• Ф КГМУ 4/3-04/02

• ИП №6 14 июня 2007 г.

Карагандинский государственный медицинский университет
Кафедра молекулярной биологии и медицинской генетики


Лекция
Тема 3: Регуляция экспрессии генов у про- и эукариот

Дисциплина: Медицинская биология, генетика, радиобиология

Специальность: 5В110400- «Медико-профилактическое дело»

Курс: 1

Время: 50 мин.

Караганда 2012 г.
Утверждена на заседании кафедры

Протокол № 1__31_08_2012 г._

Зав. каф. Б.Ж. Култанов


Структура лекции
Тема 3: «Регуляция экспрессии генов у прокариот и эукариот»
Цель: изучение генома прокариотических и эукариотических клеток и особенности экспрессии генетической информации у прокариот и эукариот, этапы транскрипции.
План лекции:

1.Порядок реализации генетической информации в процессе онтогенеза.

2.Модель оперона Жакоба и Моно.

3.Схема строения типичного гена эукариот.

4.Характеристика структурной зоны.

5.Характеристика регуляторной области.

6.Уровни регуляции экспрессии генов.

7.Синтез и процессинг РНК.

8.Кэпирование и его значение.

9.Сплайсинг РНК, его виды.

Тезисы лекции

Регуляция экспрессии генов - это специфическое взаимодействие определенных веществ (главным образом, белков) с различными участками ДНК, расположенных в области точек (сайтов) начала транскрипции. Такое взаимодействие может оказывать как позитивный, так и негативный эффект на уровень транскрипции. В целом, регуляция генной экспрессии - это один из путей адаптации организма к изменяющимся условиям окружающей среды.

Регуляция экспрессии генов у прокариот. В 1961 г. Жакоб и Моно преложили ставшую теперь классической модель оперона. Они исследовали метаболизм лактозы у кишечной палочки. Он осуществляется тремя ферментами, которые кодируются 3 структурными генами. Структурные гены расположены последовательно один за другим и связаны между собой физически. Такое расположение генов позволяет регулировать экспрессию всех трех структурных генов с помощью одного регуляторного центра. Иными словами, информация со всех трех структурных генов переписывается в виде одной молекулы РНК, которая называется полицистронной мРНК. Образование полицистронных мРНК характерно для прокариотов.

Строение регуляторного центра. В состав регуляторного центра входит ген, который постоянно функционирует. Такая экспрессия не подвержена специфической регуляции и называется конститутивной. Продукт этого гена - белок- репрессор. Белок -репрессор состоит из 4-х субъединиц с молекулярной массой 38 тыс Да. Между этим конститутивным геном и структурными генами находятся: оперативный локус или оператор и промотор. Оператор - это участок ДНК, длиной в 27 пар оснований. Промотор - это участок ДНК, к которому присоединяется РНК-полимераза. Промотор, оператор и структурные гены называются опероном.

У прокариот наблюдается 2 типа регуляции генов: позитивная и негативная. Последовательность негативной регуляции: конститутивный ген постоянно вырабатывает белок-репрессор. Этот репрессор в отсутствие лактозы садится на оператор и препятствует связыванию РНК - полимеразы с промотором. В этом случае не происходит синтез полицистронной мРНК.

Если в клетку попадает индуктор (лактоза), то он связываются с репрессором, меняет его конформацию, что приводит к освобождению оператора. Свободный оператор - это сигнал, разрешающий связывание РНК-полимеразы с промотором и начало транскрипции полицистронной мРНК. Обязательными условиями присоединения РНК - полимеразы является наличие циклического АМФ и белка-активатора катаболитных генов. Только при их совместном действии РНК- полимераза связывается с промотором. После этого начинается синтез мРНК. Особенностью у прокариот является то, что не дожидаясь окончания синтеза мРНК, начинается синтез белка рибосомами. Т.е. лактоза сама индуцирует собственное расщепление. При снижении концентрации лактозы репрессор высвобождается, связывается с оператором и синтез мРНК блокируется. Такой тип оперона называется индуцибельным.

Другим вариантом оперона является регуляция конечным продуктом реакции (эффектором). В этом случае ген-регулятор определяет синтез неактивного белка-репрессора. Конечный продукт реакции связывается с неактивным репрессором и приводит его в активное состояние. Репрессор связывается с оператором и блокирует тем самым транскрипцию структурных генов. Это продолжается до тех пор, пока концентрация эффектора не падает. После этого эффектор отсоединяется от репрессора, а репрессор инактивируется и работа оперона возобновляется. Такой тип оперона называется репрессивным. Например, так происходит регуляция метаболизма триптофана.

У прокариот соблюдается принцип коллинерности, т.е. размер мРНК соответствует размеру гена. Регуляция экспрессии гена у прокариот происходит только на уровне транскрипции.

Схема строения типичного гена эукариот.

У эукариот принято выделять две зоны: структурную и регуляторную. Они разделены сайтом начала транскипции. Структурная зона представлена структурным геном. Ген состоит из кодирующих последовательностей - экзонов и некодирующих последовательностей - интронов. Длина интронов колеблется от 80 до 1000 и более нуклеотидов. Для интронов не характерна строгая последовательность нуклеотидов. Интроны ограничены консенсусными областями, строго консервативными. Это связано с точным механизмом удаления интронов, так как ошибка в 1 нуклеотид сделает бессмысленной закодированную информацию. Количество интронов колеблется от 2 до 50.

Регуляторная область состоит из 2-х элементов: 1 элемент обеспечивает базовый уровень регуляцию экспрессии (или промотор), 2-й элемент - дополнительный уровень регуляции экспрессии. Промотор располагается перед точкой (сайтом) начала транскрипции. Базовый уровень регуляции экспрессии состоит из 2-х элементов: ТАТА-бокс и ЦААТ-бокс. ТАТА-бокс направляет РНК-полимеразу к сайту инициации транскрипции и, следовательно, определяет точность начала синтеза мРНК. ЦААТ-бокс контролирует частоту транскрипции. Чтобы РНК-полимераза узнала промотор, необходимо предварительное присоединение ТАТА-фактора - большого белкового комплекса. ТАТА-бокс и ТАТА-фактор образуют транскрипционный комплекс многоразового использования. Общее свойство элементов базовой регуляции: они функционируют только при связывании с ними определенных белковых факторов, которые называются белки-регуляторы. Белки-регуляторы связываются в определенном месте, которое называется область, лежащая перед промотором. Обычно он представляет собой последовательность ДНК, содержащую 100 нуклеотидных пар.

Предпромоторная область содержит сайты связывания с белками -регуляторами. Существуют белки-регуляторы, специфичные для клеток данной ткани. Но также существуют белки-регуляторы, характерные для многих клеток. Но при этом регуляторные белки взаимодействуют друг с другом и от суммарного знака взаимодействия зависит включен ген или выключен. а также степень его экспрессии. Эффект совместного действия белков - регуляторов и от их сочетания контролирует активность многих генов. Но не все регуляторные белки равны: существуют главные белки-регуляторы, которые контролируют работу многих генов.

Белки-регуляторы кодируются генами, лежащими на той же хромосоме или на других хромосомах. В первом случае регуляция относится к цис-типу, во втором - к транс-типу.

Дополнительный уровень регуляции входят последовательности ДНК двух классов, которые в 200 раз могут усиливать или ослаблять базовый уровень регуляции экспрессии. Первый класс последовательностей называются энхансеры, второй - сайленсеры. Особенностью работы энхансеров и сайленсеров является то, что они оказывают свое влияние, находясь на определенном расстоянии от элементов базового уровня. Это расстояние может быть не менее 100 нуклеотидов и до нескольких тысяч нуклеотидов. Считается, что действие энхансеров и сайленсеров не опосредовано какими-то специфическими веществами или эффекторами. Они влияют непосредственно на элементы базовой регуляции.

Кроме того, существует еще один класс регуляторных последовательностей, которые обеспечивают адаптивную регуляцию экспрессии некоторых генов. К ним относятся регуляторные элементы, которые начинают участвовать в регуляции в ответ на действие: а) гормонов, б) теплового шока, в) действие металлов, например, кадмия и цинка, г) некоторых химических токсинов и т.д.

Синтез и процессинг РНК. Синтез РНК- это сложный многоэтапный процесс, идущий с потреблением энергии. На первом этапе происходит деконденсация хроматина, затем наступает стадии инициации, элонгации и терминации.

Инициация запускается тремя факторами инциации белковой природы. В ходе стадии инициации РНК-полимераза, присоединяясь к промотору, начинает раскручивать цепи ДНК кпереди от себя. Синтез мРНК всегда идет на одной из двух цепей ДНК. мРНК всегда одноцепочечная. Построение РНК на ДНК происходит по принципу комплементарности, с той лишь разницей, что вместо тимина используется урацил. Заканчивается синтез РНК в терминирующей последовательности. Эта последовательность называется кодоном терминации трансляции.

Область транскрибируемой ДНК, лежащей между промотором и терминатором, называется единицей транскрипции или транскриптоном. Образующаяся РНК называется первичным транскриптатом. У прокариот первичный транскриптат обычно содержит РНК-копии нескольких генов, у эукариот - только одного.

Существует несколько типов РНК-полимераз, в процессе синтеза РНК участвует РНК-полимераза II. Первоначально синтезируется 5 - конец РНК-транскриптата, который сразу кэпируется. Функция кэпирования - это защита РНК-транскриптата от разрушения, а также с помощью кэпа РНК связывается с рибосомой.

Кэпирование - это присоединение определенной последовательности нуклеотидов. С нее начинается на рибосоме трансляция, затем кэп удаляется. Стадия элонгации или удлинения РНК-транскриптата. Во время этой стадии происходит дальнейшее расплетание ДНК и разрушение нуклеосом. Скорость синтеза - 30 нуклеотидов в секунду. Элонгация контролируется специальными факторами элонгации белковой природы. Стадия терминации: завершение синтеза РНК-транскриптата происходит в стоп-кодоне вследствие присоединения факторов терминации белковой природы. При этом к 3-концу транскриптата присоединяются от 100 до 200 остатков адениловой кислоты, которые образуют polyA - хвост. Считается, что poly-А-хвост предотвращает деградацию РНК-транскриптата и облегчает его транспорт в цитоплазму. Первичные РНК-транскриптаты могут либо хранится в нуклеоплазме, либо подвергаться сплайсингу.

Ген - это сложная функционально активная единица, предназначенная для регулируемого синтеза молекулы РНК.

Сплайсинг РНК. В этом случае к первичным РНК-транскриптатам присоединяются частицы, которые называются гетерогенными ядерными нуклеопротеиновыми частицами (гя-РНП-частицы). Они представляют собой РНК длиной 5000 нуклеотидов, намотанную на белковый остов. Гя-РНП-частицы присоединяются в местах соединения экзонов и интронов, затем попарно объединяются с образованием агрегатов или сплайсосом. Кроме того, в состав сплайсосомы входят малые ядерные РНК, функция которых - удаление интронов.

Механизм удаления интронов происходит с высокой точностью. В процессе сплайсинга РНК образуется специфичная лассо-образная структура, которая приводи к высвобождению интронов и сшиванию экзонов. Итак, после процессинга и сплайсинга РНК-транскриптат содержит: кэпирующую последовательность, кодон инициации (AUG) - метионин, экзоны, стоп-кодон и полиА-конец. Такая мРНК-выходит в цитоплазму и используется в процессе синтеза белка.

Альтернативный сплайсинг. Механизм и регуляция неизучены. Суть альтернативного сплайсинга - из одного и того же первичного транскриптата можно получить разные м-РНК путем сшивания экзонов в разной последовательности. Считается, что альтернативный сплайсинг очень распространен. Так, один первичный транскриптат в зависимости от числа экзонов может нести информацию от 4 до 1000 генов. Другим доказательством является то, что молекул РНК в ядре мало - 2 процента, в цитоплазме можно обнаружить 145 тыс. видов мРНК.

Синтез тРНК и рРНК. тРНК- у прокариот и эукариот синтезируются в виде больших предшественников, которые затем подвергаются нуклеолитическому процессингу при участии рибонуклеаз, так как гены тРНК содержат единичные интроны. После сплайсинга формируется пространственная структура, содержащяя 2 функциональные части: триплет антикодона и аминоацильный конец. В клетках находятся 20 видов тРНК, по числу аминокислот, входящих в состав белка.

Гены рРНК располагаются в ядрышке. Молекулы рРНК первоначально транскрибируются в виде большого первичного транскриптата. Этот транскриптат подвергается нуклеолитическому процессингу, отличающегося от процессинга тРНК механизмом и сигналами. Сразу по окончанию процессинга рРНК связывается с белками и образуют большую и малую субъединицу рибосом.

Уровни регуляции экспрессии генов у эукариот. Регуляция экспрессии генов у эукариот идет на разных уровнях и в разных компартментах. В ядре экспрессия генов регулируется на уровнях генных перестроек, амплификации, структурных перестроек хроматина, транскрипции и процессинга. В цитоплазме контроль осуществляется на уровне трансляции и пострансляции.

Контроль на уровне транскрипции зависит от действия белков-регуляторов, энхансеров и сайленсеров и элементов адаптивной регуляции. Контроль на уровне процессинга РНК. Процессинг бывает 2-х типов: альтернативный и дифференциальный. Альтернативный процессинг - это механизм, определяющий какой из первичных РНК-транскриптатов будет подвергнут сплайсингу. Дифференциальный процессинг РНК заключается в том, что из общего транскриптата образуются различные молекулы РНК. Это определяется различиями в выборе сайтов полиаденилования. С дифференциальным процессингом тесно связан механизм альтернативного сплайсинга. Контроль на уровне трансляции: скорость деградации мРНК.

Иллюстративный материал: Презентация

Список рекомендуемой литературы :

Основная:

1. Стамбеков С.Ж., Короткевич О.С., Петухов В.Л.: Генетика: Учебник для вузов РК/ - Новосибирск : Б. и., 2006.- 616 с.

2. Под ред. Иванов В.И.: Генетика: Учебник для медвузов.- Академкнига, 2006.- 640 с.

3. Под ред. В.Н. Ярыгина: Биология в 2 кн. Учеб. Для мед. спец.вузов – 3-е изд.,7-е изд.. стереотип.-М.: Высш. шк, Кн. 1.-2002,2005,2006.- 448с.

4. Под ред. В.Н. Ярыгина: Биология в 2 кн. Учеб. Для мед. спец.вузов – 3-е изд.,7-е изд.. стереотип.-М.: Высш. шк, Кн. 1.-2002,2005,2006.- 352с.
Дополнительная:

1. Пехов А.П. Биология: мед.биология, генетика и паразитология: Учебник/ А.П. Пехов. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 656 с.

2. Фаллер, Джеральд М: Молекулярная биология клетки: Руководство для врачей. Пер. С англ.- М.: Бином-Пресс, 2006.- 256 с.

3. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л.: Молекулярная биология: учеб. пособие для мед.вузов.- М.: Мед.информ. агенство, 2003.- 536 с.

4. Ярмоненко С.П.: Радиобиология человека и животных. Учебное пособие для медвузов.- М. Высшая школа, 2004 г – 550 с.

5. Боденова Т.Г., Култанов Б.Ж.: Радиобиология: Учебн. пособие учебное пособие для студентов медико-биологического факультета. Караганда- 2007.-96с

6. Бочков Н.П.: Клиническая генетика: Учебник для студ. Мед. Вузов.- 2-е изд., перераб. И доп.- М.:ГЭОТАР – МЕД,2002.- 448 с.
Контрольные вопросы:

1.Что такое экспрессия генов.

2.Где происходит процесс транскрипции.

3.Где происходит этап трансляции.

4.Дайте характеристику индуктору, репрессору.

5.Назовите структурные элементы оперона.

6.Функции промотора.