Минерализация биологического материала смесью нитратной и сульфатной кислот
Разрушение биологического материала смесью нитратной и сульфатной кислот является основным методом, который применяется в химико-токсикологических лабораториях нашей страны.
В начале минерализации концентрированная сульфатная кислота играет водоотнимающую роль. Этот процесс усиливается с повышением температуры. Благодаря водоотнимающему действию концентрированная сульфатная кислота разрушает структуру клеток и тканей биологического материала. При повышении температуры (больше 110 °С) и концентрации (до 60-70 %) сульфатной кислоты она проявляет окислительные свойства с выделением сульфур (IV) оксида.
Нитратная кислота, которая входит в состав смеси с сульфатной кислотой, в начале минерализации является более слабым окислителем. Через определенный промежуток времени часть нитратной кислоты при окислении биологического материала превращается в оксиды Нитрогена и нитритную кислоту, которые являются автокатализаторами интенсивного процесса окисления органических веществ нитратной кислотой. С образованием оксидов Нитрогена и нитритной кислоты, а также при повышении температуры, нитратная кислота проявляет сильные окислительные свойства.
При нагревании биологического материала со смесью нитратной и сульфатной кислот происходит не только разрушение органических веществ этими кислотами, а и некоторые побочные реакции, например реакции сульфования и нитрования органических соединений. В основном такой процесс проходит с аминокислотами, содержащими фенильные группы. Нитрование и сульфование органических веществ при разрушении биологического материала смесью нитратной и сульфатной кислот является нежелательным, поскольку нитро- и сульфосоединения трудно разрушаются этой смесью.
При разбавлении сульфатной и нитратной кислот водой нитрование и сульфование органических соединений этими кислотами значительно уменьшается. Поэтому для разрушения органических веществ используют не концентрированные, а частично разбавленные сульфатную и нитратную кислоты. В процессе разрушения биологического материала образуются определенные количества оксидов Нитрогена, нитритной и нитрозилсульфатной HO-SO2ONO кислот, которые мешают открытию некоторых катионов в минерализатах.
Разрушение биологического материала смесью сульфатной и нитратной кислот происходит в 2 этапа. На первом этапе происходит деструкция (нарушение структуры) биологического материала. Этот этап длится 30-40 мин. После деструкции остается прозрачная желто-бурая жидкость, которую называют деструктатом. В деструктате остаются неразрушенным значительное количество молекул белков и продуктов их гидролиза (пептидов, аминокислот и т.п.). На втором этапе минерализации, более продолжительном во времени сравнительно с первым, почти полностью разрушаются белковые вещества. Для окончательного разрушения органических веществ к нагретому минерализату каплями прибавляют концентрированную нитратную кислоту. Так, скорость и полнота разрушения биологического материала этим методом зависит от количества нитратной и сульфатной кислот.
При добавлении большого количества нитратной кислоты образуется значительное количество нитритной кислоты и оксидов Нитрогена, которые в процессе разрушения биологического материала выделяются из колбы и загрязняют воздух лаборатории. При недостаточном количестве нитратной кислоты сульфатная кислота обугливает биологический материал. Об этом свидетельствуют почернение минерализата и выделение из колбы значительного количества газов, с которыми могут попадать в воздух соединения Арсена и Меркурия, если эти элементы присутствовали в исследуемом объекте.
Разрушение биологического материала сульфатной и нитратной кислотами считается законченным тогда, когда после прекращения добавления каплями концентрированной нитратной кислоты (при нагревании колбы) будет выделяться белый газ сульфатной кислоты, не будет наблюдаться потемнение жидкости.
В полученном минерализате открывают катионы соответствующих металлов. Тем не менее, открытию катионов многих металлов мешают имеющиеся в минерализате остатки нитратной кислоты, а также оксидов Нитрогена, нитритной кислоты, нитрозилсульфатной кислоты, которые образовались в процессе минерализации. Поэтому нужно осуществить денитрацию минерализатов.
Денитрация - это процесс освобождения минерализатов от указанных выше соединений Нитрогена. С этой целью сначала использовали так называемый гидролизный метод. Согласно которому при продолжительном (10-12 ч.) кипячении разбавленного водой минерализата, из него полностью исчезают пересчитанные выше соединения, содержащие Нитроген. Если для удаления из минерализата нитратной кислоты и оксидов Нитрогена его нужно кипятить в течении 2-3 ч., то для удаления нитрозилсульфатной кислоты необходимо 10-12 ч. За это время происходит полное разложение (гидролиз) этой кислоты и выделение в воздух продуктов гидролиза.
В результате продолжительной денитрации минерализатов гидролизным способом из них практически полностью могут исчезнуть соединения Арсена и Меркурия. Поэтому возникшая потребность в применении новых способов денитрации минерализатов. С этой целью были предложены способы денитрации, которые базируются на применении химических реактивов, реагирующих с нитратной кислотой и продуктами ее разложения во время минерализации. Для денитрации минерализатов были предложены мочевина, натрий сульфит и некоторые другие вещества. При использовании мочевины денитрация минерализата, нагретого до 135-140 °С, происходит за 3-5 мин., а при использовании натрий сульфита денитрация минерализата, нагретого свыше 100 °С, заканчивается через 10-15 мин. В 1952 г. Ф.В. Зайковский предложил для денитрации формальдегид, который взаимодействует с нитратной кислотой, с выделением азота и карбон (IV) оксида:
4HNО3 + 5НСНО 2N2 + 5СО2 + 7Н2О.
Во время взаимодействия нитритной кислоты с формальдегидом выделяются азот, нитроген (II) оксид, карбон (IV) оксид и вода:
4НNО2 + 2НСНО N2 + 2NO + 2СО2 + 4Н2О,
Нитроген (II) оксид окисляется кислородом воздуха до нитроген (IV) оксида, который при взаимодействии с водой дает нитратную и нитритную кислоты:
2NO + О2 2НNО2;
2NО2 + H2О HNO2 + HNО3.
Образованные при этом нитратная и нитритная кислоты реагируют с формальдегидом так, как указано выше.
Нитрозилсульфатная кислота при нагревании с водой разлагается. Образованная при этом нитритная кислота реагирует с формальдегидом.
Для денитрации минерализатов, полученных разрушением биологического материала нитратной и сульфатной кислотами, к ним добавляют 10-15 мл воды. В эту жидкость, нагретую до 110-130 °С, осторожно каплями прибавляют формалин (40 %-ый раствор формальдегида). При этом наблюдается значительное выделение пузырьков газа (N2 и NO), иногда с оранжево-бурой окраской (NO2). Процесс денитрации минерализатов формалином длится 1-2 мин. Для этого нужно от нескольких капель до нескольких милилитров формалина. Избыток формалина, который не вступил в реакцию с нитратной и нитритной кислотами, удаляют нагреванием жидкости в течении 5-10 мин.
С целью проверки полноты денитрации минерализатов проводят реакцию с раствором дифениламина (0,5 г дифениламина растворяют в 100 г концентрированной сульфатной кислоты и добавляют 20 мл дистиллированной воды). На предметное стекло или на фарфоровую слойинку с углублениями наносят 1-2 капли минерализата и прибавляют каплю раствора дифениламина в сульфатной кислоте. При наличии нитратов, нитритов и оксидов Нитрогена в минерализате появляется синий цвет. Эта реакция базируется на окислении дифениламина нитратной кислотой и другими соединениями Нитрогена до дифенилбензидина, который в свою очередь окисляется теми же окислителями в соединение синего цвета:
Денитрация считается законченной, когда реакция минерализата с раствором дифениламина будет отрицательной (отсутствие синего цвета). Если при добавлении раствора дифениламина в концентрированной сульфатной кислоте к минерализату синий цвет появится, то денитрацию осуществляют повторно.
Проведение минерализации
Берут 100 г биологического материала (модельную задачу), измельчают, помещают в колбу Кельдаля на 500 мл и заливают 75 мл смеси, которая состоит из одинаковых объемов нитратной, сульфатной кислот и дистиллированной воды. На слабом огне проводят деструкцию биологического материала, которая длится 30-40 мин. При этом образуется прозрачный раствор желтого или бурого цвета. Потом на сильном огне и с периодическим добавлением раствора нитратной кислоты проводят полную минерализацию биоматериала. Минерализация считается законченной тогда, когда при нагревании (без добавления нитратной кислоты) во время выделения над жидкостью белого газа сульфатной кислоты - прозрачная жидкость (минерализат) перестанет темнеть. После окончания минерализации к охлажденному минерализату прибавляют 10-15 мл воды, нагревают до кипения и с целью проведения денитрации осторожно каплями прибавляют формалин. Для проверки полноты денитрации каплю минерализата наносят на фарфоровую слойинку и прибавляют каплю раствора дифениламина в концентрированной сульфатной кислоте. При появлении синего цвета проведения денитрации следует продолжить. После полной денитрации избыток формалина отстраняют нагреванием жидкости в течении 5-10 мин. Объем минерализата доводят водой до 180-200 мл.
Метод минерализации биологического материала смесью нитратной и сульфатной кислот имеет ряд положительных сторон и преимуществ сравнительно с методом разрушения органических веществ хлоратом калия и хлоридной кислотой. Минерализация с помощью метода разрушения органических веществ нитратной и сульфатной кислотами происходит быстрее, чем хлоратом калия и хлоридной кислотой. При минерализации органических веществ нитратной и сульфатной кислотами получают относительно небольшие объемы минерализатов. Это положительно влияет на чувствительность методов открытия “металлических” ядов в минерализатах.
Вместе с тем, несмотря на положительные стороны метода разрушения органических веществ нитратной и сульфатной кислотами, он непригоден для изолирования Меркурия из биологического материала, поскольку значительное его количество теряется.
<предыдущая страница | следующая страница>