Flatik.ru

Перейти на главную страницу

Поиск по ключевым словам:

страница 1страница 2 ... страница 5страница 6
Руководство по применению наборов реагентов

для обнаружения специфических участков ДНК возбудителей инфекций

методом ПЦР с флуоресцентной детекцией по «конечной точке» (End Point)
формат ФЛУОРОПОЛ – КТ

ОГЛАВЛЕНИЕ

РУКОВОДСТВО ПО ПРИМЕНЕНИЮ

Назначение

3

Принцип метода

3

Аналитические характеристики

3

Меры предосторожности

4

Состав набора

4

Оборудование, реагенты и материалы

5

Пробоподготовка

6

Проведение анализа

8

Условия хранения и эксплуатация набора

11

ПРИЛОЖЕНИЕ К ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ на приборе «Джин» (ДНК-Технология)

Общие сведения

12

Перед началом работы

12

Постановка реакции амплификации

14

Создание протокола измерений

15

Детекция продуктов амплификации

16

Анализ и интерпретация результатов

18

Работа с сохранённым протоколом

20

ПРИЛОЖЕНИЕ К ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ на приборе «АЛА-1/4» (НПФ «BioSan»)

Общие сведения

21

Перед началом работы

21

Постановка реакции амплификации

22

Создание протокола измерений

24

Детекция продуктов амплификации

25

Анализ и интерпретация результатов

26


ВНИМАНИЕ!
В комплектах реагентов для амплификации, выпускаемых НПФ «Литех», используется система внутреннего контроля, в которой матрицей является геномная ДНК человека, поступающая в составе пробы. Данный подход позволяет контролировать не только ингибирование и адекватность постановки реакции, но и другие параметры:


  • корректность забора клинической пробы;

  • эффективность пробоподготовки;

  • ошибки в проведении анализа (в т.ч. не внесение образца в амплификационную смесь);

  • контаминацию на ранних стадиях (до стадии, обуславливающей необходимость повтора анализа).

Данная система обуславливает некоторые особенности в интерпретации результатов анализа.







Результат

Специфика*

ВК*

Интерпретация

K+

+

Сигнал>«+»

любой

Реакция прошла

-

Сигнал<«-»

Сигнал>«ВК»

Реакция не прошла.

НЕОБХОДИМА перестановка



нд (na, N/A)

Сигнал<«-»

Сигнал<«ВК»

?

«-»<Сигнал <«+»

любой

K-

нд (na, N/A)

Сигнал<«-»

Сигнал<«ВК»

Контаминация отсутствует

-

Сигнал<«-»

Сигнал>«ВК»

Контаминация геномной ДНК человека.

Перестановка НЕ ТРЕБУЕТСЯ,



но рекомендуется проведение антиконтаминационных мероприятий.

+

Сигнал>«+»

любой

Специфическая контаминация.

НЕОБХОДИМА перестановка.



?

«-»<Сигнал <«+»

любой






















































































Искусственный образец (плазмида, культура клеток, стандарт, и т.д.)

+

Сигнал>«+»

любой

Положительная проба

-

Сигнал<«-»

Сигнал>«ВК»

Отрицательная проба

нд (na, N/A)

Сигнал<«-»

Сигнал<«ВК»

?

«-»<Сигнал <«+»

любой

Сомнительный результат.

НЕОБХОДИМ повтор анализа.





Клинический образец

+

Сигнал>«+»

любой

Положительная проба

-

Сигнал<«-»

Сигнал>«ВК»

Отрицательная проба

?

«-»<Сигнал <«+»

любой

Сомнительный результат.

НЕОБХОДИМ повтор анализа.



нд (na, N/A)

Сигнал<«-»

Сигнал<«ВК»

Недостоверный результат.

НЕОБХОДИМ повтор анализа.



фон

фон

Не интерпретируется.


* Сигнал соответствующего канала сравнивается со следующими пороговыми значениями:

- для специфического сигнала(Специфика) – положительным «+» и отрицательным «-» пороговыми значениями;

- для внутреннего контроля (ВК) – с пороговым значением внутреннего контроля «ВК».

РУКОВОДСТВО

по применению наборов реагентов для обнаружения ДНК возбудителей бактериальных и вирусных инфекций методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией «по конечной точке»


1. НАЗНАЧЕНИЕ

1.1. НПФ «Литех» выпускает наборы реагентов для выявления ДНК возбудителей инфекций методом ПЦР с детекцией результата по «конечной точке». Набор состоит из двух комплектов:



1. Комплект для выделения ДНК («ДНК-экспресс»)

2. Комплект для амплификации и последующей флуоресцентной детекцией «по конечной точке» - формат «Флуоропол- КТ»
Наборы реагентов формата ФЛУОРОПОЛ-КТ предназначены для качественного обнаружения ДНК возбудителей бактериальных и вирусных инфекций в биологических пробах (соскобы эпителиальных клеток из цервикального канала, уретры, конъюнктивы глаз, задней стенки глотки; осадок мочи, сперма, отделяемое простаты, ликвор, синовиальная жидкость, смывы из бронхов, мокрота, лейкоцитарная масса крови) методом полимеразной цепной реакции.

1.2. Наборы реагентов ФЛУОРОПОЛ-КТ могут быть использованы в клинической диагностике носительства урогенитальных инфекций, а также для оценки эффективности терапии.

1.3. Наборы предназначены только для применения in vitro. Набор имеет 2 варианта комплектации, предназначенных для амплификации и последующей флуоресцентной детекции амплифицированного фрагмента ДНК методом гибридизации с зондами: «Нераскапанный» (состоит из 5 компонентов, требующих смешения при подготовке к проведению ПЦР) и “One Step” (раскапанный в амплификационные пробирки, полностью готовые смеси под слоем масла).


2. ПРИНЦИП МЕТОДА
2.1. Принцип действия наборов формата ФЛУОРОПОЛ основан на использовании накопления флуоресценции от разрушения флуоресцентно-меченных зондов, определяющих специфические участки ампликонов в процессе ПЦР (оценка «ПЦР в реальном времени») или по окончании ПЦР (оценка «ПЦР по конечной точке»).

В методе «ПЦР по конечной точке» (ПЦР-КТ) в отличие от «ПЦР в реальном времени» измерение флуоресценции происходит строго относительно фоновых значений отдельно от амплификатора в специальном флуориметре.

Флуоресцентная детекция не требует открывания пробирок после проведения ПЦР и извлечения из них продуктов реакции, что значительно снижает опасность контаминации помещения и реагентов ампликонами.

Анализ проб с использованием набора ФЛУОРОПОЛ «ПЦР-КТ» включает 3 этапа:

1. Обработка биологической пробы (выделение ДНК).

2. Постановка реакции ПЦР-амплификации.

3. Флуориметрическая детекция продуктов амплификации.


3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1. Специфичность анализа - 100%.

Специфичность определяется олигонуклеотидными затравками (праймерами), подобранными к гомологичным участкам видоспецифичных генов возбудителей, а также специфичными флуоресцентными олигонуклеотидными зондами, гибридизующимися с комплементарным участком ампликона (специфического продукта амплификации).


бактероидов (Bacteroides spp.).

вирусов простого герпеса (Herpes Simplex virus) 1 и 2 типа,

вируса Эпштейн-Барр (Epstein-Barr virus)

гарднерелл (Gardnerella vaginalis),

гонококка (Neisseria gonorrhoeae),

лактобацилл (Lactobacillus spp.)

микоплазм (Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium),

мобилункуса ( Mobiluncus curtisii)

трихомонад (Trichomonas vaginalis),

уреаплазм (Ureaplasma urealyticum+ parva),

хламидий (Chlamydia trachomatis),

цитомегаловируса (Cytomegalovirus),


3.2. Чувствительность анализа для некоторых патогенов составляет:
бактероидов (Bacteroides spp.) – 104 геном-эквивалентов/мл

вируса простого герпеса (Herpes Simplex virus) 1 типа - 103 геном-эквивалентов/мл

вируса простого герпеса (Herpes Simplex virus) 2 типа -103 геном-эквивалентов/мл

вируса Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus)- 104 геном-эквивалентов/мл

гарднерелл (Gardnerella vaginalis) – 105 геном-эквивалентов/мл

гонококка (Neisseria gonorrhoeae) - 103 геном-эквивалентов/мл

лактобацилл (Lactobacillus spp.) – 106 геном-эквивалентов/мл

микоплазм (Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium) – 104 геном-эквивалентов/мл

мобилункуса ( Mobiluncus curtisii) – 104 геном-эквивалентов/мл

трихомонад (Trichomonas vaginalis) - 103 геном-эквивалентов/мл

уреаплазм (Ureaplasma urealyticum+parva ) – 104 геном-эквивалентов/мл

хламидий (Chlamydia trachomatis) - 103 геном-эквивалентов/мл



цитомегаловируса (Cytomegalovirus) - 103 геном-эквивалентов/мл


  1. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ


4.1. Потенциальный риск применения набора – класс 2б.

4.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

4.3. Меры предосторожности - соблюдение “Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР” (Москва, 1981 г.).

4.4. При работе с анализируемым биоматериалом следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. биологический материал человека может являться источником инфекционных или вирусных заболеваний.


  1. СОСТАВ НАБОРА


5.1. Комплект для пробоподготовки (выделение ДНК) – это реагент в пробирках для транспортировки и выделения ДНК из биопроб с целью последующего анализа методом полимеразной цепной реакции («ДНК-ЭКСПРЕСС- неокрашенный»).
Комплект «ДНК-ЭКСПРЕСС- неокрашенный» состоит из пробирок типа Эппендорфф объемом 1,5 мл с защелкивающейся крышкой, содержащих по 200 мкл реагента.
Комплект на 100 определений ………………... 100 пробирок (по 200 мкл реагента)
5.2. Комплекты реагентов для проведения ПЦР-амплификации формата Флуоропол:
1) БАКТОПОЛ (Bacteroides spp).

2) ГАРДПОЛ (Gardnerella vaginalis)

3) ГЕРПОЛ I (Herpes Simplex virus type 1)

4) ГЕРПОЛ II (Herpes Simplex virus type 2)

5) ГЕРПОЛ I+II (Herpes Simplex virus type 1+2)

6) ГОНОПОЛ (Neisseria gonorrhoeae) )

7) ЛАКТОПОЛ (Lactobacillus spp.)

8) МОБИКУТ ( Mobiluncus curtisii)

9) ПОЛИМИК-2 (Mycoplasma genitalium),

10) ПОЛИМИК-Мк (Mycoplasma hominis)

11) ПОЛИМИК-Ур (Ureaplasma urealyticum + parva)

12) ПОЛИМИК-Хл (Chlamydia trachomatis);

13) ТРИПОЛ (Trichomonas vaginalis)

14) ЦИТОПОЛ (Cytomegalovirus)

15) ЭБАПОЛ (Epstein- Barr virus)
Комплекты реагентов для проведения ПЦР-амплификации выпускаются отдельно для каждого вида возбудителя и отличаются комплектацией, специфическими праймерами и зондом, входящими в состав реакционной смеси.


Состав комплекта

Количество

Комплектация

1.Реакционная смесь* 5 х концентрат

2. Taq-полимераза……………………………………..

3. Разбавитель………………………………………….

4. Минеральное масло……………………………...…

5. Положительный контрольный образец ДНК…….

6. Реактив «ДНК-экспресс»



1 пробирка – 680 мкл

1 пробирка – 30 мкл

1 пробирка – 2 мл

2 пробирки – 2 мл

1 пробирка – 60 мкл

1 пробирка – 100 мкл



“нераскапанные”




1. Пробирки 0,5 мл с готовой реакционной смесью

2. Прибирки 0,5 мл с фоновой смесью

3. Пробирка с положительным контролем

4. Пробирка с разбавителем



54 шт.

6 шт


1 шт - 55 мкл

1 шт - 100 мкл



“One Step”






Комплекты для проведения амплификации включают готовые к применению реагенты.

* В состав реакционной смеси входят:

  • раствор дНТФ;

  • раствор специфичных праймеров для каждого возбудителя;

  • Real-Time ПЦР-буфер;

  • флуоресцентные зонды (2 зонда): зонд для специфического фрагмента содержит флуорофор FAM, зонд для внутреннего контроля содержит флуорофор HEX;

  • праймеры для выявления внутреннего контроля (геномная ДНК человека); внутренний контроль позволяет контролировать процесс прохождения реакции амплификации, а также тестировать наличие в пробах веществ, ингибирующих полимеразную цепную реакцию и качество выделения ДНК.


5.3. Флуоресцентная детекция:

Флуоресцентная детекция продуктов ПЦР-амплификации в режиме «конечная точка» проводится после её проведения в соответствии с прилагаемой к прибору инструкцией и не требует дополнительного комплекта реагентов для детекции.




  1. ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ


1 этап – выделение ДНК из биопробы

  • реагент в пробирках для выделения ДНК из биопроб «ДНК-ЭКСПРЕСС» неокрашенный;

  • ламинарный бокс 2 класса защиты;

  • высокоскоростная центрифуга для пробирок 1,5 мл 8 – 12 тыс.об/мин;

  • микроцентрифуга-вортекс 1,5 – 3 тыс.об/мин (или вортекс);

  • твердотельный термостат для пробирок 1,5 мл типа Эппендорфф, поддерживающий

температуру до 99оС;

  • пипетки-дозаторы переменного объема (5-50; 20-200; 100-1000 мкл);

  • штативы для пробирок 1,5 мл «рабочее место»;

  • штатив для хранения пробирок 1,5 мл;

  • холодильник с морозильной камерой для хранения исходных реагентов и анализируемых образцов




следующая страница>


Руководство по применению назначение 3 Принцип метода 3

Нпф «Литех», используется система внутреннего контроля, в которой матрицей является геномная ДНК человека, поступающая в составе пробы. Данный подход позволяет контролировать не то

781.19kb.

15 12 2014
6 стр.


Инструкция по применению назначение

Наколенник применяется для лечения различных воспалительных процессов и снятия болевого синдрома коленного сустава. Применяется как в виде самостоятельного безлекарственного метода

25.51kb.

14 12 2014
1 стр.


Руководство по применению 1 сетевой кабель 1 ключ для крышки

Данное руководство по эксплуатации, ознакомьтесь с операциями управления и следуйте указаниям

89.77kb.

16 12 2014
1 стр.


1. Приведите характеристику тонкослойной хроматографии (тсх). Сущность метода. Разновидности тсх. Назначение

Приведите характеристику тонкослойной хроматографии (тсх). Сущность метода. Разновидности тсх. Назначение. Понятие величин Rf и Rs. Нарисуйте хроматограмму

30.38kb.

29 09 2014
1 стр.


Руководство по эксплуатации настоящее руководство по эксплуатации (РЭ) описывает принцип работы, технические и конструктивные особенности системы дозирования хлора

Настоящее руководство по эксплуатации (РЭ) описывает принцип работы, технические и конструктивные особенности системы дозирования хлора (в дальнейшем система) и устанавливает поряд

55.23kb.

17 12 2014
1 стр.


Принцип реализации метода «мозговой штурм» в курсе «методы экологических исследований»
52.91kb.

17 12 2014
1 стр.


Руководство по эксплуатации. См рис. Необходимо носить защитные очки

Данное руководство содержит инструкции по монтажу и безопасному применению Вашего прибора. Важным условием является внимательное изучение Вами этого руководства

177.62kb.

14 10 2014
1 стр.


Руководство по применению антикоррозионной эмали ко-198 (торговая марка «церта ®») Новочебоксарск

Руководство содержит информацию об области применения эмалей ко-198, технические характеристики материала и покрытий на его основе

71.19kb.

18 12 2014
1 стр.