МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В.ЛОМОНОСОВА


БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА БИОИНЖЕНЕРИИ

Проточный лазерный цитофлуориметр Cytomics FC 500: устройство и методы измерений

Методическая разработка к циклу задач Большого практикума

Содержание


Аннотация
Данный цикл задач Большого практикума направлен на изучение теоретических основ проточной цитометрии, получение представлений о сфере применения и возможностях метода, получение практических навыков работы на проточном цитофлюориметре. Цикл рассчитан на студентов 4 курса, изучивших основы цитологии, гистологии и иммунологии, и имеющих навыки работы с культурами клеток эукариот. Проведение цикла для группы из 2-4 студентов требует 6 дней по 1-4 часа (см. программу цикла ниже). По теоретической части сдается коллоквиум. Отчетность студента по практической части – в виде оформленной практической работы по каждой задаче.
План оформления практической работы.

1. 
   Цели и задачи
   
2. 
   Ход работы (прототол эксперимента)
   
3. 
   Результаты и выводы.
   

Необходимое оборудование и расходные материалы (для поведения 1 цикла практикума в группе из 3 студентов):

• 
  система для проточной цитофлюориметрии Cytomics FC 500 (Beckman Coulter);
  
• 
  настольная центрифуга для микропробирок; вортекс; термостат суховоздушный; холодильник (для хранения реактивов);
  
• 
  1 комплект автоматических пипеток (на 10 мкл, 40 мкл, 200 мкл и 1 мл);
  
• 
  наконечники для автоматических пипеток (40 наконечников на 10 мкл, 80 шт – на 200 мкл и 40 шт – на 1 мл); микропробирки (20шт), культуральные пробирки на 12 мл (4шт), культуральные флаконы на 25 см² (3шт), специальные пробирки для цитометра (16шт)
  
• 
  5л обжимающей жидкости Isoton (Beckman Coulter), 0,8л промывочного раствора Clenz (Beckman Coulter);
  
• 
  0,4мл суспензии калибровочных микросфер Flow-Check (Beckman Coulter);
  
• 
  0,1л воды mQ;
  
• 
  культура клеток HL-60 (готовая для экспериментов) – 10 мл с плотностью 1млн кл/мл; 30 мл среды RPMI-1640 (без фенолового красного, с 10% телячьей фетальной сыворотки, 2мМ L-глутамина, 10мМ HEPES и 1мМ пирувата);
  
• 
  следующие реактивы: 100мкл (1мМ) водного раствора йодистого пропидия, 1мл (200мМ) водного раствора CaCl₂, 100мкл раствора аннексина V (конъюгированного с FITC, Calbiochem), 50мкг меллитина, 100мкг доксорубицина.
  

Программа практикума.

День 1. Изучение теоретических основ проточной цитометрии, устройства цитометра и принципов его работы. – 4ч.

День 2. Коллоквиум по теоретической части. – 1-2ч.

День 3. Отработка включения, выключения и калибровки прибора. Выполнение практической задачи «Оценка цитотоксичности мелиттина для клеток HL-60» - основные навыки работы с цитометром (4ч).

День 4. Начало выполнения практической задачи «Изучение апоптоза клеток HL-60, индуцированного доксорубицином» - постановка эксперимента (2ч).

День 5. Продолжение практической задачи «Изучение апоптоза клеток HL-60, индуцированного доксорубицином» - измерение флуоресценции в нескольких каналах (4ч).

День 6. Сдача практических работ. – 1-2ч.
I. Теоретическая часть
Сокращения

Clenz  – стандартный промывочный растор (производства Beckman Coulter)

dH₂O – дистиллированная вода

FS – малоугловое рассеяние (forward scatter)

SS – боковое рассеяние (side scatter)
1 Устройство и основные принципы работы проточного цитофлуориметра Cytomics FC 500

Проточная цитометрия позволяет измерять интенсивность флуоресценции и рассеяния света от частиц, проходящих по одной в потоке жидкости через измерительную ячейку. Поскольку частицы (чаще всего клетки) анализируются по одной, в результате измерения имеется не только среднее значение параметра, но и его распределение в популяции. Высокая скорость измерения (до 10³ частиц в секунду) обеспечивает получение статистически достоверных результатов за короткое время. Современная оптика цитометра позволяет регистрировать сигнал в 2 каналах расеяния (малоугловое и боковое) и до 5 каналов флуоресценции одновременно. Поэтому проточная цитометрия является мощным инструментом системного мультипараметрического анализа клеточных популяций и продуктивно используется в в клеточной биологии, иммунологии и медицинской диагностике.

1.1 Общий вид

Система для проточной цитофлюориметрии Cytomics FC 500 состоит из следующих основных устройств: цитометр, блок питания цитометра, управляющий компютер.

1.2 Цитометр

На передней панели цитометра имеется индикаторное окно (рис.1), отображающее состояние цитометра, в том числе такие важные события, как падение уровня обжимающей жидкости.

1.2.1 Система подачи жидкостей (fluidics)

Система подачи жидкостей (флюидика) – важный компонент любого цитометра: она осуществляет подачу образца в измерительную ячейку таким образом, что частицы суспензии проходят через центральную зону возбуждающего лазерного луча (область с максимальной интенсивностью света) строго по одной. Это достигается при помощи гидродинамического фокусирования образца по центру узкого канала в потоке обжимающей жидкости.

Обжимающая жидкость обычно представляет собой профильтрованный раствор с физиологическим содержанием солей, ионной силой и рН.
Р
ис. 1. Индикаторное окно цитометра Cytomics FC 500.
Устройство проточной ячейки представлено схематично на рис.2. Образец подается с оперделенной скоростью в центр канала, где течет обжимающая жидкость, коаксиально потоку обжимающей жидкости. Согласно свойствам ламинарного потока, поток образца не перемешивается с потоком обжимающей жидкости (хотя диффузия малых молекул происходит) и оба остаются коаксиальными. Поток образца (начиная с пристеночных слоев) испытывает вязкое трение о границу с обжимающей жидкостью и ускоряется (или замедляется) так, что его скорость становится равной скорости тока обжимающей жидкости. Соотношение давлений, под которыми подаются образец и обжимающая жидкость определяет соотношение поперечных сечений потоков, т.е. конечный диаметр потока образца у точки детекции: повышение давления, с которым подается образец, приводит к уширению диаметра потока. Так и осуществляется фокусирование. Сужение канала перед точкой детекции приводит к тому, что а) оба потока ускоряются ( V_{объемная}(мл/мин) = S_{отверстия}(см²) * v_{линейная}(см/мин) ); б) возросшее давление обжимающей жидкости дополнительно сужает поток образца.





Рис. 2. Схема устройства проточной ячейки. Справа: слишком высокое давление на образец приводит к уширению конечного диаметра потока, а следовательно, частицы могут попадать не в центр освещающего луча или освещаться не по одной.

Потоки жидкостей в цитометре регулируются давлением воздуха на жидкости в контейнерах (рис.3). Поэтому следует тщательно следить за герметичностью жидкостной системы цитометра.

Рис. 3. Принципиальная схема устройства жидкостной системы проточного цитометра.
1.2.2 Система возбуждения и регистрации сигнала

Поскольку клетки – мелкие объекты и способны нести небольшое количество флуорофора, освещение в зоне детекции должно быть достаточно интенсивным. Кроме того, для пространственного разделения клеток в потоке образца освещающее пятно должно быть достаточно маленьким. Поэтому в современных цитометрах для освещения образца используется лазерный луч. Интенсивность возбуждающего света должна быть по-возможности одинаковой по площади освещающего пятна (чтобы сигнал не зависел от траекторий отдельных частиц в потоке через зону детекции). А вдоль потока пятно луча должно быть узким (меньше диаметра анализируемых частиц), для лучщего пространственного разграничения частиц (рис.4). Поэтому идеальная форма пятна – плоская полоса, перпендикулярная оси потока образца и превышающая поток по ширине. Однако, достичь такой формы пятна трудно, и обычно пятно имеет форму вытянутого эллипса (рис.4, С). Такая форма пятна достигается при помощи пары скрещенных полуцилиндрических линз с большим фокусным расстоянием (рис.5).

Р
ис.4. Освещение потока образца лучами различной формы. Эллиптическое пятно (С) обеспечивает наиболее однородное освещение частицы (в зависимости от траектории) и оптическое разделение частиц в потоке.
Цитометр Cytomics FC 500 может измерять интенсивность рассеяния света под малыми углами и перпендикулярно оси возбуждающего луча, а также до 5 каналов флуоресценции одновременно (рис.7). Принципиальная схема оптической панели цитометра приведена на рис.6.

Р
ис.5. Схема формирования сечения возбуждающего луча в цитометре Cytomics FC 500. 1 – направление луча; 2, 3, 4 – форма пятна в процессе фокусирования; 5 – вертикальная полуцилиндричекая линза; 6 – горизонтальная полуцилиндричекая линза; 7 – проточная ячейка; 8 – выход из нее «в отходы».





Рис.6. Принципиальная схема оптической системы проточного цитометра с 3-мя каналами регистрации флуоресценции. Оптический путь света флуоресценции построен так, что сигнал, попадающий на каждый из детекторов проходит наименьшее число оптических фильтров. Из Givan, A. L. [2001] Flow Cytometry: First Principles, 2nd edition. Wiley-Liss, New York с изменениями.

Рассеяние света частицей под углом от 0,5^о до 19^о к оси возбуждающего луча называется малоугловым (forward scatter, FS). Интенсивность малоуглового рассеяния зависит от размеров (площади сечения) и коэффициента преломления частицы. При одинаковом коэффициенте преломления крупные частицы рассеивают больше света под малыми углами, чем мелкие. Таким образом, FS обычно используется для разделения клеток по размерам. Детектор FS стоит прямо по ходу возбуждающего луча после зоны детекции (рис.6). Перед ним установлена пластина (полевая заглушка), отсекающая непреломленный свет, прошедший через ячейку (рис.6 и 7, отметка 14 ).

Р
ис. 7. Устройство оптической панели цитометра Cytomics FC 500.

1 – дихроичный пороговый фильтр на 488нм (дихроичное зеркало, отражает длины волн до 488нм на детектор SS, пропускает >488нм на детекторы флуоресценции);

2 – пороговый фильтр на 500нм (отсекает остающийся рассеянный свет);

3 – дихроичный пороговый фильтр на 600нм (отражает длины волн до 600нм на «зеленые» детекторы FL1 и Fl2, пропускает свет >600нм на прочие детекторы флуоресценции);

4 – дихроичный пороговый фильтр на 615нм (пропускает длины волн до 615нм на «оранжевый» детектор FL3, отражает свет >615нм на «красные» детекторы FL4 и Fl5);

7 – дихроичный пороговый фильтр на 710нм (отражает длины волн до 710нм на Fl4, пропускает свет >710нм на Fl5 – т.е. разделение каналов FL4 и Fl5);

10 – дихроичный пороговый фильтр на 550нм (разделение каналов FL1 и Fl2)

Перед каждым детектором флуоресценции стоят дополнительные полосные фильтры (5 – 620 SP перед детектором FL3, 6 – 675 BP →FL4, 8 – 755 LP →FL5, 9 – 575 BP →FL2, 11 – 525 BP →FL1) для более надежного ограничения каналов.

12 – детектор FS; 13 – проточная ячейка; 14 – регуляторный рычажок полевой заглушки перед детектором FS; 15 – детектор SS;

16 – направление освещающего луча.

Она также позволяет изменять телесный угол, в котором детектируется FS (2 положения: 1-19^о или 1-8^о).

Боковым (side scatter, SS) называют рассеяние (фактически отражение) света под 90^о к оси возбуждающего луча. Отражение происходит от границ сред с различными коэффициентами преломления, поэтому интенсивность бокового рассеивания отражает гранулярность клетки. Интенсивность SS достаточно велика и заметно превышает интенсивность FS. SS собирается в том же направлении, что и флуоресценция, и отсекается от последней парой фильтров (рис.7, отметки 1 и 2).

После отсечения рассеянного света, оставшийся свет распределяется по 5 каналам флуоресценции (Fl от 1 до 5), которые центрированы примерно на 525 нм, 575 нм, 610 нм, 675 нм и 755 нм. Оптический путь света флуоресценции построен так, что сигнал, попадающий на каждый из детекторов проходит наименьшее число фильтров (подробно на рис.7).

Световой поток, попадающий на детектор, от клетки, которая проходит через зону детекции, преобразуется в импульс напряжения (рис.8, А) таким образом, что напряжение в каждый момент времени пропорционально интенсивности света. Форма первичного импульса напряжения отражает пространственное распределение сигнала по клетке (рис.8, Б). Для того, чтобы получить интенсивность флуоресценции суммарную от одной клетки (которая отражает, например, количество антигена), первичный импульс интегрируют (поскольку суммарная флуоресценция от клетки пропорциональна площади под первичным импульсом напряжения). Дальнейшее преобразование сигнала включает амплификацию (линейную или логарифмическую) и вычитание базовой линии.

Р
ис.8. А.Формирование сигнала детектором проточного цитометра при протекании частицы через зону детекции. Б. Зависимость формы первичного импульса (I) от распределения флуорофора по частице. Амплитуда интегрального сигнала (II) равна площади под первичным импульсом.

1.3 Блок питания

За передней панелью блока пинания находятся некоторые элементы флюидики прибора, состояние которых необходимо периодически проверять (минимум 2 раза за день – при вкючении и выключении), так как от их состояния зависит работоспособность прибора.

Рис. 9. Блок питания с открытой передней панелью.

1 – вакуумная ловушка

2 – водная ловушка

3 – вакуумный фильтр

4 – воздушный фильтр

5 – уровень вакуума

6 – давление в системе подачи жидкостей

7 – регулятор давления

Во избежание поломок, если водная или вакуумная ловушки заполнены жидкостью более, чем на 1/4, или в фильтры попало сколько-нибудь жидкости, прибор включать нельзя. Ловушки нужно вынуть и очистить согласно инструкции в Special Procedures. По поводу фильтров – связаться с А.В.Феофановым или Г.В.Шароновым.

При работе прибора показания манометра вакуума (SYS VAC, 5 на рис.9) должны быть  17 (дюймов Hg). Если давление выше нормы – необходимо прекратить работу и сообщить А.В.Феофанову или Г.В.Шаронову.

Нормальные показания манометра давления в системе подачи жидкостей (SYS PRESS, 6 на рис.9) – от 28 до 32 psi. Если давление не соответствует норме, нужно вытянуть на себя регулятор давления (PRESS ADJ, 7 на рис.9), затем поворачивать его до достижения 302 psi (по часовой стрелке – для увеличения, против – для уменьшения), после чего вдавить регулятор назад.
1.4 Программное обеспечение – CPX software

Проточный цитометр Cytomics FC 500 управляется только с компьютера программой CXP Cytometer. Программное обеспечение оперирует слудующими терминами:

Протокол –описывает 1 измерение (1 образец, 1 пробирку), содержит настройки прибора, измеряемые параметры, выведение результатов на дисплэй в виде гистограмм и прочих графиков, регионы и ограничения (gates) гистограмм, цветовые обозначения регионов и гейтов, статистики, а также файл, куда сохранять результаты измерения и что именно сохранять.

Панель – описывает работу с несколькими образцами последовательно. Содержит указания по использованию того/иного протокола для каждого конкретного образца. Кроме того, содержит указания какие настройки прибора использовать: текущие, из предыдущего эксперимента или из протокола.

Рабочий лист (Worklist) – это таблица, отображающая все загруженные (открытые) протоколы/панели (в которой они могут быть отредактированы), показывающая протекание процесса измерения.

Результаты измерения каждого образца сохраняются (в формате FCS) в отдельном listmode-файле (*.LMD) в папке LMD в директории пользователя. LMD-файл содержит список «№ частицы – значения измеренных параметров». Имя этого файла должно быть установлено ДО измерения.

Гистограммы/графики могут быть сохранены отдельно (в формате FCS, как и LMD-файлы). Результаты могут быть сохранены в виде PDF-файла (графики) или экспортированы в Excel (сырые данные типа таблиц LMD) или в файл *.TXT в формате ASCII.

Приложение CXP Analysis служит для работы с результатами измерений (анализа данных), причем не обращается к цитометру (т.е. доступно и работает при выключенном цитометре). Для использования в CXP Analysis служат протоколы из папки AnalysisProtocol в директории пользователя. такие протоколы могут работать с несколькими LMD-файлами одновременно.

2 Проведение измерений

Пожалуйста, читайте этот раздел сначала и без пропусков, поскольку некоторые важные для понимания (и правильной работы на приборе) вещи отмечены только в том пункте, где они появляются впервые, и далее на них внимание не задерживается.

2.1 Включение прибора, начало работы
Перед включением прибора необходимо проверить:

1. 
   Состояние фильтров и ловушек в блоке питания (см. пункт 1.3 «Блок питания»).
   
2. 
   Уровень жидкости в контейнерах обжимающей жидкости и промывочного раствора. Долить (до основания горлышка), если необходимо. Плотно закрыть контейнеры, поскольку они будут под давлением.
   
3. 
   Соединение шлангов (4 шт) и штекеров (2 шт) с этими контейнерами (рис.10).
   
4. 
   Вылить отходы из контейнера «Waste» и плотно прикрутить крышку с шлангами.
   

Рис. 10. Ящик с контейнерами обжимающей жидкости (3) и промывочного раствора (2). Шланги (1) и штекеры (на задней стенке ящика) должны быть подсоединены.
Включить переключатель питания ON/OFF на блоке питания цитометра.

Включить компьютер.

Из меню Пуск запустить модуль CXP Cytometer - это включение питания цитометра и запуск программного обеспечения. Необходимо, чтобы от этого момента до проверки стабильности сигнала прошло 40 мин – для выхода прибора на рабочий режим.

В течение этого времени можно зарегистрироваться под своим именем (User ID), провести промывку системы подачи образца и вакуумных линий.

В процессе регистрации появляется возможность загрузки протокола.
После регистрации возникают окна: основное окно (с гистограммами, кнопками управления цитометром, настойки парамеров измерения и анализа данных), Report Generator. Окна Acquisition Manager и Resourse Explorer становятся активируемыми.

2.2 Промывка трубок подачи жидкостей

Очистка системы подачи образца и вакуумных линий производится для того, чтобы удалить остатки проб из системы подачи образца, чтобы смыть сорбировавшиеся красители и белки со стенок системы (в целях предотвращения закупорки трубок и кросс-контаминации проб).

Эта процедура проводится

-- после включения прибора перед калибровкой (особенно если эксперименты проводятся редко);

-- между принципиально разными экспериментами (особенно, если используются витальные красители, такие как йодистый пропидий, бромистый этидий, акридиновый оранжевый, диацетат флуоресцеина).

-- обязательно перед выключением прибора.

1. 
   Запустить цикл промывки промывочным раствором (Clenz) - Cleanse (нажать на линейке инструментов цитометра).
   
2. 
   Завершение цикла Cleanse переводит прибор в режим Idle Mode (нажато на линейке инструментов цитометра). В этом режиме происходит сброс давления в жидкостной системе. В режиме Idle Mode невозможны измерения, но только в нем можно провести промывку вакуумных линий прибора (AutoCleanse – см. далее) и долить жидкости в контейнеры (ели появились соответствующие сообщения в строке Error Log). Так что нужно следить за состоянием прибора и, когда нужно, отжимать кнопку Idle Mode.
   
3. 
   Пробирку с 1,5-4 мл раствора гипохлорита Na (0,5-0,6%) в dH₂O установить в 1 положение карусели. (Приготовленный раствор должен употребляться в течение дня. Вместо раствора гипохлорита Na можно использовать смесь Clenz:dH₂O = 1:1.)
   
4. 
   Пробирки с таким же количеством dH₂O – в положения 2,3 и 4.
   
5. 
   Если Вы хотите работать с открытой крышкой карусельной приставки, то нужно перевести рычажок блокировки карусельного механизма в верхнее положение.
   
6. 
   Проверить, что worklist в окне Acquisition Manager пуст (иначе открываемая панель добавится в конец рабочего листа – это правило работает всегда).
   
7. 
   При помощи Resourse Explorer (проще всего) из директории Common открыть панель Cleanse.PNL
   
8. 
   В рабочем листе ввести номер карусели. Номера пробирок появятся автоматически.
   
9. 
   На линейке инструментов цитометра нажать (старт считывания данных, F9). Протекание процедуры отображается стрелками напротив срок пробирок в рабочем листе и в стоке состояния цитометра в основном окне.
   
10. 
    Процедура закончена, как только появилась надпись Ready.
    
11. 
    Перевести цитометр в
    
12. 
    Боковую емкость одного адаптора заполнить Clenz, установить его в положение 1 (боковой емкостью к центру карусели).
    
13. 
    Боковую емкость второго адаптора заполнить dH₂O, установить его таким же образом в положение 2.
    
14. 
    Нажать AutoCleanse на панели управления цитометром.
    
15. 
    Надпись Cleanse cycle in progress в строке состояния показывает протекание цикла очистки.
    
16. 
    Как только появилась надпись Press IdleMode button to Initialize, процесс завершен. Можно выключать прибор или проводить калибровку и работать далее.
    

2.3 Проверка стабильности сигнала

Проверка стабильности оптики и флюидики проводится раз в день или перед каждым сеансом работы (если измерения проводятся не каждый день). Для этого используются специальные суспензии микросфер (известного диаметра, окрашенных известными красителями) - Flow-Check.

При инсталляции прибора созданы протоколы для калибровки (у них префикс QC). Использование этих протоколов загружает одни и те же настройки прибора, что позволяет сравнивать значения средних положений пиков (Mean) и коэффициенты вариации пиков на половине высоты (HPCV). Это 2 характеристических параметра, изменение которых со временем отражает неизбежные изменения параметров освещения образца, регистрации сигнала, скоростей потоков жидкостей, которые влияют на возможность сравнения между собой результатов, полученных в разное время.

1. 
   Запустить цикл промывки флюидики обжимающей жидкостью (режим Prime ). Эта стадия нужна перед каждым циклом измерений (в том числе после первоначальной промывки прибора, и перед калибровкой) для удаления остатков Clenz из трубок и для удаления оставшегося невымытым сора. Рекомендуется проводить цикл Prime также в процессе измерений, если появляется много нефлуоресцирующего дебриса.
   
2. 
   Приготовить образец для калибровки: к 1,0 мл dH₂O добавить 5-6 капель Flow-Check.
   
3. 
   Загрузить в пустой рабочий лист из директории Common (Acquisition) протокол QC 1L Flow-Check.PRO.
   
4. 
   Отметить в рабочем листе номер карусели и положение в ней пробирки с калибровочным образцом.
   
5. 
   Запустить измерение. Откроются окна гистограмм с отображенными на них целевыми регионами (gates).
   
6. 
   Проверить результат калибровки (попадает ли он в установленные рамки), для этого:
   
7. 
   В окне Report Generator открыть Quality Control Report .
   
8. 
   Появится окно QC Levey Jennings c графиками, отражающими зависимость HPCV или Mean от даты проведения теста.
   
9. 
   Если графиков в окне нет, нужно создать новый график, кликнуть левой кнопкой мыши на заголовок ( 1: - ) и отметить использованные в эксперименте протокол, вид микросфер, лот, целевой регион (gate) и требуемую статистику.
   
10. 
    Если график пустой (не содержит точек), то нужно в основном окне кликнуть правой кнопкой мыши на целевой регион (например, регион FC@2.0) и проверить, чтобы в окне Region Properties был указан вид микросфер и поставлена галка напротив строки Region statistics exported for Quality Control. Таким же образом проверить свойства всех регионов в протоколе, после чего повторить пункты 9 и 10.
    
11. 
    Тест считается успешно пройденным (т.е. отклонение параметров оптики и флюидики в пределах нормы), если полученные значения Mean и HPCV каждого (из измеренных) параметра попадают в область среднего ± 2 стандартных отклонения (как отображается на графиках Леви-Дженнингса). Иначе следует повторить калибровку, предварительно проведя цикл промывки флюидики (параграф 3.2).
    
12. 
    Выполнить цикл Prime.
    

2.4 Приготовление образцов

Цитометр Cytomics FC 500 позволяет анализировать как фиксированные, так и живые клетки. В этом пункте приведены основные правила, которых следует придерживаться при приготовлении образцов.

Минимальный объем образца – 0,5 мл. При этом 0,4 мл – мертвый объем (не используется для измерений). Необходимо следить за объемом образца, поскольку попадание пузырьков воздуха в проточную ячейку приведет к искажению потоков жидкостей, закупорке ее, и в итоге к искажению результатов. Пузырьки воздуха нужно будет удалить при помощи цикла Prime.

Образец должен представлять собой суспензию единичных частиц (клеток) без агрегатов (во избежание получения неверных результатов или закупорки проточной ячейки). Цитометр Cytomics FC 500 регистрирует частицы диаметром от 0,5 мкм до 40 мкм.

Оптимальная плотность суспензии – 10⁶ в 1 мл. Меньшая плотность (от 10⁵ кл/мл) позволяет улучшить разрешение, однако повышает время накопления требуемого для статистики числа событий. Большая плотность (до 4*10⁶ кл/мл) может привести к тому, что частицы будут проходить через область освещения/детекции не по одной, следовательно, Вы получите неверный результат.
2.5 Создание протокола и панели эксперимента

1. 
   Prime
   
2. 
   Очистить рабочий лист в окне Acquisition Manager.
   
3. 
   В меню основного окна выбрать File->New->New Protocol.
   
4. 
   Открыть окно Cytometer control . В нем на закладке Acq.Setup нажать на кнопку Parameters (и выбрать параметры/величины, которые Вы хотите регистрировать). Не закрывайте окно Cytometer control – оно понадобится для подбора напряжения на детекторах.
   
5. 
   Создать необходимые диаграммы.
   
6. 
   Создать регионы и логические ограничения (gating). Выбрать статистические параметры для анализа в процессе измерения.
   
7. 
   В окне Acquisition Manager найти кнопку и открыть меню Workspace Preferences. Это меню содержит многие важные опции: имя LMD-файла результатов, опции считывания/сохранения/представления на дисплее данных,
   
8. 
   File->Save Protocol As
   
9. 
   В окне Cytometer control на закладке Acq.Setup отметить галкой QuickSET (в этом режиме напротив осей диаграмм появляются интерактивные ползунки, позволяющие изменять напряжения на соответствующих детекторах, а результаты измерения сбрасываются после каждого изменения напряжения). Можно делать по-другому: отметить галкой SETUP mode, тогда на закладке Detectors в окне Cytometer control появляется возможность изменения напряжений на детекторах.
   
10. 
    Провести измерения пробного (полностью окрашенного образца). Подобрать напряжения на детекторах.
    
11. 
    Првести измерение контрольного образца – неокрашенного (для проверки правильности настроек детекции).
    
12. 
    Сохранить протокол (для переноса в него текущих – т.е. подобранных – настроек детекции.
    
13. 
    Остановить считывание. Отжать SETUP mode и QuickSET. Очистить рабочий лист.
    
14. 
    Создать новую панель для измерения ВСЕХ образцов, с использованием настроек созданного протокола.
    
15. 
    Можно сохранить и панель и рабочий список – для повторения эксперимента и во избежание потери настроек.
    

2.5.1 Пробные измерения

Пробные измерения нужны для настройки параметров детекции (напряжения и коэффициенты усиления (gain) детекторов) и для настройки компенсации.

Поэтому, если планируется многопараметрическое измерение, готовится ряд образцов, идентичных целевому по всем параметрам, кроме окраски: каждый должен быть окрашен одной краской из используемых в целевом образце и один образец должен быть не окрашен ничем.

На неокрашенном образце оптимизируются напряжения и gain детекторов FS и SS, чтобы отделить частицы от дебриса, разделить субпопуляции частиц по размерам.

Затем последовательно (от зеленой краски к красной) промериваются прочие пробные образцы. Для каждого образца последовательно (от зеленого к красному) устанавливаются напряжения и коэффициент усиления (gain) детекторов флуоресцентных каналов. Задачи оптимизации детекции:

- установить достаточный уровень сигнала от окрашенных каждой краской частиц;

- разделить субпопуляции окрашенных и неокрашенных каждой краской частиц;

- выяснить, насколько флуоресценция каждой краски «загрязняет» другие каналы (кроме своего); требуется ли компенсация; вычислить фактор (множитель) компенсации.

2.6 Выключение прибора

После промывки трубок подачи образца и вакуумных линий (параграф 2.2 «Промывка трубок подачи жидкостей») закрыть все окна, нажать на FC OFF в меню Пуск. Отключить цитометр от сети выключателем ON/OFF на блоке питания.

Включить прибор снова можно не менее, чем через 30 мин после выключения.


3 Список литературы

1. 
   Полетаев А. И., Основы цитометрии и сортировки в потоке. Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, 2001.
   
2. 
   Ormerod MG (ed). (2000) Flow Cytometry, 3rd edition. Oxford University Press, Oxford, UK.
   
3. 
   Givan AL. (2001) Flow Cytometry: First Principles, 2nd edition. Wiley-Liss, New York, USA.
   

I. Практическая часть
Сокращения: AnV – аннексин V, FITC – изотиацианат флуоресцеина, PI – йодистый пропидий.

Оценка цитотоксичности мелиттина для клеток HL-60
Цели и задачи: создание протокола измерения (подбор параметров) и панели измерения, оценка цитотоксичноcти мелиттина из яда пчелы (Apis mellifera) для клеток HL-60 при помощи окрашивания йодистым пропидием.

1. 
   Подготовка образцов.
   

Клетки HL-60 (1мл с плотностью 1 млн кл/мл) проинкубировать с мелиттином (по 1 пробирке с 0,5; 1 или 2 мкМ) в полной ростовой среде (RPMI-1640 с 10% телячьей фетальной сыворотки, 2мМ L-глутамина, 10мМ HEPES и 1мМ пирувата) в течение 1 часа при 37^оС. Контрольные клетки (2 пробирки!) инкубировать в тех же условиях без пептида.

2. 
   Создать протокол измерения.
   

Регистрируем параметры: SS, FS, log Fl3 (центр на 610 нм, флуоресценция йодистого пропидия), log Fl4 (центр на 675 нм). Создать графики: 2 гистограммы распределения log Fl3, 1 - для log Fl4, двухпараметрические SS/FS и log Fl3/log Fl4. Установить на графике SS/FS эллиптический gateA, которым ограничить одну из гистограмм log Fl3 (вторая – неограничена). На второй гистограмме log Fl3 выбрать линейный gateВ, который отобразить зеленым на графике SS/FS (не попадающие в gateВ события отобразить серым).

3. 
   Окрасить клетки при помощи 10 мкМ PI в течение 15 мин при 37^оС. Одну из контрольных пробирок проинкубировать без красителя.
   
4. 
   На образце с 1 мкМ пептида в режиме Quick Set отрегулировать напряжения на детекторах так, чтобы оптимально разделять клетки по размеру и гранулярности, и чтобы различать популяции мертвых и живых клеток.
   
5. 
   Сохранить протокол с подобранными параметрами.
   
6. 
   Проверить эти параметры на 2-х контрольных образцах (окрашеннном и неокрашенном) в режиме Quick Set. Если нужно, отрегулировать заново и пересохранить протокол.
   
7. 
   Создать панель измерения по данному протоколу для всех образцов.
   
8. 
   Провести измерения всех образцов. Оценить долю погибших клеток для каждой из концентраций мелиттина. В программе MS Excel или Origin Pro 7.0 построить график зависимости гибели клеток от концентрации пептида.
   

Изучение апоптоза клеток HL-60, индуцированного доксорубицином
Цели и задачи: - создание протокола измерения и панели для измерения в нескольких каналах флуоресценции одновременно;

- оценка относительных количеств клеток культуры HL-60, находящихся на ранних и поздних стадиях апоптоза, вызванного доксорубицином (при помощи окрашивания йодистым пропидием и FITC-AnV.

День 1. Стерильно развести клетки в 2 раза стерильной полной средой. Разлить поровну в 2 флакона (один – для контроля и 1 для индукции апоптоза). Индуцировать апоптоз добавлением доксорубицина до конечной концентрации 0,1 мкг/мл на 20 ч (стерильно закрыть флакон и инкубировать в СО₂-инкубаторе).
День 2.

1. 
   Включение прибора. Промывка флюидики и вакуумных линий. Калибровка.
   
2. 
   Создание протокола измерения.
   

Регистрируем параметры: SS, FS, log Fl1 (центр на 520 нм, флуоресценция FITC), log Fl3 (центр на 610 нм, флуоресценция PI). Создать графики: гистограммы распределения для log Fl1 и log Fl3, двухпараметрические SS/FS и log Fl1/log Fl3. Отметить галкой «save Histogram data in FCS format» для сохраниения гистограмм отдельно (и облегчения их вставки в отчет). Установить на графике log Fl1/log Fl3 разбиение на квадрадранты.

PI-/AnV- левый нижний квадрант (субпопуляция живых клеток, которые не связывают ни один из красителей),

PI-/AnV+ левый верхний квадрант (клетки на ранних стадиях апоптоза, наблюдается инверсия фосфатидилсерина во внешний листок плазматической мембраны, но клетки еще не проницаемы для PI),

PI+/AnV- правый нижний квадрант (некротические клетки и клетки на поздних стадиях апоптоза – PI проникает),

PI+/AnV+ правый верхний квадрант (основной массив некротических клеток и клеток на поздних стадиях апоптоза).

Настроить отображение событий из разных квадрантов разными цветами на диаграмме SS/FS.

Сохранить протокол.

3. 
   Подготовка пробных образцов.
   
   • 
     0,6мл индуцированной культуры + 2,5мМ CaCl₂, 10мкМ PI, 10мкл FITC-AnV – это полностью окрашенный образец;
     
   • 
     0,6мл индуцированной культуры + 2,5мМ CaCl₂, 10мкл FITC-AnV – «только FL1» образец;
     
   • 
     0,6мл индуцированной культуры + 2,5мМ CaCl₂, 10мкМ PI – «только FL3» образец;
     
   • 
     0,6мл индуцированной культуры + 2,5мМ CaCl₂ - неокрашенный образец;
     

Проинкубировать 15 мин при комнатной температуре (в темноте!).

4. 
   Создать панель измерения на 1 пробирку.
   
5. 
   На полностью окрашенном образце в режиме Quick Set отрегулировать напряжения на детекторах так, чтобы события распределялисть по всему полю диаграмм SS/FS и log Fl1/log Fl3 (не были скучены у нуля, но и не зашкаливали за пределы диапазона детекции).
   
6. 
   Пересохранить протокол с подобранными условиями.
   
7. 
   Добавить в рабочий список еще одну пробирку и измерить с пересохраненным протоколом «только FL1» образец. Обратить внимание на распределение по FL3.
   
8. 
   Так же измерить «только FL3» (обратить внимание на распределение по FL1) и неокрашенный образцы. Если нужно, изменять настройки и пересохранять протокол.
   
9. 
   Приготовить целевые образцы
   
   • 
     0,6мл индуцированной культуры + 2,5мМ CaCl₂, 10мкМ PI, 10мкл FITC AnV;
     
   • 
     0,6мл контрольной культуры + 2,5мМ CaCl₂, 10мкМ PI, 10мкл FITC-AnV –для контроля спонтанного апоптоза и некроза.
     

Проинкубировать 15 мин при комнатной температуре (в темноте!).

10. 
    Создать панель для всех образцов и измерить их.
    
11. 
    По полученным долям событий в квадрантах оценить относительные количества клеток, находящихся на ранних и поздних стадиях апоптоза. Сделать поправку на частоту спонтанного апоптоза и некроза.