1.2. Обмен веществами между клеткой и окружающей средой

где D - коэффициент диффузии, постоянный для данного вещества, растворителя и температуры. В более общем виде для разности концентраций dc на расстоянии dx

поток через сечение А пропорционален градиенту концентрации dc/dx. Знак «минус» возникает в уравнении потому, что изменение концентрации по направлению х - отрицательно.

Диффузия - это наиболее важный процесс, благодаря которому большая часть молекул в водных растворах перемещается на небольшие расстояния. Это относится и к их движению в клетке постольку, поскольку диффузии не препятствуют мембраны. Множество веществ могут свободно диффундировать через липидные мембраны, в особенности вода и растворенные газы, такие, как О₂ и СО₂. Жиро-

12 ЧАСТЬ I. ОБЩАЯ ФИЗИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

Рис. 1.3. Количественная схема диффузии. Два пространства разделены слоем толщиной d и площадью А. С1 -высокая концентрация частиц в левой части объема, С2-низкая концентрация частиц в правой части; розовая поверхность - концентрационный градиент в диффузионном слое. Диффузионный поток dm/dt-см. уравнение (1)

растворимые вещества также хорошо диффундируют через мембраны; это касается и полярных молекул достаточно малого размера, таких, как этанол и мочевина, тогда как сахара проходят через липидный слой с трудом. Вместе с тем липидные слои практически непроницаемы для заряженных молекул, в том числе даже для неорганических ионов. Для неэлектролитов уравнение диффузии (1) обычно преобразуют, соединяя характеристки мембраны и диффундирующего вещества в один параметр - проницаемость (Р):

(3)

На рис. 1.4 сравниваются проницаемости (Р) липидной мембраны для различных молекул.

Рис. 1.4. Проницаемость искусственных липидных бислоев для различных веществ

За поведением мембранных ионных каналов легко наблюдать, поскольку возникающий при движении ионов ток можно измерить, причем даже для одиночного канала. Показано, что каналы спонтанно и с высокой частотой меняют свое состояние от открытого к закрытому. Для калиевого канала характерны импульсы тока амплитудой около 2 пА (2-10 ⁻¹² А) и длительностью в несколько миллисекунд (см. рис. 2.12, стр. 37) [3]. За этот период через него проходят десятки тысяч ионов. Переход белков из одной конформации в другую изучают методами рентгеновской дифракции, мессбауэровской спектроскопии и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР). Белки, таким образом, являются очень динамичными подвижными структурами, а канал, проходящий через белок, не просто жесткая, наполненная водой трубка (рис. 1.5, А), но лабиринт быстро двигающихся молекулярных групп и зарядов. Эта динамическая характеристика канала отражается в энергетическом профиле канала, показанном на рис. 1.5, Б. Здесь по оси абсцисс представлена длина канала от внешнего раствора с концентрацией ионов с_о и потенциалом 0 до внутреннего раствора с концентрацией с₁ и потенциалом Е. По оси орди-

Рис. 1.5. А. Схема белка, образующего калиевый канал, погруженный в липидный бислой плазматической мембраны. Четыре отрицательных заряда зафиксированы на «стенке» канала. Б. Схематический энергетический профиль канала, показанного на рис. А. По оси ординат отложены Величины кинетической энергии, необходимые для прохождения канала; по оси абсцисс расстояния между внутренней и наружной поверхностями мембраны. Энергетические минимумы соответствуют местам саязывания положительно заряженных ионов с фиксированными отрицательными зарядами в стенке канала. Энергетические максимумы соответствуют препятствиям диффузии в канале. Предполагается, что конформация канального белка спонтанно осциллирует; варианты энергетических профилей изображены сплошными и штриховыми линиями; эти осцилляции в значительной степени облегчают связывание ионов при преодолении энергетического барьера (по [14] с изменениями)

но циклически меняется; ион, таким образом, может внезапно оказаться «по ту сторону» энергетического пика и может продолжить движение в клетку. В зависимости от заряда, размеров и степени гидратации иона и его способности связываться со структурами стенок канала энергетический профиль канала варьирует для различных ионов, чем может объясняться избирательность отдельных типов каналов.

где R - газовая постоянная, Τ-абсолютная температура, z - валентность иона (отрицательная для анионов), a F - число Фарадея. Если подставить в уравнение константы, то при температуре тела (Т = 310К) равновесный потенциал для ионов калия Е_к равен:

Действительно, было обнаружено, что все клетки имеют мембранный потенциал; в мышечных клетках млекопитающих его уровень составляет около — 90 мВ. В зависимости от условий и относительных концентраций ионов клетки могут иметь мембранный потенциал в пределах от —40 до —120 мВ. Для клетки в приведенном выше примере (табл. 1.1) потенциал покоя, равный примерно —90 мВ, показывает, что потоки ионов калия через мембранные каналы находятся приблизительно в равновесии. Это неудивительно, поскольку в покоящейся мембране открытое состояние калиевых каналов наиболее вероятно, т.е. мембрана наиболее проницаема для ионов калия. Мембранный потенциал, однако, определяется потоками и других ионов.

Легкость, с которой незаряженные частицы могут диффундировать через мембрану, количественно представлена в уравнении (3). Проницаемость для заряженных частиц описывается несколько более сложным уравнением:

(6)

где μ - подвижность иона в мембране, d - толщина мембраны, a R, Τ и F- известные термодинамические постоянные. Определенные таким образом значения проницаемости для различных ионов могут быть использованы для расчета мембранного потенциала Е_т, когда ионы калия, натрия и хлора проходят через мембрану одновременно (с проницаемостью Р_K, P_Na и Р_Cl, соответственно). При этом предполагается, что потенциал падает в мембране равномерно, так что напряженность поля постоянна. В этом случае применяется уравнение Голдмана, или уравнение постоянного поля [6, 12]:

(7)

потенциал несколько более электроотрицателен, чем Е_к, и намного - по сравнению с E_Na (около +60 мВ). Благодаря диффузии внутриклеточные концентрации ионов, по крайней мере калия и натрия, должны уравниваться с внеклеточными. Стабильность градиента ионов достигается посредством активного транспорта: мембранные белки переносят ионы через мембрану против электрического и (или) концентрационного градиентов, потребляя для этого метаболическую энергию. Наиболее важный процесс активного транспорта - это работа Na/K-насоса, существующего практически во всех клетках; насос выкачивает ионы натрия из клетки, одновременно накачивая ионы калия внутрь клетки. Таким образом обеспечивается низкая внутриклеточная концентрация ионов натрия и высокая - калия (табл. 1.1). Градиент концентрации ионов натрия на мембране имеет специфические функции, связанные с передачей информации в виде электрических импульсов (см. разд. 2.2), а также с поддержанием других активных транспортных механизмов и регулирования объема клетки (см. ниже). Поэтому неудивительно, что более 1/3 энергии, потребляемой клеткой, расходуется на Na/К-насос, а в некоторых наиболее активных клетках на его работу расходуется до 70% энергии [1, 11].

Na/К-транспортный белок представляет собой АТФазу. На внутренней поверхности мембраны она расщепляет АТФ на АДФ и фосфат (рис. 1.6). На транспортировку трех ионов натрия из клетки и одновременно двух ионов калия в клетку используется энергия одной молекулы АТФ, т. е. суммарно за один цикл из клетки удаляется один положительный заряд. Таким образом, Na/К-насос является электрогеиным (создает электрический ток через мембрану), что приводит к увеличению электроотрицательности мембранного потенциала приблизительно на 10 мВ. Транспортный белок выполняет эту операцию с высокой скоростью: от 150 до 600 ионов натрия в секунду. Аминокислотная последовательность транспортного белка известна, однако еще не ясен механизм этого сложного обменного транспорта. Данный процесс описывают с использованием энергетических профилей переноса белками ионов натрия или калия (рис. 1.5, Б). По характеру изменения этих профилей, связанных с постоянными изменениями конформации транспортного белка (процесс, требующий затраты энергии), можно судить о стехиометрии обмена: два иона калия обмениваются на три иона натрия.

Na/К-насос, как и изолированная Na⁺/К⁺-зависимая мембранная АТФаза, специфически ингибируется сердечным гликозидом уабаином (строфантином). Поскольку работа Na/К-насоса представляет собой многоступенчатую химическую реакцию, она, подобно всем химическим реакциям, в значительной степени зависит от температуры, что проде-

Рис. 1.8. Соотношение между скоростью транспорта молекул и их концентрацией (в месте входа в канал или в месте связывания насоса) при диффузии через канал или при насосном транспорте. Последний при высоких концентрациях насыщается (максимальная скорость, vmax); значение по оси абсцисс, соответствующее половине максимальной скорости насоса (vmax/2). является равновесной концентрацией Км

Рис. 1.9. Схема, показывающая концентрации Na+, К+ и СГ внутри и вне клетки и пути проникновения этих ионов через клеточную мембрану (через специфические ионные каналы или с помощью Na/K-насоса. При данных концентрационных градиентах равновесные потенциалы ENa , EK и ECl равны указанным, мембранный потенциал Ет = — 90 мВ

идеальную компенсацию пассивных диффузионных токов, так как переносит ионы натрия из клетки, а ионы калия - в нее. Таким образом, насос является электрогенным за счет разницы в числе перенесенных в клетку и из клетки зарядов, что при нормальной скорости его работы создает мембранный потенциал, примерно на 10 мВ более электроотрицательный, чем если бы он образовывался только за счет пассивных потоков ионов (см. уравнение 7). В результате мембранный потенциал приближается к калиевому равновесному потенциалу, что уменьшает утечку ионов калия. Активность Na/K-насоса регулируется внутриклеточной концентрацией ионов натрия. Скорость работы насоса замедляется при снижении концентрации ионов натрия, подлежащих выводу из клетки (рис. 1.8), так что работа насоса и поток ионов натрия внутрь клетки уравновешивают друг друга, поддерживая внутриклеточную концентрацию ионов натрия на уровне примерно 10 ммоль-л^—1.

Чтобы поддерживать равновесие между насосными и пассивными мембранными токами, необходимо намного больше молекул Na/K-насоса, чем канальных белков для ионов калия и натрия. При открытом состоянии канала через него проходят десятки тысяч ионов за несколько миллисекунд (см. выше), а поскольку канал обычно открывается несколько раз в секунду, всего за это время через него проходит более 10⁵ ионов. Одиночный насосный белок перемещает несколько сотен ионов натрия в секунду, следовательно, плазматическая мембрана должна содержать примерно в 1000 раз больше насосных молекул, чем канальных. Измерения канальных токов в покое показали наличие в среднем одного калиевого и одного натриевого открытого канала на 1 мкм² мембраны; из этого следует, что на том же пространстве должно присутствовать около 1000 молекул Na/K-насоса, т.е. расстояние между ними составляет в среднем 34 нм; диаметр насосного белка, как н канального, составляет 8-10 нм. Таким образом, мембрана достаточно плотно насыщена насосными молекулами [11].

Тот факт, что поток ионов натрия внутрь клетки, а ионов калия - из клетки компенсируется работой насоса, имеет и другое следствие, заключающееся в сохранении стабильного осмотического давления и постоянного объема. Внутри клетки существует высокая концентрация крупных анионов, главным образом белков (А^— в табл. 1.1), которые не способны проникать через мембрану (или проникают через нее очень медленно) и поэтому являются фиксированным компонентом внутри клетки. Чтобы уравновесить заряд этих анионов, необходимо равное количество катионов. Благодаря действию Na/K-насоса этими катионами в основном оказываются ионы калия. Существенное повышение внутриклеточной концентрации ионов могло бы происходить только при возрастании концентрации анионов вследствие потока С1^— по градиенту концентрации в клетку (табл. 1.1), но мембранный потенциал противодействует этому. Входящий ток С1^— наблюдается только до тех пор, пока не будет достигнут равновесный потенциал для ионов хлора;

Помимо симпортных систем существуют также «антипортные». Одна из них, например, за один цикл переносит один ион кальция из клетки в обмен на три входящих иона натрия (рис. 1.10). Энергия для транспорта Са²⁺ образуется за счет входа трех ионов натрия по градиенту концентрации и потенциала. Этой энергии достаточно (при потенциале покоя) для поддержания высокого градиента ионов кальция (от менее 10 ⁻⁷ моль-л⁻¹ внутри клетки до приблизительно 2 ммоль-л⁻¹ вне клетки).

Рис. 1.10. Белки, погруженные в пипидный бислой мембраны, опосредуют симпорт глюкозы и Na+ в клетку, а также Ca2 +/Na + -антипорт, в котором движущей силой является градиент Na+ на клеточной мембране

Эндо- и экзоцитоз происходят в клетках непрерывно. Количество мембранного материала, совершающего оборот, значительно; в течение 1 ч макрофаг поглощает в виде везикул двойную площадь поверхности своей цитоплазматической мембраны. В большинстве клеток оборот мембранного материала происходит не столь интенсивно, но все же должен быть значительным.

Рис. 1.11. Экзоцитоз и эндоцитоз. Вверху: внутриклеточная везикула сливается с липидным бислоем плазматической мембраны и открывается во внеклеточное пространство. Этот процесс называется экзоцитозом. Внизу: плазматическая мембрана инвагинирует на небольшом участке и отшнуровывает везикупу, заполненную внеклеточным материалом. Этот процесс называют эндоцитозом

1.3. Перенос веществ внутри клетки

Рис. 1.12. Α-B. Схема процессов, включающих зкзои эндоцитоз. А. Белок, синтезированный в гранулярном эндоплазматическом ретикулуме, транспортируется посредством аппарата Гольджи к плазматической мембране, где секретируется путем экзоцитоза. Б. Холестерол, связанный с частицами ЛНП (липопротеина низкой плотности), присоединяется к плазматической мембране, индуцирует образование эндоцитозного пузырька в этом участке мембраны и транспортируется к лизосомам, где высвобождается. В. Внеклеточный материал, захваченный в процессе эндоцитоза (на рисунке справа), транспортируется через клетку в везикулах, или пузырьках, и выделяется посредством экзоцитоза (на рисунке слева)

Процессы активного транспорта, которые играют жизненно важную роль в функционировании плазматической мембраны, протекают также и внутри клетки-в мембранах органелл. Специфическое содержимое различных органелл создается отчасти благодаря внутреннему синтезу, а отчасти - за счет активного транспорта из цитозоля. Одним из примеров последнего является упоминавшийся выше Ca²⁺-насос в саркоплазматическом ретикулуме мышечных клеток. Особенно интересно, что в случае синтеза АТФ в митохондриях действует принцип, обратный тому, что имеет место в АТФазных насосах плазматической мембраны (рис. 1.6). При синтезе АТФ окислительный метаболизм приводит к образованию крутого градиента Н⁺ на внутренних мембранах. Этот градиент является движущей силой для процесса, обратного насосному циклу активного транспорта молекул: ионы Н⁺ движутся через мембрану по градиенту, а высвобождающаяся в результате этого энергия обеспечивает синтез АТФ из АДФ и фосфата. Образовавшаяся АТФ в свою очередь обеспечивает энергией клетку, в том числе и для активного транспорта.

Процесс секреции белка представлен на рис. 1.12, А. Белок синтезируется вблизи ядра клетки на рибосомах, связанных с эндоплазматическим ретикулумом (так называемый гранулярный, или шероховатый, эндоплазматический ретикулум); попав в эндоплазматический ретикулум, белок упаковывается в транспортные везикулы, которые отделяются от органеллы и мигрируют к аппарату Гольджи. Здесь они сливаются с цистернами аппарата Гольджи, где

белок модифицируется (т.е. превращается в гликопротеин). На концах цистерн везикулы снова отделяются. Несущие модифицированный белок секреторные везикулы движутся к плазматической мембране и выделяют содержимое путем экзоцитоза.

Другой пример транспортного пути в клетке показан на рис. 1.12, Б; это - поглощение холестерола клеткой. Транспортируемый в крови холестерол связан в основном с белками, например частицами «липопротенна низкой плотности» (ЛНП). Такие частицы присоединяются к специфическим, содержащим рецепторы к ЛНП участкам мембраны, где происходит эндоцитоз и ЛНП переносится внутрь клетки в «окаймленных» везикулах. Эти везикулы сливаются, образуя эндосомы и утрачивая в ходе этого процесса «окаймление». Эндосомы в свою очередь сливаются с первичными лизосомами. содержащими преимущественно гидролитические ферменты, и образуют вторичные, более крупные лизосомы. В них холестерол высвобождается из частиц ЛНП и диффундирует в цитозоль, где становится доступным, например, для синтеза липидных мембран. От эндосом также отделяются везикулы, не содержащие ЛНП, которые особым путем движутся к плазматической мембране и сливаются с ней, возвращая мембранный материал и, вероятно, рецепторы к ЛНП. С момента связывания частицы ЛНП с мембраной до высвобождения холестерола из вторичной лизосомы проходит 10—15 мин. Нарушения в связывании и поглошении ЛНП, т.е. в снабжении клетки холестеролом, играют решающую роль в развитии серьезного и широко распространенного заболевания-атеросклероза («отвердение» артерий).

Существует множество других транспортных путей, сходных с показанными на рис. 1.11 и 1.12, А, с помощью которых движутся в клетке специфические везикулы. Неизвестно, как именно они передвигаются, но в этот процесс, вероятно, вовлечены элементы цитоскелета. Везикулы могут скользить по микротрубочкам, в этом случае энергия для движения, по-видимому, обеспечивается связанным с везикулами белком-АТФазой (см. ниже). Остается совершенно непонятным, как множество различных везикул, двигаясь одна за другой во всех направлениях, попадают по назначению. Они, очевидно, должны быть «помечены» таким образом, чтобы это распознавалось транспортной системой и преобразовывалось в целенаправленное движение.

Транспорт путем образования и разрушения оргаиелл. До сих пор мы рассматривали эндо- и экзоцитоз как процессы транспортировки содержимого везикул. Существует и другой аспект этих процессов, заключающийся в том, что направленное удаление плазматической мембраны на одном участке клеточной поверхности путем эндоцитоза и, напротив, добавление ее на другом путем экзоци-

20 ЧАСТЬ I. ОБЩАЯ ФИЗИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

тоза перемещает значительные участки мембраны (рис. 1.12,5), давая клетке возможность, например, сформировать вырост или двигаться.

Сходные перестройки типичны также и для цитоскелета, особенно для микрофиламентов и микротрубочек (рис. 1.1). Микрофиламенты состоят в первую очередь из белка F-актина, который способен к сборке в волокнистые пучки в результате полимеризации мономера из цитозоля. Пучки поляризованы, т. е. они часто нарастают только с одного конца, аккумулируя новые молекулы актина, тогда как другой конец инертен или здесь происходит разборка. За счет такого поляризованного роста микрофиламенты эффективно перемещаются и может изменяться структура их сети. Переход актина из деполимеризованного состояния (золя) в организованное (гель) может происходить очень быстро под действием других белков или изменений концентрации ионов (см. ниже). Существуют также белки, которые вызывают разрушение актиновых филаментов с образованием коротких фрагментов. Тонкие выросты многих клеток - филоподии - содержат центральный пучок актина (рис. 1.1), и различные движения филоподий, вероятно, обусловлены переходами актина: полимеризация — деполимеризация.

неин играет аналогичную роль в перемещении микротрубочек при работе ресничек (рис. 1.1). В цитоплазме неспециализированных клеток миозин и динеин образуют не правильные волокна, а в большинстве случаев маленькие группы молекул. Даже в виде таких малых агрегатов они способны перемещать актиновые филаменты или микротрубочки. Рис. 1.13 иллюстрирует этот процесс, когда к двум актиновым филаментам, поляризованным в разных направлениях, присоединены также противоположно поляризованные молекулы миозина. Головные группы миозина изгибаются к хвосту молекулы, расходуя при этом АТФ, а два актиновых филамента смещаются в противоположном направлении, после чего миозин отсоединяется от них. Перемещения такого рода, в ходе которых энергия АТФ преобразуется в механическую работу, могут изменять форму цитоскелета и, следовательно, клетки, а также обеспечивать транспорт связанных с цитоскелетом органелл.

Аксонный транспорт

Рис. 1.13. Немышечный миозиновый комплекс при определенной ориентации может связываться с актиновыми филаментами различной полярности и, используя энергию АТФ, смещать их относительно друг друга

Описанный выше быстрый аксонный транспорт является антероградным, т. е. направленным от тела клетки. Показано, что некоторые вещества движутся от периферии к телу клетки с помощью ретроградного транспорта. Например, ацетилхолинэстераза транспортируется в этом направлении со скоростью в 2 раза меньшей, чем скорость быстрого аксонного транспорта. Маркер, часто используемый в нейроанатомии пероксидаза хрена - также перемещается ретроградным транспортом. Ретроградный транспорт, вероятно, играет важную роль в регуляции белкового синтеза в теле клетки. Через несколько дней после перерезки аксона в теле клетки наблюдается хроматолиз, что свидетельствует о нарушении белкового синтеза. Время, требующееся для хроматолиза, коррелирует с длительностью ретроградного транспорта от места перерезки аксона до тела клетки. Такой результат предполагает и объяснение этого нарушения-нарушается передача с периферии «сигнального вещества», регулирующего белковый синтез.

Очевидно, что основными «средствами передвижения», используемыми для быстрого аксонного

Рис. 1.14. Опыт, демонстрирующий быстрый аксонный транспорт в сенсорных волокнах седалищного нерва кошки. Меченный тритием лейцин вводят в ганглий дорсального корешка и измеряют радиоактивность в ганглии и сенсорных волокнах через 2, 4, 6, 8 и 10 ч после введения (нижняя часть рисунка). По оси абсцисс отложено расстояние от ганглия до участков седалищного нерва, где производят измерение. По оси ординат только для верхней и нижней кривой в логарифмическом масштабе отложена радиоактивность (имп./мин). «Волна» повышенной радиоактивности (стрелки) движется со скоростью 410 мм-сут -1 (по [15])

транспорта, являются везикулы (пузырьки) и органеллы, такие, как митохондрии, содержащие вещества, которые нужно транспортировать. Перемещение наиболее крупных везикул или митохондрий можно наблюдать с помощью микроскопа in vivo. Такие частицы совершают короткие быстрые движения в одном из направлений, останавливаются, часто двигаются немного назад или в сторону, снова останавливаются, а затем совершают рывок в основном направлении. 410 мм-сут⁻¹ соответствуют средней скорости антероградного движения приблизительно 5 мкм-с⁻¹; скорость же каждого отдельного движения должна быть, следовательно,

22 ЧАСТЬ I. ОБЩАЯ ФИЗИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

значительно выше, а если учесть размеры органелл, филаментов и микротрубочек, то эти движения действительно очень быстры. Быстрый аксонный транспорт требует значительной концентрации АТФ. Такие яды, как колхицин, разрушающий микротрубочки, также блокируют быстрый аксонный транспорт. Из этого следует, что в рассматриваемом нами транспортном процессе везикулы и органеллы движутся вдоль микротрубочек и актиновых филаментов; это движение обеспечивается малыми агрегатами молекул динеина и миозина, действующих, как показано на рис. 1.13, с использованием энергии АТФ.

Быстрый аксонный транспорт может участвовать и в патологических процессах. Некоторые нейротропные вирусы (например, вирусы герпеса или полиомиелита) проникают в аксон на периферии и движутся с помощью ретроградного транспорта к телу нейрона, где размножаются и оказывают свое токсическое действие. Токсин столбняка - белок, который продуцируется бактериями, попадающими в организм при повреждениях кожи, захватывается нервными окончаниями и транспортируется к телу нейрона, где он вызывает характерные мышечные спазмы.

Известны случаи токсического воздействия на сам аксонный транспорт, например воздействие промышленным растворителем акриламидом. Кроме того, полагают, что патогенез авитаминоза «бери-бери» и алкогольной полинейропатии включает нарушение быстрого аксонного транспорта.

Помимо быстрого аксонного транспорта в клетке существует и довольно интенсивный медленный аксонный транспорт. Тубулин движется по аксону со скоростью около 1 мм сут⁻¹, а актин быстрее - до 3 мм-сут⁻¹. С этими компонентами цитоскелета мигрируют и другие белки; например, ферменты, по-видимому, связаны с актином или тубулином. Скорости перемещения тубулина и актина примерно согласуются со скоростью роста, обнаруженной для механизма, описанного ранее, когда молекулы включаются в активный конец микротрубочки или микрофиламента. Следовательно, этот механизм может лежать в основе медленного аксонного транспорта. Скорость медленного аксонного транспорта примерно соответствует также скорости роста аксона, что, по-видимому, указывает на ограничения, накладываемые структурой цитоскелета на второй процесс.

1.4. Регуляция клеточных функций

Регуляторные воздействия на клеточную мембрану

Другие локальные агенты служат факторами роста. Наиболее известен фактор роста нервов (ФРН) для симпатических нейронов, который необходим для роста и выживания этих нейронов в ходе развития in vivo или в клеточной культуре. Очевидно, клетки-мишени для этого класса нейронов выделяют ФРН и тем самым обеспечивают правильную иннервацию. При формировании органов клеткам часто необходимо «находить путь» к клеткам-мишеням, которые могут располагаться на значительных расстояниях. Соответственно, должно существовать множество специализированных факторов роста, подобных ФРН.

Внутриклеточная коммуникация с участием вторых посредников

Рис. 1.15. Цепь реакций с участием внутриклеточного посредника цАМФ (циклического аденозинмонофосфата). Возбуждающий или тормозный внешние сигналы активируют мембранные рецепторы Rs или Ri. Эти рецепторы регулируют процесс связывания G-белков с внутриклеточным ГТФ (гуанозинтрифосфатом), стимулируя или ингибируя тем самым внутриклеточную аденилатциклазу (АЦ). Усиливающий фермент АЦ превращает аденозинтрифосфат (АТФ) в цАМФ, который затем при участии фосфодиэстеразы расщепляется до АМФ. Свободный цАМФ диффундирует в клетку и активирует аденилаткиназу (А-киназу). высвобождая ее каталитическую субъединицу С, которая катализирует фосфорилирование внутриклеточных белков, т.е. формирует конечный эффект внеклеточного стимула. На схеме показаны также фармакологические препараты и токсины, которые запускают ( + ) или ингибируют ( —) некоторые реакции (по [8] с изменениями)

Параллельно со стимуляторной цепью реакций с участием R_s возможно связывание тормозных медиаторов и гормонов с соответствующим рецептором R_i, который опять-таки через ГТФ-активируемый белок G_i ингибирует АЦ и, таким образом, продукцию цАМФ. Диффундируя в клетку, цАМФ реагирует с аденилаткиназой (А-киназа); при этом высвобождается субъединица С, которая катализирует фосфорилирование белка Р. Это фосфорилирование переводит белки в активную форму, и теперь они могут проявить свое специфическое регулирующее действие (например, вызвать деградацию гликогена). Эта сложная регуляторная система чрезвычайно эффективна, так как конечным результатом является фосфорилирование множества белков, т. е. регуляторный сигнал проходит цепь с большим коэффициентом усиления. Наружные медиаторы, которые связываются с рецепторами R_s и R_i , специфическими для каждого из них, чрезвычайно разно-

образны. Адреналин, связываясь с R_s или R_i , участвует в регуляции метаболизма липидов и гликогена, а также в усилении сокращения сердечной мышцы и в других реакциях (см. гл. 19). Тиреотропный гормон, активируя R_s, стимулирует выделение щитовидной железой гормона тироксина, а простагландин I тормозит агрегацию кровяных пластинок. Ингибиторные эффекты, в том числе адреналина, опосредованные через R_i , выражаются в замедлении липолиза. Таким образом, система цАМФ-это многофункциональная внутриклеточная регуляторная система, которая может точно контролироваться внеклеточными стимуляторными и ингибиторными сигнальными веществами.

Инозитолфосфат «ИФ₃ ». Внутриклеточная система второго посредника - инозитолфосфата - была открыта лишь недавно (рис. 1.16). В данном случае ингибиторный путь отсутствует, однако имеется сходство с системой цАМФ, в которой эффект стимуляции рецептора R переносится на ГТФ-активируемый G-белок на внутренней поверхности мембраны. На следующем этапе обычный мембранный липид фосфатидилинозитол (ФИ), предварительно получив две дополнительные фосфатные группы, превращается в ФИ-дифосфат (ФИФ₂), который расщепляется активированной фосфодиэстеразой (ФДЭ) на инозитолтрифосфат (ИФ₃) и липид диацилглицерол (ДАГ). Инозитолтрифосфат - это водорастворимый второй посредник, диффундирующий в цитозоль. Он действует в первую очередь путем высвобождения Ca^{2 +} из эндоплазматического ретикулума. Са²⁺ в свою очередь действует в качестве посредника, как было описано выше; например, он активирует Ca²⁺-зависимую фосфокиназу, фосфорилирующую ферменты. Липидная субъединица ДАГ (рис. 1.16) также переносит сигнал, диффундируя в липидной фазе плазматической мембраны к расположенной на ее внутренней поверхности С-киназе, которая и активируется с участием фосфатидилсерина в качестве кофактора. Затем С-киназа запускает фосфорилирование белков, переводя их в активную форму.

Внутриклеточная система второго посредника ИФ₃ также может управляться множеством внешних медиаторов и гормонов, в том числе ацетилхолином, серотонином, вазопрессином и тиреотропным гормоном; как и система цАМФ, она характеризуется разнообразными внутриклеточными эффектами. Возможно, эта система активируется и светом в зрительном рецепторе глаза, и играет центральную роль в фототрансдукции (см. гл. 11). Впервые в индивидуальном развитии организма рецептор системы ИФ₃ активируется спермием, вследствие чего ИФ₃ принимает участие в регуляторных реакциях, сопровождающих оплодотворение яйцеклетки.

Системы цАМФ и ИФ₃-ДАГ являются высокоэффективными биологическими усилителями. Они

ГЛАВА 1. ОСНОВЫ КЛЕТОЧНОЙ ФИЗИОЛОГИИ 25

Рис. 1.16. Цепь реакций с участием внутриклеточного посредника ИФ3 (инозитолтрифосфата). Как и в системе цАМФ, внеклеточный сигнал опосредован через белок G, который в данном случае активирует фосфодиэстеразу (ФДЭ). Этот фермент расщепляет фосфатидилинозиндифосфат (ФИФ2) в плазматической мембране до ИФ3 и диацилглицерола (ДАГ); ИФ3 диффундирует в цитоплазму. Здесь он вызывает выброс Са2+ из зндоплазматического ретикулума; повышение концентрации Са2+ в цитоплазме ([Ca2+],-) активирует протеинкиназу. которая фосфорилирует и, следовательно, активирует ферменты. Другой продукт, ДАГ, остается в мембране и активирует протеинкиназу С (кофактор фосфатидилсерин, ФС). Протеинкиназа С также фосфорилирует ферменты, опосредующие специфическое действие, связанное со стимуляцией внешнего рецептора R. Ветви цепи реакций с участием ИФ3 и ДАГ могут быть активированы независимо иономицином и форболовым эфиром соответственно (по [8, 9] с изменениями)

преобразуют реакцию между медиатором и наружным мембранным рецептором в фосфорилирование множества внутриклеточных белков, которые затем могут влиять на различные функции клетки. Один из существенных аспектов проблемы состоит в том, что, насколько известно на сегодняшний день, су-

ществуют только эти две тесно связанные регуляторные системы такого типа, используемые многочисленными внешними посредниками для регуляции разнообразных внутриклеточных процессов. Вместе с тем, эти регуляторные системы, в том числе и Са²⁺, тесно взаимодействуют друг с другом, что позволяет им осуществлять тонкую регуляцию клеточных функций.

1.5. Литература

1. 
   Alberts В., BrayD.. Lewis J., Reff Μ., Roberts К.. Watson J. D. Molecular Biology of the Cell, New York and London, Garland Publishing Inc., 1983.
   
2. 
   Czihak G.. Langer Η.. Ziegler Η. (eds.). Biologie. Berlin, Heidelberg, New York, Springer, 1983.
   
3. 
   Hille B. Ionic channels of excitable membranes. Sunderland, Mass., Sinauer Assoc., 1984.
   
4. 
   Hoppe W.. Lohmann W., Mark! H., Ziegler H. (eds.). Biophysik. Berlin, Heidelberg, New York, Springer, 1984.
   
5. 
   Зипдегтапп К.. МЪЫег Η. Biochemie. Berlin, Heidelberg, New York, Springer, 1980.
   
6. 
   Kandel E. R., Schwartz- J. H. (eds.). Principles of neural science, New York, Amsterdam, Oxford, Elsevier, 1985.
   
7. 
   Schiebler T. H. Schmidt W. Anatomie des Menschen. Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, Springer, 1983.
   

8. 
   Berridge M. J. The molecular basis of communication within the cell, Sei. Amer., 253, 124-134 (1985).
   
9. 
   Berridge M.J.. Irvine R.F. Inositol triphosphate, a novel second messenger in cellular signal transduction, Nature, 312, 315-321 (1984).
   

10. 
    Bretscher M.S. The molecules of the cell membrane, Sei. Amer., 253, 124-134 (1985).
    
11. 
    Daut J. The living cell as an energy-transducing machine. A minimal model of myocardial metabolism, Biochem. et Biophys. Acta, 895, 41-62 (1987).
    
12. 
    Hodgkin A. L., Katz B. The effect of sodium ions on the electrical activity of the giant axon of the squid, i. Physiol. (Lond.), 108, 37-77 (1949).
    
13. 
    Hodgkin A.L., Keynes R.D. Active transport of cations in giant axons from Sepia and Loligo, J. PhysioL (Lond.), 128, 28-42 (1955).
    
14. 
    Läuger P. Ionic channels with conformational substates, Biophys. J., 47, 581-590 (1985).
    
15. 
    Ochs S., Worth R.M. Exoplasmic transport in normal and pathologic systems. In: Physiology and Pathology of Axons, S. G. Waxmann, Ed. New York, Raven Press, 1978.