Руководство по применению наборов реагентов
для обнаружения специфических участков ДНК возбудителей инфекций
методом ПЦР с флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (End Point)
формат ФЛУОРОПОЛ – КТ
ОГЛАВЛЕНИЕ
-
РУКОВОДСТВО ПО ПРИМЕНЕНИЮ
|
Назначение
|
3
|
Принцип метода
|
3
|
Аналитические характеристики
|
3
|
Меры предосторожности
|
4
|
Состав набора
|
4
|
Оборудование, реагенты и материалы
|
5
|
Пробоподготовка
|
6
|
Проведение анализа
|
8
|
Условия хранения и эксплуатация набора
|
11
|
ПРИЛОЖЕНИЕ К ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ на приборе «Джин» (ДНК-Технология)
|
Общие сведения
|
12
|
Перед началом работы
|
12
|
Постановка реакции амплификации
|
14
|
Создание протокола измерений
|
15
|
Детекция продуктов амплификации
|
16
|
Анализ и интерпретация результатов
|
18
|
Работа с сохранённым протоколом
|
20
|
ПРИЛОЖЕНИЕ К ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ на приборе «АЛА-1/4» (НПФ «BioSan»)
|
Общие сведения
|
21
|
Перед началом работы
|
21
|
Постановка реакции амплификации
|
22
|
Создание протокола измерений
|
24
|
Детекция продуктов амплификации
|
25
|
Анализ и интерпретация результатов
|
26
|
ВНИМАНИЕ!
В комплектах реагентов для амплификации, выпускаемых НПФ «Литех», используется система внутреннего контроля, в которой матрицей является геномная ДНК человека, поступающая в составе пробы. Данный подход позволяет контролировать не только
ингибирование и
адекватность постановки реакции, но и другие параметры:
-
корректность забора клинической пробы;
-
эффективность пробоподготовки;
-
ошибки в проведении анализа (в т.ч. не внесение образца в амплификационную смесь);
-
контаминацию на ранних стадиях (до стадии, обуславливающей необходимость повтора анализа).
Данная система обуславливает некоторые особенности в интерпретации результатов анализа.
|
Результат
|
Специфика*
|
ВК*
|
Интерпретация
|
K+
|
+
|
Сигнал>«+»
|
любой
|
Реакция прошла
|
-
|
Сигнал<«-»
|
Сигнал>«ВК»
|
Реакция не прошла.
НЕОБХОДИМА перестановка
|
нд (na, N/A)
|
Сигнал<«-»
|
Сигнал<«ВК»
|
?
|
«-»<Сигнал <«+»
|
любой
|
K-
|
нд (na, N/A)
|
Сигнал<«-»
|
Сигнал<«ВК»
|
Контаминация отсутствует
|
-
|
Сигнал<«-»
|
Сигнал>«ВК»
|
Контаминация геномной ДНК человека.
Перестановка НЕ ТРЕБУЕТСЯ,
но рекомендуется проведение антиконтаминационных мероприятий.
|
+
|
Сигнал>«+»
|
любой
|
Специфическая контаминация.
НЕОБХОДИМА перестановка.
|
?
|
«-»<Сигнал <«+»
|
любой
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Искусственный образец (плазмида, культура клеток, стандарт, и т.д.)
|
+
|
Сигнал>«+»
|
любой
|
Положительная проба
|
-
|
Сигнал<«-»
|
Сигнал>«ВК»
|
Отрицательная проба
|
нд (na, N/A)
|
Сигнал<«-»
|
Сигнал<«ВК»
|
?
|
«-»<Сигнал <«+»
|
любой
|
Сомнительный результат.
НЕОБХОДИМ повтор анализа.
|
Клинический образец
|
+
|
Сигнал>«+»
|
любой
|
Положительная проба
|
-
|
Сигнал<«-»
|
Сигнал>«ВК»
|
Отрицательная проба
|
?
|
«-»<Сигнал <«+»
|
любой
|
Сомнительный результат.
НЕОБХОДИМ повтор анализа.
|
нд (na, N/A)
|
Сигнал<«-»
|
Сигнал<«ВК»
|
Недостоверный результат.
НЕОБХОДИМ повтор анализа.
|
фон
|
фон
|
Не интерпретируется.
|
* Сигнал соответствующего канала сравнивается со следующими пороговыми значениями:
- для специфического сигнала(Специфика) – положительным «+» и отрицательным «-» пороговыми значениями;
- для внутреннего контроля (ВК) – с пороговым значением внутреннего контроля «ВК».
РУКОВОДСТВО
по применению наборов реагентов для обнаружения ДНК возбудителей бактериальных и вирусных инфекций методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией «по конечной точке»
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. НПФ «Литех» выпускает наборы реагентов для выявления ДНК возбудителей инфекций методом ПЦР с детекцией результата по «конечной точке». Набор состоит из двух комплектов:
1. Комплект для выделения ДНК («ДНК-экспресс»)
2. Комплект для амплификации и последующей флуоресцентной детекцией «по конечной точке» - формат «Флуоропол- КТ»
Наборы реагентов формата ФЛУОРОПОЛ-КТ предназначены для качественного обнаружения ДНК возбудителей бактериальных и вирусных инфекций в биологических пробах (соскобы эпителиальных клеток из цервикального канала, уретры, конъюнктивы глаз, задней стенки глотки; осадок мочи, сперма, отделяемое простаты, ликвор, синовиальная жидкость, смывы из бронхов, мокрота, лейкоцитарная масса крови) методом полимеразной цепной реакции.
1.2. Наборы реагентов ФЛУОРОПОЛ-КТ могут быть использованы в клинической диагностике носительства урогенитальных инфекций, а также для оценки эффективности терапии.
1.3. Наборы предназначены только для применения
in vitro. Набор имеет 2 варианта комплектации, предназначенных для амплификации и последующей флуоресцентной детекции амплифицированного фрагмента ДНК методом гибридизации с зондами: «Нераскапанный» (состоит из 5 компонентов, требующих смешения при подготовке к проведению ПЦР) и “One Step” (раскапанный в амплификационные пробирки, полностью готовые смеси под слоем масла).
2. ПРИНЦИП МЕТОДА
2.1
. Принцип действия наборов формата ФЛУОРОПОЛ основан на использовании накопления флуоресценции от разрушения флуоресцентно-меченных зондов, определяющих специфические участки ампликонов в процессе ПЦР (оценка «ПЦР в реальном времени») или по окончании ПЦР (оценка «ПЦР по конечной точке»).
В методе «ПЦР по конечной точке» (ПЦР-КТ) в отличие от «ПЦР в реальном времени» измерение флуоресценции происходит строго относительно фоновых значений отдельно от амплификатора в специальном флуориметре.
Флуоресцентная детекция не требует открывания пробирок после проведения ПЦР и извлечения из них продуктов реакции, что значительно снижает опасность контаминации помещения и реагентов ампликонами.
Анализ проб с использованием набора ФЛУОРОПОЛ «ПЦР-КТ» включает 3 этапа:
1. Обработка биологической пробы (выделение ДНК).
2. Постановка реакции ПЦР-амплификации.
3. Флуориметрическая детекция продуктов амплификации.
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1. Специфичность анализа - 100%.
Специфичность определяется олигонуклеотидными затравками (праймерами), подобранными к гомологичным участкам видоспецифичных генов возбудителей, а также специфичными флуоресцентными олигонуклеотидными зондами, гибридизующимися с комплементарным участком ампликона (специфического продукта амплификации).
бактероидов (
Bacteroides spp.)
.
вирусов простого герпеса (Herpes Simplex virus) 1 и 2 типа,
вируса Эпштейн-Барр (Epstein-Barr virus)
гарднерелл (Gardnerella vaginalis),
гонококка (Neisseria gonorrhoeae),
лактобацилл (Lactobacillus spp.)
микоплазм (Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium),
мобилункуса ( Mobiluncus curtisii)
трихомонад (Trichomonas vaginalis),
уреаплазм (Ureaplasma urealyticum+ parva),
хламидий (Chlamydia trachomatis),
цитомегаловируса (Cytomegalovirus),
3.2. Чувствительность анализа для некоторых патогенов составляет:
бактероидов (
Bacteroides spp.) – 10
4 геном-эквивалентов/мл
вируса простого герпеса (Herpes Simplex virus) 1 типа - 103 геном-эквивалентов/мл
вируса простого герпеса (Herpes Simplex virus) 2 типа -103 геном-эквивалентов/мл
вируса Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus)- 104 геном-эквивалентов/мл
гарднерелл (Gardnerella vaginalis) – 105 геном-эквивалентов/мл
гонококка (Neisseria gonorrhoeae) - 103 геном-эквивалентов/мл
лактобацилл (Lactobacillus spp.) – 106 геном-эквивалентов/мл
микоплазм (Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium) – 104 геном-эквивалентов/мл
мобилункуса ( Mobiluncus curtisii) – 104 геном-эквивалентов/мл
трихомонад (Trichomonas vaginalis) - 103 геном-эквивалентов/мл
уреаплазм (Ureaplasma urealyticum+parva ) – 104 геном-эквивалентов/мл
хламидий (Chlamydia trachomatis) - 103 геном-эквивалентов/мл
цитомегаловируса (
Cytomegalovirus) - 10
3 геном-эквивалентов/мл
-
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
4.1. Потенциальный риск применения набора – класс 2б.
4.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.
4.3. Меры предосторожности - соблюдение “Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР” (Москва, 1981 г.).
4.4. При работе с анализируемым биоматериалом следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. биологический материал человека может являться источником инфекционных или вирусных заболеваний.
-
СОСТАВ НАБОРА
5.1. Комплект для пробоподготовки (выделение ДНК) – это реагент в пробирках для транспортировки и выделения ДНК из биопроб с целью последующего анализа методом полимеразной цепной реакции («ДНК-ЭКСПРЕСС- неокрашенный»).
Комплект «ДНК-ЭКСПРЕСС- неокрашенный» состоит из пробирок типа Эппендорфф объемом 1,5 мл с защелкивающейся крышкой, содержащих по 200 мкл реагента.
Комплект на 100 определений ………………... 100 пробирок (по 200 мкл реагента)
5.2. Комплекты реагентов для проведения ПЦР-амплификации формата Флуоропол:
1) БАКТОПОЛ (
Bacteroides spp).
2) ГАРДПОЛ (
Gardnerella vaginalis)
3) ГЕРПОЛ I (
Herpes Simplex virus type 1)
4) ГЕРПОЛ II (
Herpes Simplex virus type 2)
5) ГЕРПОЛ I+II (
Herpes Simplex virus type 1+2)
6) ГОНОПОЛ (
Neisseria gonorrhoeae) )
7) ЛАКТОПОЛ (Lactobacillus spp.)
8) МОБИКУТ ( Mobiluncus curtisii)
9) ПОЛИМИК-2 (
Mycoplasma genitalium),
10) ПОЛИМИК-Мк (
Mycoplasma hominis)
11) ПОЛИМИК-Ур (
Ureaplasma urealyticum + parva)
12) ПОЛИМИК-Хл (
Chlamydia trachomatis)
;
13) ТРИПОЛ (
Trichomonas vaginalis)
14) ЦИТОПОЛ (
Cytomegalovirus)
15) ЭБАПОЛ (Epstein- Barr virus)
Комплекты реагентов для проведения ПЦР-амплификации выпускаются отдельно для каждого вида возбудителя и отличаются комплектацией, специфическими праймерами и зондом, входящими в состав реакционной смеси.
-
Состав комплекта
|
Количество
|
Комплектация
|
1.Реакционная смесь* 5 х концентрат
2. Taq-полимераза……………………………………..
3. Разбавитель………………………………………….
4. Минеральное масло……………………………...…
5. Положительный контрольный образец ДНК…….
6. Реактив «ДНК-экспресс»
|
1 пробирка – 680 мкл
1 пробирка – 30 мкл
1 пробирка – 2 мл
2 пробирки – 2 мл
1 пробирка – 60 мкл
1 пробирка – 100 мкл
|
“нераскапанные”
|
1. Пробирки 0,5 мл с готовой реакционной смесью
2. Прибирки 0,5 мл с фоновой смесью
3. Пробирка с положительным контролем
4. Пробирка с разбавителем
|
54 шт.
6 шт
1 шт - 55 мкл
1 шт - 100 мкл
|
“One Step”
|
К
омплекты для проведения амплификации включают готовые к применению реагенты.
* В состав реакционной смеси входят:
-
раствор дНТФ;
-
раствор специфичных праймеров для каждого возбудителя;
-
Real-Time ПЦР-буфер;
-
флуоресцентные зонды (2 зонда): зонд для специфического фрагмента содержит флуорофор FAM, зонд для внутреннего контроля содержит флуорофор HEX;
-
праймеры для выявления внутреннего контроля (геномная ДНК человека); внутренний контроль позволяет контролировать процесс прохождения реакции амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ, ингибирующих полимеразную цепную реакцию и качество выделения ДНК.
5.3. Флуоресцентная детекция:
Флуоресцентная детекция продуктов ПЦР-амплификации в режиме «конечная точка» проводится после её проведения в соответствии с прилагаемой к прибору инструкцией и не требует дополнительного комплекта реагентов для детекции.
-
ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ
1 этап – выделение ДНК из биопробы
-
реагент в пробирках для выделения ДНК из биопроб «ДНК-ЭКСПРЕСС» неокрашенный;
-
ламинарный бокс 2 класса защиты;
-
высокоскоростная центрифуга для пробирок 1,5 мл 8 – 12 тыс.об/мин;
-
микроцентрифуга-вортекс 1,5 – 3 тыс.об/мин (или вортекс);
-
твердотельный термостат для пробирок 1,5 мл типа Эппендорфф, поддерживающий
температуру до 99
оС;
-
пипетки-дозаторы переменного объема (5-50; 20-200; 100-1000 мкл);
-
штативы для пробирок 1,5 мл «рабочее место»;
-
штатив для хранения пробирок 1,5 мл;
-
холодильник с морозильной камерой для хранения исходных реагентов и анализируемых образцов
следующая страница>