2.2. Методики.

В зависимости от поставляемого материала и наличия реагентов, для более эффективного выявления гельминтов и простейших, в нашей работе использовались многие методики:

Исследование нативного мазка и мазка окрашенного раствором Люголя.

Препарат готовится на предметном стекле. Деревянной или стеклянной палочкой капля испражнений переносится на предметное стекло и накрывается покровным стеклом.

В правильно приготовленном нативном мазке фекалий покровное стекло должно плотно примыкать к предметному с равномерным распределением жидкости между ними. Густой мазок малопрозрачен. Если взято слишком мало фекалий, то мазок получится разведенным и простейших в нем может не оказаться.

При микроскопическом исследовании освещение не должно быть ярким, иначе можно пропустить прозрачные объекты. После ориентировочного просмотра под малым увеличением обязательно применяют среднее увеличение ( х10, х40 ).

В нативном мазке обнаруживаются подвижные формы простейших, по особенностям движения можно дифференцировать отдельные виды.

Цисты отличаются постоянной формой и наличием оболочек. Строение цист видно плохо, не просматриваются ядра. Поэтому исследуется и мазок, окрашенный раствором Люголя.

Состав раствора Люголя по унифицированной методике:

- йодит калия – 3г

- Кристаллический йод – 1,5г

- вода дистиллированная – 100 мл

Сначала растворяется йодид калия, затем йод. Раствор стабилен в темной посуде с притертой пробкой при комнатной температуре не более месяца.

Цисты окрашиваются в золотисто – коричневой цвет. На фоне цитоплазмы заметны ядра, видны их строение и число. Хорошо виден гликоген.

Метод обогащения или накопления цист

Применяется с целью обнаружения цист. При смешивании материала, содержащего цисты с жидкостями, имеющими большую относительную плотность чем цисты, последние всплывают и находились в поверхностной пленке. Предварительно отмываем цисты от фекалий ( смешивали 10 мл воды в центрифужной пробирке и центрифугируем 46 с. - 1 мин. при 2500 об/мин при добавлении 1 г фекалий). Поверхностная пленка сливается, а к осадку добавляется воду. Центрифугируется несколько раз, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной. После этого к осадку добавляется 33% раствор сульфата цинка, перемешивается, центрифугируется 2 минуты. Так же используется формалин – эфирное обогащение.

В пробирку наливается 6 мл раствора формалина. Частица фекалий размером с горошину вносится в пробирку. В пробирку добавляется 2 мл эфира, встряхивается и центрифугируется 3 мин при 1500 об/мин. Затем образовавшийся слой фекалий отделяется от стенок пробирки и выливается все содержимое пробирки, оставляется только осадок. Пипеткой осадок переносится на предметное стекло и добавляется капля раствора Люголя, накрывается покровным стеклом и исследуется под малым и средним увеличением.

Модифицированный метод по Цилю-Нильсену

При использовании этого метода окраски ооцисты хорошо отличимы от схожих по размеру и по форме.

- Малахитовый зеленый сравним по эффективности с окраской на кислотоустойчивые виды микроорганизмов.

Приготовление нативного мазка кала для исследований на яйца гельминтов

В нативном препарате обнаруживаются яйца и личинки гельминтов. Для приготовления берется 200 – 300 мг кала, растирается на стекле размером 6х9 см в 15-20 каплях 50% раствора глицерина. Просматривается под бинокулярным микроскопом в проходящем свете без покровных стекол при увеличении х12,5, х4. Здесь хорошо видны окрашенные яйца гельминтов.

Приготовление толстого мазка по Като

Метод основан на обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке кала, просветленном глицерином и подкрашенном малахитовым зеленым. Используется смесь Като: 6 мл 3% водного раствора малахитового зеленого; 500 мл 6% раствора фенола; также понадобится гидрофильный целлофан размером 20-40 мм, который погружают в смесь Като.

В вытяжном шкафу раскладываются пронумерованные стекла. Деревянной или стеклянной палочкой берется кусочек кала размером с горошину и помещается на предметное стекло в центральной его части. Из банки достать пинцетом обработанную по Като пластинку целлофана и положить на пробу. Резиновой пробкой или специальным валиком придавить целлофан, равномерно распределяя кал под ним. Препарат оставить для просветления на 60 мин. Затем микроскопировать. В мазке видны яйца гельминтов.

Метод обогащения ( Фюллеборна )

Метод основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе хлорида натрия.

Используется насыщенный раствор : 400 г хлорида натрия и довести до 1 литра воды, растворяя NaCl при кипении, отфильтровать и охладить раствор. В эмалированном подносе расставить стеклянные банки с номерками, в каждую банку палочкой внести 2,5-5 г фекалий. Постепенно прилить насыщенный раствор соли и тщательно размешать. Затем бумажной полоской, согнутой в виде совка, быстро снять вплывшие крупные частицы и положить в банку с дезинфицирующим раствором. На все препараты нанести по 2 капли 50% раствора глицерина. Через 45 мин после начала отстаивания проволочной петлей прикоснуться к поверхности раствора в банке и стряхнуть ее в каплю глицерина. Эту процедуру повторить, готовя 4-ре препарата на двух предметных стеклах. Петлю обжечь на спиртовке. После снятия поверхностной пленки жидкость слить и 4-8 капель осадка пипеткой перенести на предметное стекло. Готовится 2 препарата. Из каждой пробы кала на микроскопическое исследование подлежат 6 препаратов на 3-х стеклах ( 4-е из поверхностной пленки и 2 из осадка). При исследовании выявляются яйца гельминтов, даже при небольшом их количестве.

Метод Е.В. Калантарян

Это метод обогащения, здесь не требуется исследование осадка. Для раствора используется: 1 кг нитрата натрия ( натриевой селитры ) растворить в 1 л воды и кипятить до образования на поверхности пленки и полного растворения соли.

В стеклянную банку деревянной палочкой внести 2,5-5 7 фекалий. Пронумеровать. Прилить насыщенный раствор нитрата натрия и тщательно размешать. Бумажной полоской удалить всплывшие на поверхность крупные частицы. На банку наложить предметное стекло и пипеткой добавить раствор нитрата натрия, пока нижняя поверхность предметного стекла не соприкоснется со слоем жидкости. После этого стекло сдвигать так, чтобы оно соприкасалось с жидкостью и закрывало банку. Стекло быстро снять и перевернуть влажной поверхностью кверху. В препарат для предупреждения высыхания добавить 2-3 капли глицерина и микроскопировать. Во влажном слое обнаруживаются яйца гельминтов, всплывшие в поверхностную пленку.

<предыдущая страница | следующая страница>