Руководство по применению назначение 3 Принцип метода 3

Руководство по применению наборов реагентов

для обнаружения специфических участков ДНК возбудителей инфекций

методом ПЦР с флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (End Point)
формат ФЛУОРОПОЛ – КТ

ОГЛАВЛЕНИЕ

РУКОВОДСТВО ПО ПРИМЕНЕНИЮ
Назначение	3
Принцип метода	3
Аналитические характеристики	3
Меры предосторожности	4
Состав набора	4
Оборудование, реагенты и материалы	5
Пробоподготовка	6
Проведение анализа	8
Условия хранения и эксплуатация набора	11
ПРИЛОЖЕНИЕ К ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ на приборе «Джин» (ДНК-Технология)
Общие сведения	12
Перед началом работы	12
Постановка реакции амплификации	14
Создание протокола измерений	15
Детекция продуктов амплификации	16
Анализ и интерпретация результатов	18
Работа с сохранённым протоколом	20
ПРИЛОЖЕНИЕ К ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ на приборе «АЛА-1/4» (НПФ «BioSan»)
Общие сведения	21
Перед началом работы	21
Постановка реакции амплификации	22
Создание протокола измерений	24
Детекция продуктов амплификации	25
Анализ и интерпретация результатов	26

ВНИМАНИЕ!
В комплектах реагентов для амплификации, выпускаемых НПФ «Литех», используется система внутреннего контроля, в которой матрицей является геномная ДНК человека, поступающая в составе пробы. Данный подход позволяет контролировать не только ингибирование и адекватность постановки реакции, но и другие параметры:

корректность забора клинической пробы;
эффективность пробоподготовки;
ошибки в проведении анализа (в т.ч. не внесение образца в амплификационную смесь);
контаминацию на ранних стадиях (до стадии, обуславливающей необходимость повтора анализа).

Данная система обуславливает некоторые особенности в интерпретации результатов анализа.

	Результат	Специфика*	ВК*	Интерпретация
K+	+	Сигнал>«+»	любой	Реакция прошла
	-	Сигнал<«-»	Сигнал>«ВК»	Реакция не прошла. НЕОБХОДИМА перестановка
	нд (na, N/A)	Сигнал<«-»	Сигнал<«ВК»
	?	«-»<Сигнал <«+»	любой
K-	нд (na, N/A)	Сигнал<«-»	Сигнал<«ВК»	Контаминация отсутствует
	-	Сигнал<«-»	Сигнал>«ВК»	Контаминация геномной ДНК человека. Перестановка НЕ ТРЕБУЕТСЯ, но рекомендуется проведение антиконтаминационных мероприятий.
	+	Сигнал>«+»	любой	Специфическая контаминация. НЕОБХОДИМА перестановка.
	?	«-»<Сигнал <«+»	любой

Искусственный образец (плазмида, культура клеток, стандарт, и т.д.)	+	Сигнал>«+»	любой	Положительная проба
	-	Сигнал<«-»	Сигнал>«ВК»	Отрицательная проба
	нд (na, N/A)	Сигнал<«-»	Сигнал<«ВК»	Отрицательная проба
	?	«-»<Сигнал <«+»	любой	Сомнительный результат. НЕОБХОДИМ повтор анализа.

Клинический образец	+	Сигнал>«+»	любой	Положительная проба
	-	Сигнал<«-»	Сигнал>«ВК»	Отрицательная проба
	?	«-»<Сигнал <«+»	любой	Сомнительный результат. НЕОБХОДИМ повтор анализа.
	нд (na, N/A)	Сигнал<«-»	Сигнал<«ВК»	Недостоверный результат. НЕОБХОДИМ повтор анализа.
фон	фон	Не интерпретируется.

* Сигнал соответствующего канала сравнивается со следующими пороговыми значениями:

- для специфического сигнала(Специфика) – положительным «+» и отрицательным «-» пороговыми значениями;

- для внутреннего контроля (ВК) – с пороговым значением внутреннего контроля «ВК».

РУКОВОДСТВО

по применению наборов реагентов для обнаружения ДНК возбудителей бактериальных и вирусных инфекций методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией «по конечной точке»

1. НАЗНАЧЕНИЕ

1.1. НПФ «Литех» выпускает наборы реагентов для выявления ДНК возбудителей инфекций методом ПЦР с детекцией результата по «конечной точке». Набор состоит из двух комплектов:

1. Комплект для выделения ДНК («ДНК-экспресс»)

2. Комплект для амплификации и последующей флуоресцентной детекцией «по конечной точке» - формат «Флуоропол- КТ»
Наборы реагентов формата ФЛУОРОПОЛ-КТ предназначены для качественного обнаружения ДНК возбудителей бактериальных и вирусных инфекций в биологических пробах (соскобы эпителиальных клеток из цервикального канала, уретры, конъюнктивы глаз, задней стенки глотки; осадок мочи, сперма, отделяемое простаты, ликвор, синовиальная жидкость, смывы из бронхов, мокрота, лейкоцитарная масса крови) методом полимеразной цепной реакции.

1.2. Наборы реагентов ФЛУОРОПОЛ-КТ могут быть использованы в клинической диагностике носительства урогенитальных инфекций, а также для оценки эффективности терапии.

1.3. Наборы предназначены только для применения in vitro. Набор имеет 2 варианта комплектации, предназначенных для амплификации и последующей флуоресцентной детекции амплифицированного фрагмента ДНК методом гибридизации с зондами: «Нераскапанный» (состоит из 5 компонентов, требующих смешения при подготовке к проведению ПЦР) и “One Step” (раскапанный в амплификационные пробирки, полностью готовые смеси под слоем масла).

2. ПРИНЦИП МЕТОДА
2.1. Принцип действия наборов формата ФЛУОРОПОЛ основан на использовании накопления флуоресценции от разрушения флуоресцентно-меченных зондов, определяющих специфические участки ампликонов в процессе ПЦР (оценка «ПЦР в реальном времени») или по окончании ПЦР (оценка «ПЦР по конечной точке»).

В методе «ПЦР по конечной точке» (ПЦР-КТ) в отличие от «ПЦР в реальном времени» измерение флуоресценции происходит строго относительно фоновых значений отдельно от амплификатора в специальном флуориметре.

Флуоресцентная детекция не требует открывания пробирок после проведения ПЦР и извлечения из них продуктов реакции, что значительно снижает опасность контаминации помещения и реагентов ампликонами.

Анализ проб с использованием набора ФЛУОРОПОЛ «ПЦР-КТ» включает 3 этапа:

1. Обработка биологической пробы (выделение ДНК).

2. Постановка реакции ПЦР-амплификации.

3. Флуориметрическая детекция продуктов амплификации.

3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1. Специфичность анализа - 100%.

Специфичность определяется олигонуклеотидными затравками (праймерами), подобранными к гомологичным участкам видоспецифичных генов возбудителей, а также специфичными флуоресцентными олигонуклеотидными зондами, гибридизующимися с комплементарным участком ампликона (специфического продукта амплификации).

бактероидов (Bacteroides spp.).

вирусов простого герпеса (Herpes Simplex virus) 1 и 2 типа,

вируса Эпштейн-Барр (Epstein-Barr virus)

гарднерелл (Gardnerella vaginalis),

гонококка (Neisseria gonorrhoeae),

лактобацилл (Lactobacillus spp.)

микоплазм (Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium),

мобилункуса ( Mobiluncus curtisii)

трихомонад (Trichomonas vaginalis),

уреаплазм (Ureaplasma urealyticum+ parva),

хламидий (Chlamydia trachomatis),

цитомегаловируса (Cytomegalovirus),

3.2. Чувствительность анализа для некоторых патогенов составляет:
бактероидов (Bacteroides spp.) – 10⁴геном-эквивалентов/мл

вируса простого герпеса (Herpes Simplex virus) 1 типа - 10³геном-эквивалентов/мл

вируса простого герпеса (Herpes Simplex virus) 2 типа -10³геном-эквивалентов/мл

вируса Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus)- 10⁴геном-эквивалентов/мл

гарднерелл (Gardnerella vaginalis) – 10⁵геном-эквивалентов/мл

гонококка (Neisseria gonorrhoeae) - 10³геном-эквивалентов/мл

лактобацилл (Lactobacillus spp.) – 10⁶геном-эквивалентов/мл

микоплазм (Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium) – 10⁴геном-эквивалентов/мл

мобилункуса ( Mobiluncus curtisii) – 10⁴геном-эквивалентов/мл

трихомонад (Trichomonas vaginalis) - 10³геном-эквивалентов/мл

уреаплазм (Ureaplasma urealyticum+parva ) – 10⁴геном-эквивалентов/мл

хламидий (Chlamydia trachomatis) - 10³геном-эквивалентов/мл

цитомегаловируса (Cytomegalovirus) - 10³геном-эквивалентов/мл

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

4.1. Потенциальный риск применения набора – класс 2б.

4.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

4.3. Меры предосторожности - соблюдение “Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР” (Москва, 1981 г.).

4.4. При работе с анализируемым биоматериалом следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. биологический материал человека может являться источником инфекционных или вирусных заболеваний.

СОСТАВ НАБОРА

5.1. Комплект для пробоподготовки (выделение ДНК) – это реагент в пробирках для транспортировки и выделения ДНК из биопроб с целью последующего анализа методом полимеразной цепной реакции («ДНК-ЭКСПРЕСС- неокрашенный»).
Комплект «ДНК-ЭКСПРЕСС- неокрашенный» состоит из пробирок типа Эппендорфф объемом 1,5 мл с защелкивающейся крышкой, содержащих по 200 мкл реагента.
Комплект на 100 определений ………………... 100 пробирок (по 200 мкл реагента)
5.2. Комплекты реагентов для проведения ПЦР-амплификации формата Флуоропол:
1) БАКТОПОЛ (Bacteroides spp).

2) ГАРДПОЛ (Gardnerella vaginalis)

3) ГЕРПОЛ I (Herpes Simplex virus type 1)

4) ГЕРПОЛ II (Herpes Simplex virus type 2)

5) ГЕРПОЛ I+II (Herpes Simplex virus type 1+2)

6) ГОНОПОЛ (Neisseria gonorrhoeae) )

7) ЛАКТОПОЛ (Lactobacillus spp.)

8) МОБИКУТ ( Mobiluncus curtisii)

9) ПОЛИМИК-2 (Mycoplasma genitalium),

10) ПОЛИМИК-Мк (Mycoplasma hominis)

11) ПОЛИМИК-Ур (Ureaplasma urealyticum + parva)

12) ПОЛИМИК-Хл (Chlamydia trachomatis);

13) ТРИПОЛ (Trichomonas vaginalis)

14) ЦИТОПОЛ (Cytomegalovirus)

15) ЭБАПОЛ (Epstein- Barr virus)
Комплекты реагентов для проведения ПЦР-амплификации выпускаются отдельно для каждого вида возбудителя и отличаются комплектацией, специфическими праймерами и зондом, входящими в состав реакционной смеси.

Состав комплекта

Количество

Комплектация

1.Реакционная смесь* 5 х концентрат

2. Taq-полимераза……………………………………..

3. Разбавитель………………………………………….

4. Минеральное масло……………………………...…

5. Положительный контрольный образец ДНК…….

6. Реактив «ДНК-экспресс»

1 пробирка – 680 мкл

1 пробирка – 30 мкл

1 пробирка – 2 мл

2 пробирки – 2 мл

1 пробирка – 60 мкл

1 пробирка – 100 мкл

“нераскапанные”

1. Пробирки 0,5 мл с готовой реакционной смесью

2. Прибирки 0,5 мл с фоновой смесью

3. Пробирка с положительным контролем

4. Пробирка с разбавителем

54 шт.

6 шт

1 шт - 55 мкл

1 шт - 100 мкл

“One Step”

Комплекты для проведения амплификации включают готовые к применению реагенты.

* В состав реакционной смеси входят:

раствор дНТФ;
раствор специфичных праймеров для каждого возбудителя;
Real-Time ПЦР-буфер;
флуоресцентные зонды (2 зонда): зонд для специфического фрагмента содержит флуорофор FAM, зонд для внутреннего контроля содержит флуорофор HEX;
праймеры для выявления внутреннего контроля (геномная ДНК человека); внутренний контроль позволяет контролировать процесс прохождения реакции амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ, ингибирующих полимеразную цепную реакцию и качество выделения ДНК.

5.3. Флуоресцентная детекция:

Флуоресцентная детекция продуктов ПЦР-амплификации в режиме «конечная точка» проводится после её проведения в соответствии с прилагаемой к прибору инструкцией и не требует дополнительного комплекта реагентов для детекции.

ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ

1 этап – выделение ДНК из биопробы

реагент в пробирках для выделения ДНК из биопроб «ДНК-ЭКСПРЕСС» неокрашенный;
ламинарный бокс 2 класса защиты;
высокоскоростная центрифуга для пробирок 1,5 мл 8 – 12 тыс.об/мин;
микроцентрифуга-вортекс 1,5 – 3 тыс.об/мин (или вортекс);
твердотельный термостат для пробирок 1,5 мл типа Эппендорфф, поддерживающий

температуру до 99^оС;

пипетки-дозаторы переменного объема (5-50; 20-200; 100-1000 мкл);
штативы для пробирок 1,5 мл «рабочее место»;
штатив для хранения пробирок 1,5 мл;
холодильник с морозильной камерой для хранения исходных реагентов и анализируемых образцов

следующая страница>