Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования

Глиальные опухоли (ГО) составляют большинство первичных опухолей центральной нервной системы у взрослых и включают целый спектр опухолей различных по уровню клеточной дифференциации и злокачественности (Мацко Д.Е., 1993, Коршунов А.Г., 1998). Глиобластома (ГБ) является наиболее распространенной (60% от всех первичных опухолей) и злокачественной (выживаемость около 1 года после постановки диагноза) первичной опухолью центральной нервной системы у взрослых (Kleihues P., 2000, Wrensh M.K. et al, 2000, Лосев Ю.А., 2003, Улитин А.Ю., 2004). ГБ может развиваться de novo (первичная ГБ) или как конечный этап трансформации фибриллярных астроцитом (ФА) (II степень злокачественности согласно классификации ВОЗ) или анапластических астроцитом (АА) (III степень злокачественности согласно классификации ВОЗ) (вторичная ГБ) (Ohgaki H., 2004). Первичная ГБ в большинстве случаев (60%) встречается у лиц в возрасте старше 50 лет и для нее характерен, как правило, короткий анамнез заболевания. Вторичная ГБ чаще развивается в молодом возрасте (моложе 45 лет), трансформация в ГБ может длиться от 1 до 10 лет (в среднем 4–5 лет).

Все злокачественные ГО характеризуются ярким инвазивным фенотипом, отсутствием четких границ распространения опухоли (Коновалов А.Н. и др., 2002) и способностью к продолженному росту после хирургического удаления (Острейко О.В., 2001), что затрудняет их лечение. При лечении злокачественных ГО, наибольшее прогностическое значение имеет объем остаточной опухоли после хирургического лечения (Коновалов А.Н., Козлов А.В., Черикаев В.А. и др., 2008). К другим факторам, влияющим на прогноз, относят: возраст пациентов, функциональное состояние пациентов до операции, наличие сопутствующей патологии, гистологические характеристики опухоли, ее локализацию и др. (Олюшин В.Е., 2005, Древаль О.Н., Вакатов Д.В., 2006]. В последние годы определены важные генетические мутации при глиомах. Ведущими мутациями в патогенезе злокачественных ГО являются: потеря гетерозиготности (loss оf heterozygosity – LOH) в длинном плече хромосомы 10 (LOH 10q), например мутация гена PTEN (10q23.3), мутации различных экзонов гена-супрессора p53, мутация гена EGFR, мутация гена p16, гиперметилирование промотора (гиперМП) – гена MGMT.Эти мутации могут служить новым прогностическим фактором наряду с клиническими факторами прогноза и открывают новые перспективы и подходы в лечении ГО (Ohgaki H., Kleihues P., 2005).

Последовательное изменение генов EGFR/PTEN/Akt/mTOR – основной патогенетический путь развития первичной ГБ (Kita D., Yonekawa Y., 2007). Амплификация гена EGFR встречается в 40% всех случаев первичных ГБ (Ekstrand A.J., Sugawa N., 1992), и тесно связана с возрастом пациентов, так как практически не встречается у пациентов моложе 35 лет (Ohgaki H., Dessen., Jourde B., 2004). Прогностическая ценность амплификации гена EGFR в полной мере не изучена.

Мутация гена p53 является основным событием, играющим роль в развитии вторичной ГБ. Эта мутация выявляется в 2/3 опухолей, предшествующих вторичной ГБ (Watanabe K., 1996), редко эта мутация выявляется при первичной ГБ (менее 30% случаев) (Ohgaki H., 2004).

Мутация гена PTEN (10q23-24) является разновидностью объемной группы мутаций - потери гетерозиготности (LOH). В этом регионе располагается ген-супрессор, играющий важную роль в развитии ГБ (Rasheed B.K., 1995, Ichimura K., 1998, Fults D., 1998).

Гиперметилирование гена MGMT инактивирует его экспрессию, что способствует повышению эффективности лечения алкилирующими химиопрепаратами (Riesterer O. et al., 2007) у пациентов с ГБ.

Вышеизложенное подтверждает актуальность определения факторов генетического риска для стратификации групп пациентов и разработки дифференцированных методов комплексной терапии ГО головного мозга.

Цель исследования

Исследовать клинические, терапевтические и молекулярно-биологические факторы прогноза у пациентов с ГО головного мозга и обосновать возможность использования молекулярно-биологических маркеров опухолевых клеток в качестве самостоятельных факторов прогноза заболевания.

Задачи исследования

1. 
   Провести ретроспективный анализ клинических, хирургических и терапевтические факторов прогноза у пациентов с злокачественными ГО головного мозга.
   
2. 
   Исследовать молекулярно-биологические маркеры злокачественных клеток ГО головного мозга.
   
3. 
   Соотнести между собой клинические, хирургические и молекулярно-биологические факторы прогноза ГО головного мозга.
   
4. 
   Определить роль молекулярно-биологических маркеров в патогенезе злокачественных ГО и обосновать необходимость их определения в качестве факторов прогноза у пациентов с ГО.
   
5. 
   Разработать и внедрить в практику алгоритм применения клинико-морфологических, молекулярно-биологических и терапевтических факторов прогноза у пациентов с ГО головного мозга.
   

Научная новизна

Проведено ретроспективно-проспективное комплексное изучение клинических, морфо-функциональных и терапевтических факторов прогноза для пациентов с злокачественными ГО головного мозга получавших лечение в отделениях нейрохирургии ГКБ им. С.П. Боткина. Показано, что возраст больных, локализация опухоли, предоперационный статус больного и объем хирургической резекции опухоли, являются основными факторами, определяющими долгосрочный прогноз заболевания.

Впервые проведено изучение молекулярно-биологических маркеров (p53, p16, MGMT, PTEN и miRNA-21) в опухолевых клетках пациентов с злокачественными ГО головного мозга. Показано, что наличие мутаций в клетках опухоли коррелирует с благоприятным прогнозом у больных, получивших хирургическое или комплексное лечение.

Впервые показана возможность применения молекулярно-биологических маркеров в качестве самостоятельных независимых факторов прогноза заболевания и контроля остаточной опухоли после ее хирургического лечения.

Практическая значимость работы

Проведенное ретроспективное исследование позволило оценить в отдельности прогностическую роль и значимость каждого из исследуемых клинических факторов прогноза (возраст, пол, сопутствующая патология, функциональное состояние, гистологический характер опухоли и др.), что является основанием для стратификации групп больных и разработки дифференцированных методов лечения у больных ГО головного мозга.

На основании выполненных молекулярно-генетических исследований клеток опухоли сделано обоснованное заключение о возможности использования молекулярно-биологичесих маркеров в качестве самостоятелных независимых факторов прогноза у пациентов с злокачественными ГО головного мозга наряду с клиническими, хирургическими и терапевтическими факторами.

В выполненной работе обоснована необходимость проведения дальнейших исследований молекулярно-биологичесих факторов для инициального прогноза, контроля опухоли после хирургического или комбинированного лечения и определения риск-зависимой тактики лечения ГО головного мозга.

Внедрение в практику

Разработанные методы обследования, алгоритм оценки клинико-морфологических, терапевтических и молекулярно-генетических факторов прогноза ГО головного мозга апробирована и внедрена в практику работы отделений нейрохирургии ГКБ им. С.П. Боткина. Полученные данные используются для обучения ординаторов, аспирантов и врачей-курсантов Российской медицинской академии последипломного образования.

Положения, выносимые на защиту

1. 
   Факторами риска для пациентов с злокачественными ГО головного мозга являются: пожилой и старческий возрастные периоды, наличие сопутствующей сердечно-сосудистой патологии, низкий уровень сознания, низкий индекс Карновского, высокая степень злокачественности по данным гистологического исследования, неполное хирургическое удаление опухоли и отсутствие ЛТ в качестве адъювантной терапии после хирургического лечения.
   
2. 
   Большая продолжительность жизни пациентов с мутациями в генах p53, PTEN и p16 при инициальном обследовании и возможность использования молекулярно-биологические маркеры для контроля над поведением остаточной опухоли после хирургического лечения служит основанием для их широкого применения в качестве самостоятельных факторов риска и мониторинга при лечении пациентов с злокачественными ГО головного мозга.
   

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на I-м конгрессе нейрохирургов стран Причерноморья (Ольгинка, Краснодарский край, 2007); 118-м заседании Московского общества нейрохирургов (Москва, 2008), на международных симпозиумах «Биологические основы диагностики и лечения онкологических заболеваний» (Москва, 2007, 2009 г.г.) , XIV Международном Нейрохирургическом Конгрессе (XIV World Congress of Neurological Surgery) (Boston, 2009)

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 из них в рецензированных журналах рекомендованных ВАК РФ.

Апробация диссертации проведена на совместной научной конференции сотрудников кафедры нейрохирургии ГОУ ДПО РМАПО Росздрава, сотрудников лаборатории молекулярной онкологии ФНКЦ ДГОИ и врачей нейрохирургических отделений ГКБ им. С.П. Боткина 2 июля 2009 года.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 151 странице, включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Список литературы содержит 151 источник, из них 8 отечественных и 141 зарубежных. Иллюстрированный материал представлен 38 таблицами и 88 рисунками.

Материалы и методы исследования.

В работе проведена оценка прогностических факторов у 95 пациентов с ГО головного мозга, получавших хирургическое и комплексное лечение в профильных отделениях ГКБ им. С.П. Боткина в период с 09.01.2004 по 29.12.2007 год. У 81 пациента наблюдалась впервые выявленная ГО головного мозга, а у 14-ти продолженный рост или рецидив ранее леченной ГО головного мозга. Срок наблюдения составил с 0,2 лет до 4,3 лет, медиана наблюдения 0,85 года.

Распределение пациентов с впервые диагностированными ГО по полу, возрасту и гистологическому характеру опухоли представлено в таблице 1.
Таблица 1. Распределение пациентов с впервые диагностированными ГО по полу, возраст и гистологическому варианту для каждой половозрастной группы.

Возрастная группа	Всего		Муж.		Жен.
	n	Гистологич. варианты	n	Гистологич. варианты	n	Гистологич. варианты
Всего	81		35	26 ГБ + 3 ФА + 5 АА + 1 ОДГ	46	28 ГБ + 9 АА+ 9 ФА
Юношеский возраст	2	1 АА + 1ФА	-	-	2	1 АА + 1 ФА
Зрелый возраст, I период	5	2 ГБ + 1 ФА + 1 ОДГ + 1 АА	3	1 ГБ + 1 ФА + 1ОДГ	2	1 ГБ + 1 АА
Зрелый возраст, II период	45	29 ГБ + 9 АА + 7 ФА	23	16 ГБ + 5 АА + 2 ФА	22	13 ГБ + 4 АА + 5 ФА
Пожилой возраст	28	23 ГБ + 3 АА + 2 ФА	9	9 ГБ	19	14 ГБ + 3 АА + 2 ФА
Старческий возраст	1	1 ФА	-	-	1	1 ФА

ФА – фибриллярная астроцитома, АА - анапластичская астроцитома, ГБ – глиобластома.
У всех пациентов проводилась оценка неврологического статуса на предоперационном и послеоперационном этапах. Неврологический статус оценивался по уровню сознания в соответствии со Шкалой Комы Глазго (ШКГ), наличию общемозговой симптоматики, наличию очаговых симптомов поражения головного мозга и мнестико-интеллектуальным нарушениям. Так же оценивались изменения на глазном дне.

В зависимости от локализации опухолевого процесса пациенты были разделены на 3 группы: поверхностно-расположенная ГО, не выходящая за пределы одной доли, отмечалась у 54, ГО, выходящая за пределы одной и более областей ГМ у 16 и глубинно-расположенная ГО у 11 пациентов.

Оценка общего статуса пациентов оценивалась согласно индексу Карновского. Все пациенты с впервые выявленными ГО головного мозга были разделены на 3 группы: 1- с индексом в интервале от 100 до 80 баллов, 2 – от 70 до 50 баллов и 3 – меньше 50 баллов. Исследование учитывало наличие или отсутствие сопутствующих заболеваний.

Все пациенты с впервые выявленными ГО головного мозга получили хирургическое лечение в отделениях нейрохирургии ГКБ им. С.П. Боткина. Оценка радикальности удаления опухоли проводилась интраоперационно нейрохирургом и проведением КТГМ в послеоперационном периоде: за тотальное удаление опухоли мы принимали резекцию опухоли в пределах здоровой ткани с экономным удалением зоны перифокального отека (послеоперационное КТГМ с контрастным усилением без признаков остаточной опухоли), удаление опухоли в объеме от 95% до 75% расценивалось как субтотальное удаление опухоли, удаление менее 75% опухолевой ткани расценивалось как частичное удаление. Тотальное удаление опухоли выполнено у 23 (28,4%) пациентов, субтотальное у 54 (66,6%) и частичное у 4 (5%) пациентов. 17 (21%) пациентов из 81в послеоперационном периоде проводилась адъювантная лучевая терапия, в средней дозе 50 Гр (минимальная доза составила 9,8 Гр, максимальная 60,7 Гр).

Из 14 пациентов с продолженным ростом или рецидивом ГО у 11-ти выполнена субтотальная и у 3-х тотальная резекция опухоли. Лучевая терапия послеоперационном периоде проводилась 3 пациентам.

Исследование молекулярно-биологических факторов (МБФ) прогноза проведено у 44 из 81 пациентов с впервые выявленными ГО головного мозга, с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. У 42 из них обследованы опухолевые ткани, полученные из парафиновых блоков, у 2 из нативной биопсии. Гистологическая характеристика пациентов обследованных на онкомаркеры (ОМ) была следующей у 35-ти пациентов – глиобластома, у 4-х – анапластическая астроцитома, у 4-х – фибриллярная астроцитома у 1-го олигодендроглиома.

Поиск генетических мутаций опухолевых клеток проводился в следующих генах: p53, PTEN, p16, MGMT, кроме того исследована гиперпродукция miRNA-21(микроРНК-21).

При изучении гена p53 исследованы 5, 6, 7 и 8 экзоны, изменения, в которых, чаще других задействованы в патогенезе ГО. При исследовании гена p53 использовался метод PCR-SSCP-электрофореза и метод двустороннего секвенирования.

Внутри гена PTEN исследованы 1 и 2 экзоны с использованием методов PCR-SSCP – электрофореза и двустороннего секвенирования, кроме того обследован статус метилирования промотора (МП) с использованием метил-чувствительных рестриктаз и последующей ПЦР.

Для генов p16 и MGMT исследован статус МП, 10 пациентов обследовано на наличие гиперпродукции miRNA-21.

Результаты терапии ГО оценивались по количеству летальных исходов в результате операции или ее осложнений; количеству пациентов, имевших продолженный рост ГО с дальнейшей ее малигнизацией; числу пациентов с продолженным ростом ГО без стабилизации процесса; уровню достижения стабилизации или ремиссии; числу рецидивов или продолженного роста ГО после ремиссии/стабилизации процесса; потери наблюдения (LFU); количеству летальных исходов по достижении ремиссии/стабилизации процесса и числу пациентов, находящихся в полной или частичной ремиссии.

Для объективизации отдаленных результатов терапии пациентов с ГО проводилась оценка по кривым общей (overall survival – OS) и бессобытийной (event free survival – EFS) выживаемости, построенными по методу Каплана-Майера. Анализ результатов проводился с использованием программы для статистической обработки данных STATISTICA for Windows 6.0.

Результаты исследований и их обсуждение.

Общие результаты лечения пациентов с впервые выявленной ГО головного мозга (n=81) представлены на рисунке 1. Безрецидивная выживаемость больных более 4 лет составила 30%, с установлением плато через 1,5 года после хирургического или комбинированного лечения.

Рисунок 1. Оценка OS пациентов с впервые диагностированной ГО головного мозга (n=81).
Возраст пациентов является достоверным фактором риска среди пациентов с впервые выявленной ГО головного мозга (рис. 2). Больные пожилого и старческого возраста имели худший прогноз, такая же закономерность была получена отдельно для группы пациентов с ГБ.



Рисунок 2. OS пациентов с впервые диагностированной ГО в зависимости от возраста. 1 - юношеский возраст, оба периода зрелого возраста; 2 - группы пожилого и старческого возраста. Медианы выживаемости: 1– 1,18 года, 2– 0,42 лет.
Анализ результатов лечения пациентов с впервые выявленной ГО головного мозга в зависимости от пола показал, что продолжительность жизни среди женской популяции выше, чем среди мужской и составила 0,73 года – мужчины и 0,99 года – женщины. Для группы пациентов с впервые выявленной ГБ, также получена достоверная закономерность, показывающая, что общая выживаемость (OS) выше среди женской популяции.
Таблица 2. Результаты лечения пациентов с впервые диагностированной ГО в зависимости от гистологического варианта

(ФА - фибриллярная астроцитома, АА – анапластическая астроцитома, ГБ – глиобластома).

	ФА		АА		ГБ
	n	%	n	%	n	%
Всего пациентов	12	100,0	14	100,0	54	100,0
Смерть в результате операции или ее осложнений	1	8,3	2	14,2	9	16,6
продолженный рост (без стабилизации)	0	0	2	14,2	14	25,9
Достигли стабилизации/ремиссии	11	91,6	10	71,4	31	57,4
рецидив (продолженный рост после ремиссии/стабилизации)	0	0	4	40,0	17	54,8
Смерть в стабилизации (ремиссии)	0	0	0	0	2	6,4
Продолженный рост с дальнейшей малигнизацией (после стабилизации/ремиссии)	1	9,0	0	0	1	3,2
LFU	1	9,0	1	10,0	4	12,9
Полная или частичная ремиссия	9	75,0	5	35,7	7	12,9

Сводные данные о результатах лечения пациентов с впервые выявленной ГО в зависимости от гистологического характера опухоли представлены в таблице 2, так как случай ОДГ единичный, он не учитывался в анализе результатов лечения и выживаемости.

Было показано, что гистологический вариант является достоверным фактором прогноза у пациентов с ГО. При исследовании общей выживаемости в зависимости от гистологического варианта ГО, медианы выживаемости составили: 0,78 года для ГБ, 1,41 года для АА и медиана выживаемости для ФА не достигнута (p < 0,05).

Результаты лечения пациентов с впервые выявленными ГО также оценивались в зависимости от локализации опухоли. В нашем исследовании было показано, что локализация, распространенность и отношение опухолевого процесса к центральным отделам головного мозга является значимым фактором прогноза. Так пациенты с поверхностно расположенными ГО, не выходящими за пределы одной доли головного мозга, имели достоверно более высокую продолжительность жизни, чем пациенты с ГО, выходящими за пределы одной и более областей головного мозга и группой пациентов с глубинно-расположенными ГО (рис. 3).

Частота и структура встречаемости различной неврологической симптоматики у пациентов с ГО головного мозга была следующей. У 53 (65,4%) пациентов в предоперационном статусе отмечалось ясное сознание (ШКГ 15 баллов), у 28 (34,6%) пациентов отмечались различные виды количественного нарушения сознания. Уровень сознания ниже 15 баллов ШКГ на предоперационном этапе, является фактором риска (медиана выживаемости составила 0,99 года – ясное сознание, 0,23 года – пациенты с угнетением сознания).


Рисунок 3. OS пациентов с впервые диагностированной ГО в зависимости от локализации опухоли (1 - поверхностно-расположенная ГО, не выходящая за пределы одной доли; 2 - ГО, выходящая за пределы одной и более областей ГМ; 3 - Глубинно-расположенная ГО). Медианы выживаемости: 1– 0,96 года; 2 – 0,91 года; 3 – 0,62 года.
Группа пациентов с индексом Карновского в интервале от 100 до 80 баллов составила 17 (20,9%), вторая (индекс Карновского от 70 до 50 баллов) 45 (55,6%) пациентов и третья (индекс Карновского < 50) 19 пациентов (23,5%). Низкий уровень индекса Карновского, является достоверным фактором риска у пациентов с ГО головного мозга (медианы общей выживаемости: 1 группа – отсутствует, 2 группа– 0,85 года и 3 – 0,18 лет (p < 0,05)) .

У 43 (53%) пациентов не было выявлено значимой сопутствующей патологии и у 30 (37%) выявлена сердечнососудистая патология. Наличие выраженной сопутствующей патологии является достоверным фактором риска для пациентов с ГО головного мозга: общая выживаемость пациентов без тяжелой сопутствующей патологии составила 1,18 года и 0,48 лет с сердечнососудистыми заболеваниями (p < 0,05).

Терапевтические факторы риска оценивались радикальностью хирургического лечения. Так 23 пациента с тотальным удалением опухоли, имели большую продолжительность жизни, чем среди пациентов (n=58) с не тотальным (субтотальное + частичное) удалением опухоли, медианы общей выживаемости (OS) составили: тотальное удаление - 1,2 года и не тотальное удаление - 0,85 лет (p < 0,05).

В послеоперационном периоде ЛТ проводилась 17 (21%) пациентам, и являлась достоверно положительным фактором прогноза для пациентов с ГО головного мозга (медианы выживаемости (OS) составили: без ЛТ- 0.64 года и с ЛТ – не достигнута, плато кривой выживаемости установлено на уровне 1,5 лет (p < 0,001).

Таким образом, полученные в результате исследования вышеперечисленные данные позволяют оценить прогностическую значимость различных инициальных факторов прогноза для пациентов с впервые выявленными ГО. При ранжировании диагностической значимости различных прогностических факторов, выполненных методом нелинейного регрессионного анализа Кокса, показана их последовательность: гистологический вариант опухоли, индекс Карновского, возраст пациента, наличие сопутствующей сердечнососудистой патологии и объем удаленной опухоли (p < 0,05). Кроме того выполнено ранжирование факторов, имеющих значение близкое к достоверному (0,1 < p > 0,05), и позволяющих оценивать закономерные тенденции при увеличении групп наблюдения: пол пациента, уровень сознания на момент операции и локализация опухоли.

Продолжительность жизни пациентов с продолженным ростом или рецидивом ГО головного мозга была достоверно ниже, чем у пациентов с впервые выявленными ГО, медиана выживаемости (OS) пациентов с продолженным ростом или рецидивом ГО головного мозга составила – 0, 52 года, в то время, как для пациентов с впервые выявленными ГО: 0,78 года – с ГБ, 1,41 года – с АА и с ФА не достигнута.

Результаты анализа молекулярно-биологических факторов прогноза представлены в таблице 3.
Таблица 3. Молекулярно-биологические факторы прогноза.

Ген	Мутация	Всего (100%)
PTEN (1 экзон)	0 (0%)	44
PTEN (2 экзон)	0 (0 %)	44
PTEN (гиперМП)	4 (27%)	15
P16	7 (19%)	37
p53 (все экзоны)	11 (30%)	37
p53 (5 экзон)	5 (13,5%)	37
p53 (6 экзон)	1 (3%)	37
p53 (7 экзон)	2 (5%)	37
p53 (8 экзон)	3 (8%)	37
MGMT (гиперМП)	17 (50%)	34
miRNA - 21	8 (80%)	10

При исследовании на наличие мутаций первого и второго экзона гена PTEN мутаций не выявлено. Однако, при исследовании статуса МП гена PTEN мутации выявлены у 4 (27%) из 15 обследованных пациентов. Продолжительность жизни пациентов с гиперМП гена PTEN оказалась несколько выше, чем у пациентов с нормальным статусом МП (рис. 4).

Рисунок 4. OS пациентов с впервые диагностированной ГО головного мозга в зависимости от статуса МП гена PTEN (1 – нормальный статус МП, 2 - гиперМП). Медианы выживаемости: 1– 0,57 года, 2– 0,75 лет.
На наличие мутации в различных участках гена p53 обследовано 37 пациентов, при этом мутации выявлены в 11 случаях (30%). В частности, при исследовании 5 экзона, выявлено наибольшее количество мутаций – 5 (13,5%). Мутация в 6, 7 и 8 экзонах выявлена в 1 (3%), 2 (5%) и 3 (8%) случаях, соответственно. Учитывая малую выборку по каждому экзону в отдельности, выполнен общий расчет для всех экзонов гена p53. В нашем исследовании продолжительность жизни пациентов с мутациями в различных экзонах гена p53 оказалась несколько выше, чем у пациентов без мутаций (рис. 5).


Рисунок 5. OS пациентов с впервые диагностированной ГО головного мозга в зависимости от мутаций гена p53. 1 - нет мутаций , 2 - есть мутации. Медианы выживаемости: 1– 0,64 года, 2– 0,96 лет.
ГиперМП гена p16 выявлено у 7 (19%) из 37 пациентов. Продолжительность жизни пациентов с гиперМП гена p16 была несколько выше, чем у пациентов с нормальным статусом МП гена p16 (рис. 6).


Рисунок 6. OS пациентов с впервые диагностированной ГО головного мозга в зависимости от мутаций гена p16 (1 - нет мутаций, 2 - есть мутации). Медианы выживаемости: 1– 0,64 года, 2– 1,07 лет.
При исследовании статуса МП гена MGMT, гиперМП выявлено у 17 (50%) из 34 пациентов. Наличие гиперМП гена MGMT, вызывающее подавление экспрессии данного гена, способствует повышению эффективности терапии алкилирующими химиопрепаратами [13, 14], однако, изучение данной опции не входило в цели нашего исследования. Мы ограничились оценкой влияния гена MGMT на продолжительность жизни пациентов. Достоверной разницы в продолжительности жизни между пациентами с гиперМП и с нормальным статусом МП гена MGMT не получено (рис. 7).


Рисунок 7. OS пациентов с впервые диагностированной ГО головного мозга в зависимости от статуса МП гена MGMT (1 – нормальный статус МП, 2 - гиперМП). Медианы выживаемости: 1– 0,78 года, 2– 0,62 лет.

Исследование молекулярно-генетических факторов (онкомаркеров) показало, что неблагоприятные инициальные и терапевтические факторы риска коррилируют с отсутствием мутаций в генах p53, PTEN и p16. В то время как наличие мутаций в данных генах коррелировало с благоприятными факторами прогноза. Объяснением данного феномена служат механизмы иммунного ответа, в соответствии с которыми иммуногенность опухоли, а соответственно и величина иммунного ответа, зависит от наличия мутационных изменений в клетках опухоли.

Таким образом, нами было показано, что молекулярно-генетические маркеры опухоли определяемые, как в биопсийном/операционном материале, как и в биологических жидкостях больного, могут рассматриваться, как самостоятельные факторы прогноза при ГО головного мозга. Кроме того, при их сопоставлении с клинико-морфологическими факторами возможен более точный мультифакториальный прогноз продолжительности жизни и эффективности лечения пациентов со злокачественными глиальными опухолями головного мозга.

Выводы

1. 
   Глиальные опухоли головного мозга наиболее часто встречаются у пациентов старше 50 лет и имеют неблагоприятный прогноз. Безрецидивная выживаемость больных более 4 лет составила 30% с установлением плато через 1,5 года после хирургического или комбинированного лечения.
   
2. 
   Возраст пациентов и гистологический характер опухоли являются одними из наиболее значимых прогностических факторов для пациентов с глиомами головного мозга. Так пожилой и старческий возрастные периоды и гистологический диагноз ГБ являются отрицательными прогностическими факторами.
   
3. 
   Женский пол, поверхностная локализация и ограниченность опухоли, высокий уровень сознания и отсутствие тяжелой сопутствующей патологии являются факторами, положительно влияющими на прогноз пациентов со злокачественными глиомами.
   
4. 
   Тотальная резекция опухоли в пределах здоровой ткани является важнейшим лечебным прогностическим фактором, определяющим выживаемость пациентов. Использование лучевой терапии в качестве адъювантного компонента после хирургического удаления опухоли увеличивает медиану выживаемости пациентов с ГО.
   
5. 
   Пациенты с продолженным ростом или рецидивом ГО имеют достоверно худший прогноз в сравнение с пациентами, у которых впервые диагностирована ГО.
   
6. 
   Молекулярно-генетические маркеры (мутация генов p53 и PTEN, а также гиперМП гена p16) могут рассматриваться, как самостоятельные независимые факторы прогноза при ГО головного мозга, что основано на факте увеличения продолжительности жизни пациентов с наличием мутаций в клетках опухоли при первичном морфологическом исследовании после хирургических операций.
   
7. 
   Несмотря на отсутствие достоверных различий между пациентами с гиперМП и с нормальным статусом МП гена MGMT, выявлена незначительная тенденция к большей продолжительности жизни у пациентов с нормальным статусом МП гена MGMT, что указывает на участие белка MGMT в репарации ДНК и защите клетки от трансформации, вызванной алкилированием, что также может быть использовано в качестве маркера риска и для мониторинга течения заболевания.
   

Практические рекомендации

1. 
   Первичная диагностика глиальных опухолей должна включать оценку клинических, функциональных, морфологических и молекулярно-генетических факторов риска, определяющих исход хирургического лечения.
   
2. 
   К положительным факторам риска ГО головного мозга относятся: молодой возраст, женский пол, поверхностное расположение опухоли не выходящей за пределы одной доли головного мозга, ясное сознание и высокий индекс Карновского на дооперационном этапе, отсутствие тяжелой сопутствующей патологии, тотальное удаление опухоли, проведение адъювантной ЛТ в послеоперационном периоде, первичный характер заболевания и наличие мутаций (в генах p53, PTEN, p16) в клетках опухоли.
   
3. 
   К отрицательным факторам риска ГО головного мозга относятся: пожилой и старческий возрастные периоды, мужской пол, глубинное и широкое распространение опухолевого процесса, угнетение сознания и низкий индекс Карновского на дооперационном этапе, наличие выраженной сердечнососудистой патологии, не тотальное удаление опухоли, отсутствие проведения ЛТ в послеоперационном периоде, вторичный характер заболевании (рецидив или продолженный рост) и наличие гиперМП гена MGMT.
   
4. 
   При ранжировании факторов риска наибольшее значение имеют: возраст пациента, радикальность хирургического лечения и гистологический характер опухолевой ткани.
   
5. 
   Молекулярно-генетические методы служат не только инициальными факторами риска, но и могут быть использованы для контроля течения опухоли, так как нуклеиновые кислоты опухолевых клеток могут быть исследованы в динамике в биологических жидкостях, таких как кровь, моча, слюна и СМЖ.
   

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. 
   Белохвостов А.С., Древаль О.Н., Фениксов В.М., Зарецкий А.Р., Румянцев А.Г. Молекулярно-генетические изменения при опухолях головного и спинного мозга // Впросы гематологии/онкологии и иммунологии в педиатрии. – 2006. - Т. 5 : №4. - стр. 40-47.
   
2. 
   Belokhvostov A.S., Feniksov V.M., Vdovichenko K.K., Zaretsky A.R. Detection of tumor-derived DNA with EGFR mutation in different biological samples from cancer patients: feasibility and optimization of the method // First AACR International Conference on Molecular Diagnostics in Cancer Therapeutic Development. – 2006. - Abstract B19.
   
3. 
   Белохвостов А.С., Зарецкий А.Р., Фениксов В.М, Абрамов А.А., Маркова С.И., Румянцев А.Г. Оптимизация молекулярно-генетических анализов для дифференциальной диагностики злокачественных опухолей, мониторинга опухолевого присутствия и своевременной детекции приобретенной лекарственной устойчивости // Материалы Всероссийской научно-практической конференции “Отечественные противоопухолевые препараты”. Москва. – 2007. - стр. 63.
   
4. 
   Древаль О.Н., Белохвостов А.С., Фениксов В.М. Молекулярно-генетические критерии прогноза хирургического лечения глиобластом головного мозга // Материалы всероссийской научно-практической конференции “Поленовские Чтения”. – С-Пб. – 2007. - стр. 200.
   
5. 
   Dreval O.N., Belokhvostov A.S., Feniksov V.M. Role of Molecular-Genetic Methods in Diagnostics and Prognosis in Patients with Glioblastoma Multiforme // Workshop Report, V-th Black Sea Neurosurgical Congress. Olginca, Krasnodar Area. - 2007.
   
6. 
   Белохвостов А.С., Фениксов В.М., Суворова Е.Г., Горючева О.В., Тимаков М.А., Абрамов А.А., Румянцев А.Г., Тарасенко Е.М. Оценка статуса метилирования гена MGMT в ДНК, выделенной из клеток крови, слюны и опухолевого материала при новообразованиях головного мозга у детей // Материалы IV съезда детских онкологов РФ с международным участием. Москва: Практическая медицина. – М. – 2008. - стр. 56.
   
7. 
   Белохвостов А.С., Фениксов В.М. Молекулярно-генетические аспекты диагностики и прогноза глиобластомы // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2008. - T. 7: №8. - стр. 36-43.
   
8. 
   Древаль О.Н., Белохвостов А.С., Фениксов В.М. Клинические и цитогенетические факторы прогноза при глиальных опухолях головного мозга // Вопросы нейрохирургии им. академика Н.Н. Бурденко. - 2009. - № 4. – стр. 7-12.
   

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АА	анапластичекая астроцитома;
ГБ	глиобластома;
ГиперМП	гиперметилирование промотора;
ГО	глиальная опухоль;
КТГМ	компьютерная томография головного мозга;
ЛТ	лучевая терапия;
МБФ	молекулярно-биологические факторы;
МП	метилирование промотора;
ОДГ	олигодендроглиома;
ОМ	онкомаркеры;
ПЦР	полимеразная цепная реакция;
ФА	фибриллярная астроцитома;
ШКГ	шкала комы Глазго;
EGFR	epidermal growth factor receptor (рецептор эпидермального фактора роста);
EFS	event free survival (бессобытийная выживаемость);
LFU	lost to follow-up (потеря наблюдения);
LOH	loss of heterozygosity (утрата гетерозиготности);
miRNA	micro ribonucleic acid (микро РНК);
OS	overall survival (общая выживаемость);
PCR-SSCP	polymerase chain reaction - single strand conformation polymorphism (полимеразная цепная реакция –конформационный полиморфизм однонитевых фрагментов)