мл воды, отфильтровывая каждый раз жидкость через тот же фильтр. Полученные экстракты собирают в мерную колбу на 250 мл и доводят до метки дистиллированной водой. Полученный раствор гидратированных пектинов используют для дальнейших анализов.
Для определения массовой доли в растительном сырье протопектина и пектовой кислоты остаток измельченного растительного материала на фильтре заливают 50 мл 0,3 Н раствора соляной кислоты и переносят в коническую колбу на 250 мл, закрывают колбу пробкой с обратным холодильником и выдерживают 30 мин. на кипящей водяной бане. По истечении этого времени экстракт отфильтровывают через складчатый фильтр в мерную колбу на 500 мл. Остаток на фильтре 3, 4 раза промывают 75 мл дистиллированной воды, промывные воды фильтруют через бумажный фильтр в ту же колбу. Фильтр вместе с остатком растительного материала переносят в коническую колбу, заливают от 50 до 70 мл 1%-ного раствора лимоннокислого аммония и помещают на кипящую водяную баню на 30 мин. Полученный экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр в ту же мерную колбу. Фильтр промывают горячей дистиллированной водой, после чего содержимое колбы охлаждают и доводят до метки.
Полученные экстракты гидратированного пектина и протопектина исследуют одним из следующих методов.
4.4.1 Кальций-пектатный метод
Метод основан на осаждении пектовых кислот в виде кальциевых солей. Это один из наиболее точных методов. Он прост, доступен и имеет хорошую сходимость параллельных анализов. В зависимости от цели исследования можно определить отдельно растворимый пектин, протопектин или сумму пектиновых веществ.
Ход анализа при определении пектинов в обоих растворах одинаков. Отличие в том, что раствор протопектина предварительно нейтрализуют NaOH до прибавления щелочи, необходимой для его гидролиза.
Для гидролиза пектиновых веществ к 50 мл исследуемого раствора прибавляют равный объем 0,4%-ного (1 Н) раствора NaOH и оставляют на 8...10 ч при комнатной температуре. По истечении этого времени раствор подкисляют тем же объемом 1 Н уксусной кислоты. Образовавшиеся пектовые кислоты осаждают 50 мл 10%-ного раствора СаСО3. Полученный осадок пектата кальция отфильтровывают через заранее высушенный до постоянной массы и взвешенный с бюксом бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывают 0,5%-ным раствором СаСl2, затем 5, 6 раз холодной дистиллированной водой для удаления ионов хлора (проверка по реакции на Сl- с азотнокислым серебром). Для снижения зольности осадок дополнительно промывают
3, 4 раза горячей дистиллированной водой. Фильтр с осадком переносят в бюкс и сушат до постоянной массы при температуре 100...105°С. Массу осадка, полученную по разности между массой бюкса с осадком на фильтре и массой бюкса с фильтром, умножают на 0,9235 для пересчета на пектовую кислоту. Если масса пектата кальция превышает 0,03 г, опыт необходимо повторить с меньшим количеством экстракта.
Погрешность метода составляет 0,3 %. Источник ошибок: возможность перехода в осадок пектата кальция непектиновых примесей.
Если в исследуемом объекте эти вещества не находятся в растворенном состоянии, их следует перевести в раствор каким-либо из существующих методов.
4.4.2 Карбазольный метод
Метод основан на определении пектинов по образованию гидролизованного до D-галактуроновой кислоты исследуемого пектинового раствора с карбазоловым реактивом.
Пектиновый раствор подкисляют серной кислотой до рН 1,0...1,5. Затем пектины осаждают подкисленным этиловым спиртом-ректификатом с рН 4,7...4,8. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при скорости 3000 об./мин. в течение 10 мин. и промывают подкисленным спиртом. Промытый осадок гидролизуют концентрированной серной кислотой, добавляют 0,2%-ный спиртовый раствор карбазолового реактива и производят замер оптической плотности на фотоэлектроколориметре ФЭК-М или аналогичном при длине волны 535 нм с зеленым фильтром. Предпочтительно использовать кювету с рабочей длиной 20 мм. Отсчет на ФЭКе проводят по шкале оптической плотности. Количество пектиновых веществ определяют с помощью калибровочной кривой, построенной по чистой
D-галактуроновой кислоте.
Недостаток карбазольного метода в том, что результаты часто искажены из-за недостаточно тщательной промывки пектинового осадка от сахарозы, продукты гидролиза которой (в основном глюкоза) дают с карбазолом тот же цвет, хотя и менее интенсивный, чем
D-галактуроновая кислота.
4.4.3 Количественное определение в растворе
без деметоксилирования
Существует несколько модификаций этого метода, из которых наиболее распространены следующие.
4.4.3.1 Первый вариант метода
К 50 мл исследуемого раствора прибавляют концентрированную соляную кислоту до достижения ее конечной концентрации 0,15 Н. Затем при непрерывном, энергичном перемешивании вводят по каплям 100 мл 95%-ного этилового спирта. Через 1 ч полученный осадок отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр, тщательно промывают смесью воды и этанола (1:2), содержащей 0,2 % соляной кислоты. Промытый осадок растворяют на фильтре горячей водой. При плохой растворимости осадка к горячей воде прибавляют несколько капель щелочи. Количество фильтрата должно быть равным 50 мл. Полученный фильтрат нейтрализуют и снова осаждают этиловым спиртом. Образовавшийся осадок снова отфильтровывают, промывают сначала смесью воды с этанолом (1:2), затем 95%-ным этиловым спиртом, переносят количественно горячей водой в предварительно высушенный до постоянной массы и взвешенный тигель и сушат в сушильном шкафу при температуре 100...105°С до постоянной массы. Разность между массой тигля с осадком после сушки и пустого тигля представляет собой количество пектина в 50 мл раствора.
4.4.3.2 Второй вариант метода
К 100 мл исследуемого раствора прибавляют 20 мл концентрированной соляной кислоты. Из подкисленного раствора пектин осаждают 100 мл 95%-ного этилового спирта. Спустя 15 мин выпавший осадок отфильтровывают через плотное шелковое полотно, которое осторожно разворачивают и помещают в открытую широкую чашку осадком вверх. Осадок заливают 300 мл 95%-ного спирта, растирают и отжимают. Такую промывку повторяют 3, 4 раза до отрицательной реакции на ион хлора. После тщательного отжатия осадок переносят количественно в предварительно взвешенный пористый тигель, сушат и сжигают его. Количество пектиновых веществ определяется по разности между массами остатков после сушки и после сжигания.
Достоинством метода осаждения этиловым спиртом является его простота. Однако он недостаточно точен, так как вместе с пектином соосаждаются балластные по отношению к пектину вещества.
4.4.3.3 Осаждение ацетоном
К исследуемому раствору, содержащему приблизительно 0,2 % пектиновых веществ, прибавляют ацетон до его конечной концентрации в растворе 50 %. После 5 мин. отстаивания смеси осадок отфильтровывают через бумажный фильтр, количественно переносят его, смывая холодной водой, в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки. Для лучшего растворения осадка раствор подогревают. После охлаждения раствора прибавляют ацетон для осаждения пектиновых веществ. Осадок снова отфильтровывают через взвешенный беззольный фильтр, промывают 60%-ным ацетоном, сушат при температуре 100°С и сжигают. Разность между массами остатков после сушки и после сжигания представляет собой количество пектина в исследуемом растворе.
Достоинство данного метода состоит в том, что получается более плотный осадок, чем при осаждении спиртом. Кроме того, ацетон легче регенерируется.
Недостатком является большая погрешность метода, так как при осаждении ацетоном в осадок могут выпадать непектиновые вещества.
4.4.3.4 Определение пектиновых веществ по оптическому
вращению
Этот метод применим для цитрусовых пектинов. Анализ проводится следующим образом. Вначале измеряют удельное вращение исходного раствора, после чего пектиновые вещества количественно осаждают в виде медной соли и отфильтровывают. Затем измеряют удельное вращение фильтрата. Разность вращений до и после осаждения пектиновых веществ прямо пропорциональна их концентрации (удельное вращение цитрусового пектина +230 град.).
Приведенный метод определения концентрации пектиновых веществ широкого распространения не получил, так как пектины, выделенные из различных источников различными методами, имеют разные величины удельного вращения. Кроме того, медь осаждает из растворов и другие вещества, например белки. Следовательно, нужно вводить дополнительные операции по предварительной очистке испытуемого раствора от непектиновых составляющих.
4.4.4 Количественное определение пектиновых веществ
в растворе, сопровождающееся деметоксилированием
4.4.4.1 Осаждение соляной кислотой
Пектовые кислоты осаждаются из растворов сильными минеральными кислотами. Вследствие того, что при определенных условиях растворимость пектовых кислот даже в горячей воде очень низкая, это свойство может быть использовано для количественного определения пектинов.
Сущность метода определения пектиновых веществ через пектовую кислоту путем осаждения соляной кислотой заключается в следующем. К 25 мл приблизительно 1%-ного раствора пектиновых веществ прибавляют от 8 до 12 г сахарозы и осаждают 200 мл 95%-ного этилового спирта. Осадок отфильтровывают, а затем растворяют на фильтре дистиллированной водой. Полученный раствор омыляют 0,2…1%-ным раствором гидроокиси натрия в течение 15 мин и осаждают соляной кислотой (1:2,5) при кипячении в течение 5 мин. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают горячей водой почти до отрицательной реакции на хлор-ион. Фильтрат должен быть прозрачным. Если это не так, определение повторяют: омыляют пектиновый раствор более концентрированной щелочью и при более низкой температуре.
Полученный осадок смывают в тигель и высушивают сначала на паровой бане, а затем в сушильном шкафу при 98°С. Вес пектиновой кислоты определяют как разность между массами до и после определения золы.
Результаты, полученные по этому методу, обычно занижены, вероятно, вследствие деградации пектиновых веществ во время нагревания с кислотой.
4.4.4.2 Объемное измерение осадка пектовой кислоты
Этот метод заключается в омылении пектиновых веществ гидроокисью натрия, осаждении пектовой кислоты соляной кислотой и центрифугировании полученного осадка при 2400…2500 об/мин. точно
15 мин. Количество пектиновых веществ определяется по объему осадка пектовой кислоты после центрифугирования.
Метод основан на осаждении пектовых кислот сильными минеральными кислотами. К 200 мл исследуемого раствора прибавляют
2,5 мл 40%-ного раствора гидроокиси натрия и оставляют при комнатной температуре в течение 15 мин. Образовавшуюся пектовую кислоту осаждают 10 мл концентрированной соляной кислоты и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин. в градуированной центрифужной пробирке. Пользуясь калибровочной кривой и объемом полученного осадка, определяют концентрацию пектиновых веществ. Для построения калибровочной кривой используют данные таблицы 3.
Метод достаточно точен, результаты анализов хорошо воспроизводимы. Погрешность определения 0,01 %.
Метод можно применять только для определения концентрации данного препарата, а также для приблизительного определения пектиновой кислоты в соках, так как объем осадка зависит не только от его количества, но и от размера молекулы исходной пектиновой кислоты и, следовательно, характера осадка.
Таблица 3 – Зависимость концентрации пектиновых веществ
от объема осадка
|
Концентрация пектина, % |
Объем осадка пектовой кислоты, мл | |
|
Метиловый эфир пектовой кислоты |
Полигалактуронаны | |
|
0,05 |
0,35 |
11,0 |
|
0,10 |
0,70 |
21,5 |
|
0,15 |
0,105 |
30,0 |
|
0,20 |
0,140 |
34,5 |
|
0,25 |
0,175 |
39,7 |
|
0,30 |
0,210 |
44,0 |
4.4.4.3 Определение при помощи титрования пектовой кислоты
Полигалактуроновая кислота, являющаяся основой всех пектиновых веществ, может быть выделена из них и оттитрована раствором основания. Данные титрования достаточно точно определяют количество пектиновых или пектовых кислот в растворе или экстракте. Первой операцией при проведении определения по этому методу является осаждение пектинов ацетоном. К исследуемому раствору прибавляют при помешивании такое количество ацетона, чтобы конечная концентрация его была равной 60 %. Смесь отстаивают несколько минут и фильтруют через бумажный складчатый фильтр. Осадок промывают на фильтре 60%-ным ацетоном и смывают в тот же стакан холодной водой. Полученный водный раствор кипятится для удаления ацетона и доведения объема жидкости до 40 мл, затем его переносят в градуированный сосуд на 200 мл и охлаждают. После этого его тщательно титруют 0,1 Н гидроокисью натрия.
По окончании титрования производят щелочное омыление пектиновых веществ: к оттитрованному раствору прибавляют еще 10 мл щелочи, сосуд закрывают и отстаивают в течение 30 мин. при комнатной температуре. Избыток щелочи оттитровывают 0,1 Н соляной кислотой и прибавляют еще 50 мл 0,1 Н соляной кислоты. Содержимое перемешивают, и сосуд помещают на кипящую водяную баню на
10 мин. Затем смесь охлаждают, содержимое сосуда доводят до 200 мл, перемешивают и отфильтровывают. Отмеренное количество фильтрата титруют 0,1 Н гидроокисью натрия. В таких же условиях проводят холостой опыт. Теоретически 1 мл 0,1 Н гидроокиси натрия эквивалентен 0,177 г чистой полигалактуроновой или пектовой кислоты.
Приведенные методы прямые и достаточно точные. Недостатком их является длительность определения. Источником ошибок в этом случае может быть недостаточная очистка препарата пектина, выделяемого из исследуемого раствора и используемого для титрования.
5 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕКТИНА
ИЗ СЫРЬЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Цель работы: овладение практическими приемами по извлечению пектина из различного растительного сырья и сравнение органолептических характеристик разных видов пектина.
Продолжительность работы: 6 часов.
Оборудование и материалы:
соляная кислота (0,03 Н раствор) 2000 мл
спирт этиловый 96%-ный 1600 мл
щавелевая кислота, 0,5%-ный раствор 1500 мл
сульфат алюминия 1250 мл
аммиак 500 мл
оксалат аммония 1%-ный раствор 200 мл
ацетон 50 мл
стакан на 1 л 6 шт.
колба Бунзена 1 шт.
воронка Бюхнера 1 шт.
колба на 1 л 3 шт.
колба на 0,5 л 3 шт.
холодильник шариковый 6 шт.
баня водяная 6 шт.
Опыт 1. Из корочек плодов цитрусовых
Корочки апельсина, лимона или мандарина в количестве 50 г измельчают в мясорубке, помещают в мешочек из ткани и заливают в стакане спиртом для удаления эфирного масла, пигментов и других примесей. Стакан накрывают часовым стеклом и ставят не менее чем на 1 час на водяную баню, нагретую до 70°С. После этого материал отжимают на воронке Бюхнера и снова заливают спиртом (отработанный спирт отгоняют из раствора на водяной бане, высушивают прокаленным сульфатом меди и используют в дальнейшей работе). Операцию повторяют до тех пор, пока спиртовой экстракт будет лишь слабо окрашен в желтый цвет, на это уходит около 500 мл этанола.
Отмытую массу помещают в колбу на 500 мл, заливают 200 мл 0,03 Н НСl и нагревают 1 час на кипящей водяной бане. Горячую вытяжку фильтруют через вату, остаток дважды промывают на фильтре небольшими порциями горячей воды. После охлаждения фильтрат частично нейтрализуют аммиаком до слабокислой реакции (индикатор лакмус) и упаривают на водяной бане (желательно в вакууме) до 70 мл. К оставшемуся сиропу добавляют два объема спирта. Выпавший сырой пектин отделяют центрифугированием. Когда нужен более чистый препарат, пектин растворяют в небольшом количестве воды при нагревании и повторно осаждают спиртом. Рыхлый осадок переносят на часовое стекло и подсушивают на воздухе либо в термостате (но при температуре не выше 45°С). Остаток после удаления спирта взвешивают и определяют выход в зависимости от сорта и зрелости плодов.
Опыт 2. Из выжимок яблок
Перед извлечением пектина сушеные выжимки в количестве 100 г дробят, затем обрабатывают холодной водой в соотношении 1:2 для извлечения сахаров, кислот, солей. Пектин в холодной воде не растворяется, поэтому ее подогревают до температуры не выше, чем 10…15°С. В противном случае происходит вымывание растворимого пектина.
Экстракцию пектина производят горячей водой, подкисленной сернистой или соляной кислотой, при этом он переходит в раствор. Режим гидролиза для сушеных выжимок: соотношение выжимок и воды 1:4; температура 80…90°С; продолжительность гидролиза 1 час. Экстракт отделяется от отработанных выжимок отжимом на вакуум-фильтре.
Для очистки горячий экстракт при температуре 50…55°С фильтруют на вакуум-фильтре, затем концентрируют до объёма 140 мл и осаждают пектин из раствора этиловым спиртом. Соотношение объемного количества спирта и концентрата составляет 1,2:1. Во избежание выпадения вместе с пектином минеральных примесей в спирт после введения концентратов добавляют соляную кислоту в количестве 0,3 % и смесь перемешивают 10 мин.
Осажденный пектин отделяют от раствора путем вакуум-фильтрования. Пектин, оседающий на фильтрующей перегородке, промывают трехкратно 70%-ным этиловым спиртом, подкисленным соляной кислотой. Затем пектин отмывают от ионов хлора 60%-ным этиловым спиртом.
Далее пектин сушат на воздухе. Выход сухого пектина составляет 5 % от высушенной выжимки.
Опыт 3. Из виноградных выжимок
Измельченные и высушенные виноградные выжимки в количестве 100 г помещают в мешочек из ткани и заливают в стакане спиртом для удаления эфирного масла, пигментов и других примесей. Стакан накрывают часовым стеклом и оставляют не менее чем на 1 час при комнатной температуре. После этого, материал отжимают на воронке Бюхнера и снова заливают спиртом (отработанный спирт отгоняют из раствора на водяной бане, высушивают прокаленным сульфатом меди и используют в дальнейшей работе). Операцию повторяют до тех пор, пока спиртовой экстракт будет лишь слабо окрашен, на что требуется около 250 мл этанола.
Отмытую массу помещают в колбу на 1000 мл, заливают 500 мл раствора 0,5%-ной щавелевой кислоты и нагревают 4 часа при температуре 70С. Горячую вытяжку фильтруют через вату, остаток дважды промывают на фильтре небольшими порциями горячей воды. После охлаждения фильтрат упаривают на водяной бане (желательно в вакууме) до 150 мл. К оставшемуся сиропу добавляют этиловый спирт до полного осаждения пектина (около 180 мл). Выпавший сырой пектин отделяют центрифугированием. Когда нужен более чистый препарат, пектин растворяют в небольшом количестве воды при нагревании и повторно осаждают спиртом. Рыхлый осадок переносят на часовое стекло и подсушивают на воздухе либо в термостате (но при температуре не выше 45°С). Остаток после удаления спирта взвешивают и определяют выход. Выход колеблется от 4,15 % до 7,0 % (на сухую выжимку).
Опыт 4. Из свекловичного жома
Содержание пектиновых веществ в свекловичном жоме колеблется от 20 до 30 % на воздушно-сухую массу.
Гидролиз-экстрагирование пектина проводят из сушеного свекловичного жома в количестве 100 г 1,1…1,5%-ным раствором соляной кислоты при гидромодуле процесса 1:15. Экстрагирование проводят в течение 2 часов при температуре гидролизной смеси 75…76С. По истечении времени гидролиза-экстрагирования пектиновый экстракт охлаждают до 35…40С и отфильтровывают.
Экстракт свекловичного пектина представляет собой прозрачную жидкость светло-серого цвета; содержание пектиновых веществ в нем от 0,5 до 0,8 %; плотность экстракта – 1,01…1,02 г/см3; рН от 0,6 до 0,7.
При осаждении пектина из пектинового экстракта его обрабатывают 96%-ным этиловым спиртом, при соотношении экстракт к спирту – 1:2. Полученный коагулят отфильтровывают, промывают на фильтре от спирторастворимых балластных веществ 70%-ным этиловым спиртом, затем обезвоживают 96%-ным этанолом. Полученный таким образом пектин сушат при температуре 50…55С и измельчают.
Опыт 5. Из корзинок подсолнечника
Содержание пектиновых веществ в подсолнечнике колеблется от 24,0 до 35,7 % на воздушно-сухую массу.
Корзинки подсолнечника дробят, измельчают до частиц размером от 1 до 2 мм и направляют в количестве 100 г на гидролиз. Предварительное промывание подсолнечной сечки водой снижает выход пектина и ухудшает его свойства. Для проведения процесса экстрагирования пектина подсолнечную сечку смешивают с десятикратным количеством воды с температурой от 95 до 98С. Полученную смесь разбавляют таким же объёмом кипящей воды, содержащей от 6 до 10 г кристаллической щавелевой кислоты на литр. Экстрагирование осуществляют при температуре от 80 до 90С в течение 0,5 ч, а затем смесь фильтруют под вакуумом.
Для выделения пектина 100 весовых частей пектинового экстракта смешивают с 5,0…7,5 объёмными частями 25%-ного раствора сульфата алюминия. После тщательного перемешивания добавляют
20%-ный раствор аммиака до достижения рН среды 3,5…3,9. Коагулят отделяют, однократно промывают разбавленным спиртом, сушат и измельчают.
Первую стадию очистки (мацерацию) продукта проводят следующим образом: 100 весовых частей пектината алюминия смешивают со 100 объёмными частями 80%-ного этанола до однородной массы, добавляют 700 об. ч. соляно-кислого 45%-ного этанола (300 об. ч.
90%-ного, 300 об. ч. воды и 114 об. ч. 36%-ной НСl). Смесь размешивают в течение часа, затем в нее добавляют 200 об. ч. 95%-ного этанола (для уменьшения набухаемости частиц с целью облегчения фильтрации) и оставляют еще на 1 час. Смесь отфильтровывают и промывают на фильтре слабокислым 55…60%-ным этанолом (200 об.ч. 95%-ного этанола, 137 об. ч. воды и 20 об. ч. 36%-ной НCl) с целью полного удаления катионов, затем промывают до нейтральной реакции 70%-ным этанолом. Полученный пектин сушат при температуре 55С и измельчают.
Опыт 6. Из надземной части ревеня огородного
Надземную часть ревеня высушивают и измельчают. К 10 г сухого порошка приливают 200 мл воды и экстрагируют 2 ч при температуре 80 С. Операцию повторяют еще два раза. Экстракты процеживают через марлю, фильтруют через крупнопористые бумажные фильтры, концентрируют на водяной бане до 1/30 от первоначального объема.
К сгущенному экстракту приливают трехкратный объем 96%-ного этанола, выпавший осадок отделяют фильтрованием через бумажный фильтр, промывают смесью спирта и ацетона (1:1) и сушат. Выжимка растительного материала, оставшаяся после экстракции пектинов, используется для получения протопектина. Для этого ее трижды обрабатывают по 2 ч 200 мл 1%-ного раствора оксалата аммония при температуре 80С. Экстракты после процеживания объединяют, сгущают аналогично вышеописанной методике, обрабатывают трехкратным объемом 96%-ного этанола; раствор фильтруют, осадок протопектина промывают смесью спирта и ацетона (1:1) и сушат.
Контрольные вопросы
1. Как распределяются пектиновые вещества в составных частях цитрусового плода?
2. Какие стадии обусловливают особенности технологии цитрусового пектина?
3. Как распределяются пектиновые вещества по составным частям яблок?
4. Какие факторы влияют на содержание и качество пектиновых веществ яблок?
5. Из каких технологических стадий состоит процесс получения яблочного пектина?
6. Каковы требования к свекловичному жому, используемому в процессе получения пектина?
7. В чем особенности технологии производства пектина из надземной части ревеня огородного?
8. Назвать особенности процесса получения свекловичного пектина
9. Какие факторы влияют на содержание пектиновых веществ в соцветиях подсолнечника?
10. Каким образом влияет вид осадителя на выход подсолнечного пектина?
6 ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ПЕКТИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ
Цель работы: определение физико-химических характеристик разных видов пектина и их сравнительная оценка.
Продолжительность работы: 6 часов.
Оборудование и материалы:
бюкс 3 шт.
стакан 5 шт.
бюретка 2 шт.
колба коническая 5 шт.
колба мерная 2 шт.
фильтр стеклянный 1 шт.
тигель 3 шт.
эксикатор 1 шт.
сушильный шкаф 1 шт.
потенциометр 1 шт.
установка для дистилляции 1 шт.
печь муфельная 1 шт.
весы аналитические 1 шт.
спирт этиловый 96%-ный 1000 мл
кислота соляная концентрированная 50 мл
гидроокись натрия 10 г
фенолфталеин 10 мл
уксусная кислота 50 мл
кальций хлористый 5 г
сульфат магния 100 г
Опыт 1. Определение массовой доли влаги
Взвешенную навеску пектина массой от 0,5 до 0,8 г помещают в бюкс и высушивают в сушильном шкафу при температуре 130°С в течение 40 мин. Массовую долю влаги пектина рассчитывают по формуле:
,
где g1 – масса бюкса с навеской до сушки, г;
g2 – масса бюкса после сушки, г;
g0 – масса пустого бюкса, г.
Опыт 2. Определение рН 1%-ного раствора пектина
Порошок пектина (1 г) растворяют при перемешивании в 100 мл дистиллированной воды. Полученную смесь нагревают в течение 10...15 мин. при температуре от 50 до 60°С. Раствор декантируют от нерастворимого остатка и определяют рН потенциометром с применением стеклянного или хингидронного электрода.
Опыт 3. Определение массовой доли пектовой кислоты
Навеску пектина массой от 0,05 до 0,08 г растворяют в 20 мл дистиллированной воды со льдом и ставят на 2...3 ч для набухания и растворения пектина. Затем раствор пектина нейтрализуют по фенолфталеину, добавляя 1 мл 10%-ной соляной кислоты. В полученный раствор по каплям добавляют от 80 до 85 мл 96%-ного этилового спирта, энергично перемешивая. Через 1...2 ч образовавшийся осадок пектиновых веществ количественно переносят на плотный бумажный фильтр, промывают три раза водно-спиртовым раствором (четыре части
96%-ного спирта и одна часть воды) и один раз 96%-ным спиртом, не давая осадку высохнуть на фильтре.
Осадок количественно смывают с фильтра горячей водой в стакан вместимостью 500 мл, а фильтр помещают в отдельный стакан и промывают 2, 3 раза горячей водой. Промывные воды собирают в стакан вместимостью 500 мл, куда был смыт осадок пектина, причем количество промывной жидкости не должно превышать 200 мл. Содержимое стакана нейтрализуют по фенолфталеину 0,1 Н раствором гидроокиси натрия до слабо-розового окрашивания. Для гидролиза пектина добавляют 20 мл 0,5 Н раствора гидроокиси натрия и оставляют на 15...20 ч. Затем раствор нагревают до температуры 50...60°С и фильтруют через плотный бумажный фильтр. По окончании фильтрации фильтр промывают несколько раз горячей водой, присоединяя промывные воды к первому фильтрату. Общее количество жидкости должно быть от 275 до 300 мл. К фильтрату добавляют 50 мл 1 Н уксусной кислоты, 50 мл хлористого кальция (2 Н), перемешивают и ставят на 1 ч, после чего смесь кипятят в течение 5 мин и фильтруют через высушенный до постоянной массы и взвешенный беззольный фильтр. Осадок на фильтре промывают кипящей водой до отрицательной реакции на ион хлора (проверка по реакции Сl- с азотнокислым серебром). Затем осадок промывают 96%-ным этиловым спиртом. Фильтр с осадком высушивают в сушильном шкафу до постоянной массы.
Масса осадка принимается равной массе пектата кальция. Содержание пектовой кислоты (Пк, %) рассчитывают по формуле:
,
где G – масса бюкса с осадком после сушки, г;
G1 – навеска пектина, г;
0,92 – коэффициент пересчета пектата кальция на пектовую кислоту.
Опыт 4. Определение массовой доли балластных веществ
Навеску пектина массой от 3 до 4 г помещают в коническую колбу, заливают подкисленным спиртом (100 мл 70%-ного этилового спирта и 5 мл концентрированной соляной кислоты) и перемешивают 15 мин. Затем смесь переносят количественно на стеклянный фильтр № 2 и промывают подкисленным спиртом до отрицательной реакции на ионы кальция (с оксалатом аммония) и ионы алюминия (с ализарином).
Осадок промывают чистым 75%-ным спиртом до отрицательной реакции на ион хлора (с азотнокислым серебром), затем чистым
96%-ным спиртом и высушивают в сушильном шкафу при температуре от 80 до 85°С до постоянной массы.
Количество балластных веществ (Б, %) рассчитывают по формуле:
,
где Gn – масса пектина после промывки спиртом, г.
Опыт 5. Определение массовой доли свободных
и метоксилированных карбоксильных групп
Промытый и высушенный пектин (1 г) помещают в колбу объемом 300 мл, смачивают чистым 96%-ным этиловым спиртом для предотвращения комкования и добавляют 100 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на ночь до полного растворения пектина. Раствор титруют 0,1 Н NaOH при добавлении шести капель индикатора Хинтона до появления красного окрашивания, не исчезающего в течение 1 минуты. Для индикатора смешивают один объем 0,4%-ного бромтимолового синего, один объем 0,4%-ного крезола красного, три объема 0,4%-ного фенола красного и один объем дистиллированной воды.
Содержание свободных карбоксильных групп (Кс, %) рассчитывают по формуле:
,
где а – количество 0,1 Н раствора NaOH, израсходованное на титрование, мл; 1 мл 0,1 Н раствора NaOH соответствует 0,0045 г COOH.
В этом же растворе определяют количество метоксилированных карбоксильных групп. К нейтрализованной пробе после определения содержания свободных карбоксильных групп добавляют из бюретки 10 мл 0,5 Н NaOH. Колбу закрывают и оставляют на 2 ч при комнатной температуре для гидролиза метоксилированных карбоксильных групп. Затем к раствору добавляют из бюретки 10 мл 0,5 Н НС1 и избыток последней титруют 0,1 Н NaOH.
Количество 0,1 Н NaOH, израсходованное на второе титрование, соответствует количеству этерифицированных групп (Кэ, %) в исследуемой пробе, которое рассчитывают по формуле:
,
где b – количество 0,1 Н NaOH, израсходованное на второе титрование;
Gnв – навеска промытого и высушенного порошка пектина, г.
Для расчета количества метоксилированных карбоксильных групп необходимо вводить поправку на ацетильные группы, которые также гидролизуются при этих условиях. Количество метоксильных групп (Км, %) с учетом поправки на ацетильные группы составляет:
,
где Ац – количество ацетильных групп, %.
Опыт 6. Определение массовой доли ацетильных групп
в пектине
Навеску пектина (1,0 г) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 25 мл 0,6%-ного раствора NaOH и оставляют на
6...8 ч. Затем содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой. Отбирают 20 мл раствора в перегонную колбу, добавляют 20 мл раствора MgS04 (100 г MgS04 растворяют в воде до 180 мл и добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты).
Дистилляцию проводят, нагревая колбу на горелке, пока объем в ней не достигнет 15...20 мл, затем открывают зажим 3 от парообразователя 2 и пропускают пар (рисунок 4). Скорость пропускания пара и нагревания колбы регулируют так, чтобы в колбе поддержать постоянный объем жидкости от 15 до 20 мл. Отбирают 1 мл дистиллята и титруют в присутствии фенолфталеина 0,1 Н раствором NaOH.
1 – перегонная колба; 2 – парообразователь; 3 – зажим
Рисунок 4 Установка для определения ацетильных групп
Параллельно проводят холостой опыт с 20 мл раствора и 20 мл дистиллированной воды. Разница между титрованиями соответствует количеству ацетильных групп в порошке пектина (Ац, %), содержание которых рассчитывают по формуле:
,
где С – разность между количеством 0,1 Н раствора NaOH, израсходованного на титрование в опыте с навеской и в холостом опыте, мл;
43,04 – эквивалентная масса ацетильных групп.
Опыт 7. Определение массовой доли чистого пектина
в образце пектина
Содержание пектина (П1, %) после спиртовой обработки рассчитывают по титрометрическим данным по формуле:
,
где b – количество 0,1 Н раствора NaOH, израсходованное на определение метоксилированных карбоксильных групп, мл; 1 мл 1 Н раствора NaOH соответствует 0,0176 г деметоксилированной галактуроновой кислоты или 0,0190 г метоксилированной галактуроновой кислоты.
С учетом содержания балластных веществ Б, содержание пектина (П, %) рассчитывают по формуле:
,
где Gn – навеска пектина после промывки спиртом, г;
G1 – навеска пектина перед промывкой спиртом, г.
Опыт 8. Определение зольности пектина
Навеску пектина массой от 1,5 до 1.8 г, взятую с точностью ±0,0005 г, осторожно сжигают в предварительно прокаленном и взвешенном тигле на газовой горелке или электроплитке до прекращения выделения продуктов сгорания. Затем тигель прокаливают в муфельной печи до полного озоления навески продукта. После взвешивания тигель повторно прокаливают в течение 30 мин., охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Если разница в массе между двумя последующими взвешиваниями превысит 0,0005 г, то прокаливание повторяют.
Массовую долю общей золы (3, %) вычисляют по формуле:
,
где m – масса тигля с золой, г;
m1 – масса тигля с навеской продукта до высушивания, г;
m0 – масса тигля, г.
Расхождения между параллельными анализами не должны превышать 0,05 %.
Для определения золы, нерастворимой в 10%-ной соляной кислоте, к полученной в тигле золе приливают 30 мл 10%-ной соляной кислоты и нагревают на водяной бане в течение 30 мин., после чего жидкость фильтруют через беззольный фильтр. Остаток на фильтре промывают горячей дистиллированной водой до отрицательной реакции на ион хлора. Промытый фильтр с остатком помещают в тот же тигель, подсушивают, сжигают, прокаливают в муфеле, охлаждают и взвешивают. Количество золы Зн, нерастворимой в 10%-ной НС1 (в процентах), рассчитывают по формуле:
,
где m/ – масса тигля с золой, нерастворимой в 10%-ной соляной кислоте.
Опыт 9. Испытание желирующей способности пектина
Полученный пектин заливают 50 мл воды в фарфоровой чашке, дают постоять некоторое время для набухания, затем добавляют 25 г сахарного песка и энергично кипятят на песчаной бане 15 мин. В упаренную смесь приливают 1 мл 40%-ного раствора лимонной кислоты, хорошо перемешивают и разливают в плоские пластмассовые или фарфоровые формочки. Через 2,5 ч желе застывает и может быть использовано для анализа.
Контрольные вопросы
-
Как определяют массовую долю гидратопектина и протопектина в растительном сырье? -
Каков принцип кальций-пектатного метода? -
Какова техника выполнения объемного метода количественного определения пектиновых веществ? -
Какими основными методами определяют физико-химические свойства пектиновых веществ? -
Какой метод применяют для определения аналитических характеристик пектиновых веществ? -
Какова сущность определения комплексообразующей способности пектина? -
Перечислить основные качественные показатели пектина. -
Какую роль выполняют сахар и кислота при образовании пектинового студня? -
Как определяют степень этерификации пектина? -
Как степень этерификации пектина влияет на его желирующие свойства?
<предыдущая страница | следующая страница>