МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА БИОИНЖЕНЕРИИ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Методическая разработка

Москва 2007.

Аннотация

Задачи спецпрактикума включают в себя изучение теоретических основ электрофореза (по теоретической части практикума сдается коллоквиум), а также практические методики использования электрофореза в полиакриламидном геле для анализа различных белков и пептидов (по практической части практикума сдается зачет).

Спецкурс рассчитан на студентов 4-го курса, уже изучивших основы биохимии. Необходимое время для проведения практикума – 12 академических часов. Для проведения практикума необходима лаборатория, оснащенная электрофоретическим оборудованием и системой гель-документирования, а также персональными компьютерами с соответствующим программным обеспечением для обработки и анализа полученных результатов.

Программа практикума

1. 
   Теоретические основы электрофореза. Обзор различных видов электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле для разделения белков и пептидов. Коллоквиум по теоретической части.
   
2. 
   Приготовление необходимых растворов и полимеризация полиакриламидных гелей.
   
3. 
   Сборка аппарата для проведения электрофореза белков в ПААГ. Подготовка и нанесение образцов. Проведение электрофореза. Фиксация и окраска геля.
   
4. 
   Документирование геля и анализ результатов.
   

Задачи практикума
Теоретическая часть

1. 
   Основы электрофореза
   

Электрофорез – это перемещение заряженных частиц в растворе (в зависимости от знака их суммарного электрического заряда) к аноду или катоду под действием электрического поля. Поскольку скорость движения молекул в электрическом поле зависит от их заряда, формы и размера, то электрофорез может быть использован для их разделения.

Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят в основном от рН среды. Если через этот раствор начать пропускать электрический ток, то под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров макромолекулы приобретают разные скорости, и в этом – сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул мигрирующих с одной и той же скоростью. Однако в жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны, поэтому обычно электрофорез проводят в гелеобразной среде. Наличие сетки геля приводит к тому, что теперь фракционируемые макромолекулы сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных молекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров.

Электрофорез позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Биологические макромолекулы – белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и др. – находятся в водном растворе в виде частиц, несущих определённый электрический заряд. Заряд макромолекулы определяется входящими в ее состав группами, способными к электролитической диссоциации. Степень диссоциации групп зависит от многих факторов, в частности, от рН среды. Общий заряд биологической макромолекулы также может изменяться при её взаимодействии с ионами или другими молекулами.

Наиболее широкое применение электрофорез получил для анализа и очистки белков и нуклеиновых кислот, хотя этот метод может быть использован и для других заряженных биологических молекул, таких как сахара, аминокислоты, пептиды, нуклеотиды и др. Для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез. Наиболее широко используются полиакриламидные (ПААГ) гели и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. В качестве других «носителей» жидкой фазы широко используют пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества.

2. 
   Виды электрофореза
   

Ниже приведены различные виды электрофореза с их кратким описанием.

Электрофорез с подвижной границей проводится в U-образной кювете с прямоугольным поперечным сечением. Метод разработан для разделения белков в буфере. Основной недостаток метода – наличие конвекционных потоков жидкости во время проведения электрофореза.

Зональный электрофорез в свободной среде исключает конвекционные потоки за счет вращения электрофоретической трубки или за счёт проведения электрофореза в тонком слое жидкости.

Зональный электрофорез в градиенте плотности разработан для стабилизации белковых зон за счет проведения электрофореза в градиенте плотности сахарозы, глицерина, этиленгликоля, тяжёлой воды и др.

Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой заключается в том, что для стабилизации белковых зон в среду, где проводится разделение, вносятся вещества, образующие капиллярную структуру (фильтровальная бумага, плёнки из ацетата целлюлозы, колонки или блоки целлюлозного порошка, гранулированный крахмал, агаровые, агарозные, крахмальные или полиакриламидные гели).

Электрофорез на фильтровальной бумаге проводится в поддерживающей среде, в качестве которой служат полоски фильтровальной бумаги.

Электрофорез на ацетате целлюлозы использует в качестве поддерживающей среды полоски ацетата целлюлозы.

Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды применяется в основном для препаративного разделения белковых смесей. В качестве поддерживающей среды используются порошки из стекла или пластмассы (поливинилхлорида), гранулированный крахмал, целлюлозный порошок, а также сефадекс или агароза, приготовленные в виде колонок или блоков.

Электрофорез в агаровом и агарозном гелях использует в качестве поддерживающей среды названные выше пористые гели.

Электрофорез в крахмальных гелях использует в качестве поддерживающей среды картофельный и рисовый крахмал.

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) – наиболее используемый в настоящее время вид аналитического и препаративного электрофореза. Этот метод использует в качестве поддерживающей среды сополимер акриламида и бисакриламида.

Изоэлектрическое фокусирование – один из новейших методов разделения макромолекул. Во время изоэлектрического фокусирования между анодом и катодом создается градиент рН. Заряженные молекулы, которые вначале равномерно распределены в среде или внесены в эту среду в виде одной полосы, движутся в соответствии с их фактическим зарядом в направлении противоположно заряженного электрода. Если эти молекулы амфотерны, т.е. содержат группы, способные нести различный электрический заряд, в зависимости от окружающего рН, то при перемещении в градиенте искусственно сформированного рН их суммарный заряд будет непрерывно меняться до тех пор, пока они не достигнут положения, где он станет равным нулю. Это происходит в том месте градиента рН, где значение рН будет равным изоэлектрической точке молекулы. Таким образом, молекулы, имеющие одинаковую изоэлектрическую точку, сконцентрируются в узкой зоне. Если искусственно сформированный градиент рН стабилен, то дальнейших изменений происходить не будет и молекулы останутся сконцентрированными, поскольку их диффузии препятствует электрическое поле.

Изотахофорез – тип электрофореза, при котором все заряженные макромолекулы движутся в электрическом поле с одинаковыми (изо) скоростями (тахо).

3. 
   Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)
   

Полиакриламидный гель в виде поддерживающей среды при проведении электрофореза использовал Раймонд и Вейнтрауб (S. Raymond and L. Weintraub) в 1959 году. Теорию метода разработали Орнштейн (Ornstein L., 1964) и Дэвис (Davis B., 1964).

Полимеризация полиакриламидного геля

Для получения полиакриламидного геля используют акриламид и какой-либо агент, образующий поперечные сшивки – обычно N,N'- метиленбисакриламид (сокращенно – бисакриламид).

CH₂ = CH CH₂ = CH

 

C=O C = O

 

NH₂ NH



Акриламид CH₂



NH



C = O



CH₂ = CH

Бисакриламид
Реакция полимеризации протекает по свободнорадикальному механизму и требует наличия свободных радикалов акриламида. В качестве инициаторов реакции полимеризации используют вещества, разрушающиеся с образованием свободных радикалов, которые затем взаимодействуют с молекулами акриламида и запускают (инициируют) полимеризацию. Наиболее широко в качестве инициатора процесса полимеризации используют персульфат аммония (NH₄-SO₄-SO₄-NH₄) или калия, образующий в водном растворе за счет гомолитического разрыва связи радикалы (NH₄-SO₄^). Рибофлавин также может служить инициатором полимеризации: при освещении его водного раствора видимым светом (445 нм) он присоединяет водород и восстанавливается до лейкорибофлавина, который легко окисляется растворенным в воде кислородом, образуя перекись водорода. За счет разложения перекиси продуцируются гидроксильные радикалы (НО^), инициирующие цепную реакцию полимеризации акриламида. Поскольку реакция полимеризации акриламида – медленный процесс, то для ускорения процесса полимеризации в качестве катализатора обычно используют N,N,N',N' – тетраметилэтилендиамин (СH₃)₂  N  CH₂ CH₂ N (CH₃)₂ (ТЕМЭД).

CH₂ = CH CH₂ = CH  СH₂  CH  CH₂  CH  CH₂  CH 

    

C=O + C = O  C = O C = O C = O

    

NH₂ NH NH₂ NH₂ NH

 

Акриламид CH₂ CH₂

 

NH NH₂ NH₂ NH

   

C = O C = O C = O C = O

   

CH₂ = CH  СH₂  CH  CH₂  CH  CH₂  CH 

Бисакриламид Полиакриламид

Возможно использование следующих пар катализаторов и инициаторов:

1. 
   Персульфат аммония + TEMЭД
   
2. 
   Персульфат аммония + ДМАПН (3-диметиламинопропионнитрил)
   
3. 
   Рибофлавин + TEMЭД (фотополимеризация)
   
4. 
   Перекись водорода + сульфат железа + аскорбиновая кислота
   

Поскольку персульфат аммония нестоек в водном растворе, его часто заменяют персульфатом калия.

Плотность геля (размер пор)

Для характеристики полиакриламидного геля необходимо указывать процентное содержание мономеров. Стандартно используют следующие обозначения:

Т – процентное отношение суммарной массы обоих мономеров к объему раствора,

С – процентное отношение массы бисакриламида к общей массе обоих мономеров. (Т = акриламид + мономер, образующий сшивки) и количество сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров (С):

Т = (a + b)/m x 100 %

C = b/(a + b) x 100 %

a – количество акриламида;

b – количество мономера, образующего сшивки (бисакриламида);

m – объем буфера, мл.

Т обычно варьируется в пределах 3-30%, а С 1-5%. Выбор значений С и Т определяется диапазоном фракционирования белков и ограничивается механическими и адсорбционными свойствами геля. Для крупнопористых гелей необходимо увеличивать степень сшивки (повышать С до 3-5%), для мелкопористых гелей величина С не должна превышать 1-2%.

На первый взгляд чем больше Т, тем мельче поры, но это не всегда так, поскольку ПААГ не является регулярной пространственной решеткой с жесткими ячейками определенного среднего размера. При малых значениях С он представляет собой скорее длинные нити, заполняющие весь объем и лишь в отдельных точках случайно сшитые между собой. Такая система не может быть внутренне жесткой. Поэтому мигрирующие в геле макромолекулы, по-видимому, могут раздвигать гибкие длинные участки линейных полимеров акриламида, при этом миграция молекул замедляется и происходит своеобразное трение их о гель. Однако жестких ограничений на размер мигрирующих молекул такая система не накладывает, и это очень существенно.

Чем выше концентрация заполимеризованного акриламида, тем меньше размер пор в геле: p = 1,5 d /  c

где р – размер пор в ангстремах

c – объемная концентрация акриламида

d – диаметр молекулы акриламида

Чем больше содержание акриламида (а величина Т, в основном, определяется им), тем гуще нити полимера, меньше промежутки между ними и сильнее трение. Увеличение содержания «сшивки» (С) сначала повышает жесткость геля, т.к. средняя длина свободных участков нитей уменьшается. Трение при этом увеличивается, а миграция биополимеров в геле замедляется. Однако далее картина меняется, экспериментально показано, что с увеличением С выше 10% тормозящий эффект геля (при одних и тех же значениях Т) ослабляется. При С>15% гель ведет себя как крупнопористый даже при высоких значениях Т. Внутренняя структура геля в этом случае приобретает, по-видимому, совсем иной характер. Благодаря частым сшивкам оказывается энергетически выгодным и вероятным многократное связывание нескольких параллельно идущих нитей в своего рода пучки, которые также образуют хаотически сшитую пространственную сетку. Эта сетка оказывается действительно жесткой – нити в пучках раздвинуть невозможно. Зато между пучками полимерных нитей образуются достаточно большие пустоты, заполненные жидкой фазой геля, по которым могут свободно мигрировать молекулы биополимеров. Поэтому содержание сшивки С в геле должно быть в пределе 2-5%.

Соотношение между акриламидом и сшивающим агентом определяют механические и физические свойства геля. Для гелей с концентрацией Т 5 – 15 % С рекомендуется выбирать в пределах 2-4 %. Для выбора С была предложена следующая эмпирическая формулы:

С (%) = 6,5 – 0,3 Т (%)

Бисакриламид, мг = 1300 / акриламид, г

Концентрация полиакриламидных гелей, используемых для разделения макромолекул с различными молекулярными массами

Кoнцентрация геля Т, %	Концентрация бисакриламида С, %	Пределы разделения, дальтоны
15-20 10-15 5-10 5 2-5	0,2 0,3 2 – 3 5 6	1 х 104 - 4 х 104 4 х 104 - 1 х 105 1 х 105 - 3 х 105 3 х 105 - 5 х 105 выше 5 х 105

Связь между подвижностью белков и концентрацией геля

Электрофоретическая подвижность – это скорость движения частицы (обычно выражаемая в см/c) при напряженности электрического поля в 1 В/см. Эта величина имеет размерность см²  с^-1 В^-1, а её знак совпадает со знаком суммарного заряда макромолекулы.

Рассмотрим изолированную частицу, взвешенную в идеальном диэлектрике. Если приложить равномерное электрическое поле, то на частицу будет действовать сила, равная произведению общего заряда частицы на напряженность этого поля. При наложении электрического поля скорость движения частицы (биологической макромолекулы) довольно быстро увеличивается до тех пор, пока электрическую силу, действующую на частицу со стороны электрического поля, не уравновесит сила трения. После этого частица будет двигаться с постоянной скоростью.

В случае реального электрофореза макромолекул, процесс происходит не в диэлектрике, а в растворе электролита. При этом вокруг заряженной частицы будет существовать ионная атмосфера. Частица при этом будет окружена диффузным облаком ионов, заряд которых противоположен заряду частицы. На значительных расстояниях от частицы суммарный заряд в любом элементе объема, достаточно большом по сравнению с атомными размерами частицы, равен нулю. Присутствие же ионной атмосферы вокруг частицы приводит к тому, что её электрофоретическая подвижность оказывается меньше, чем это предсказывается уравнением. Это обуславливается тремя причинами. Во-первых, потенциал на поверхности частицы снижается из-за снижения её эффективного электростатического заряда. Во-вторых, электрическое поле действует также и на ионы, окружающие макромолекулярную частицу. Поскольку знак заряда ионного облака противоположен знаку заряда частицы, облако будет смещаться в направлении, противоположном движению частицы, замедляя тем самым её миграцию (эффект электрофоретического трения). В-третьих, имеет место замедляющий эффект другого рода, связанный с тем, что в электрическом поле одни ионы при перемещении приближаются к частице, а другие удаляются от неё. Вследствие этого в ионной атмосфере происходит непрерывное замещение ионов, что вызывает нарушение её сферически симметричной формы, так как для вновь входящих ионов требуется определённое время, чтобы найти своё место в поле макромолекулы и прийти в равновесие с её окружением. В результате двойной электрический слой позади частицы растягивается. Действие тормозящей силы такого типа носит название релаксационного эффекта.
Подвижность макромолекул в полиакриламидном геле обратно пропорциональна среднему размеру пор (формула Фергюсона):
Lg U = lg U₀ – K_r Т
K_r – коэффициент задержки;

U – подвижность макромолекул в геле;

U₀ – подвижность макромолекул в свободном растворе;

Т – плотность геля (концентрация мономеров)

Электрофорез в ПААГ с использованием додецилсульфата натрия

Электрофоретическая подвижность каждого белка зависит одновременно и от его суммарного заряда, и от молекулярной массы, и от конфигурации и от жесткости упаковки полипептидной цепи. Вклад каждого из этих факторов неизвестен и может существенно меняться в зависимости от условий фореза. Для установления строгой количественной корреляции между каким-либо одним из перечисленных параметров и электрофоретической подвижностью белков надо исключить влияние всех остальных.

Одним из наиболее популярных методов является электрофорез в ПААГ с использованием додецилсульфата натрия (ДСН), который позволяет фракционировать белки в зависимости от значения только одного параметра – их молекулярной массы. Основной принцип метода – снижение влияния заряда макромолекулы на ее электрофоретическую подвижность. В этом случае должна наблюдаться пропорциональность между молекулярной массой макромолекулы и ее сопротивлением трения (коэффициентом задержки). Для этого белки обрабатывают избытком ДСН, который примерно одинаково связывается с подавляющим большинством белков в соотношении 1,4 мг ДСН с 1 мг белка. Избыток остатков сульфокислоты делает несущественным собственный заряд белка, а постоянство соотношения детергент/белок делает практически одинаковым отношение отрицательного заряда к массе для любого белка. Кроме того, при обработке белка ДСН полипептидная цепочка распрямляется и приобретает форму жесткого эллипсоида вращения, размер большой оси вращения которого линейно связан с числом аминокислотных остатков, а следовательно, с молекулярной массой белка.

Электрофоретическая подвижность (u') жесткого комплекса белок-ДСН оказывается связанной с молекулярной массой белка (Mr) простым соотношением: u' = A-BlgMr, где А и В – коэффициенты, зависящие от пористости геля, температуры и других условий эксперимента. Величину u' удобнее представлять в относительных единицах, выражающих отношение путей миграции белка и лидирующего красителя за время электрофореза, т.е. в значениях введенной ранее величины Rf. Для определения коэффициентов А и В одновременно с фракционированием исследуемой смеси необходимо провести электрофорез набора белков-«маркеров», молекулярные массы которых точно известны. По окончании фореза, измерив пути миграции лидирующего красителя (бромфенолового синего) и каждого из маркеров, можно рассчитать значения Rf и, зная молекулярные массы маркеров, построить экспериментальную зависимость lgMr от Rf. Если пористость геля выбрана удачно, то такая зависимость будет линейной. Определив теперь Rf для интересующего нас белка, из графика можно найти для него величину lgMr и рассчитать Mr.

При данной пористости (концентрации) геля описанная выше линейная зависимость имеет место только для белков, молекулярные массы которых лежат в определенном интервале. Для ориентировки можно назвать примерное значение концентрации акриламида в зависимости от молекулярной массы белков:
Т, % 5 10 15

Mr, кДа 18-330 10-100 10-60

Наиболее широко используемым вариантом электрофореза с добавлением ДСН является диск-электрофорез по Лэммли [3]. Этот метод позволяет значительно улучшить разделение фракционируемых белков за счет введения дополнительного так называемого «формирующего» крупнопористого геля, в котором белки не фракционируются, а только концентрируются в виде очень узких полос перед переходом в разделяющий гель. Система Лэммли позволяет хорошо разделять белки с Mr = 15-200 кДа. Для анализа низкомолекулярных белков и пептидов наиболее широко используется система предложенная Шаггером [4].
Практическая часть
Цель работы: Проведение анализа различных искусственно приготовленных смесей белков и интегральных микробиологических объектов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
Задачи практической части:

1. 
   Приготовление необходимых растворов и буферов (согласно протоколу метода):
   
   1. 
      Приготовление раствора для заливки концентрирующего геля
      
   2. 
      Приготовление раствора для заливки разделяющего геля
      
   3. 
      Приготовление раствора персульфата аммония
      
   4. 
      Дегазация растворов для заливки концентрирующего и разделяющего геля
      
2. 
   Полимеризация полиакриламидных гелей:
   
   1. 
      Собрать систему для заливки гелей, отметить маркером границы заливки разделяющего геля
      
   2. 
      Добавить персульфат в раствор и залить разделяющий гель
      
   3. 
      Осторожно наслоить примерно 100 мкл воды на гель для устранения пузырей
      
   4. 
      Дождаться пока гель застынет и появится четкая граница между водой и гелем - удалить наслоенную ранее воду
      
   5. 
      В раствор для концентрирующего геля добавляем персульфат
      
   6. 
      Вставляем гребенку и заливаем концентрирующий гель
      
3. 
   Сборка аппарата для проведения электрофореза:
   
   1. 
      Собираем систему для проведения электрофореза (закрепляем стекло с залитым гелем на камере, с другой стороны камеры ставим заглушку)
      
   2. 
      Вынимаем гребенку из застывшего концентрирующего геля и заливаем катодный буфер в верхнюю часть камеры
      
4. 
   Подготовка и нанесение образцов
   
   1. 
      Готовим образцы для электрофореза: смешиваем анализируемые пробы с буфером для образцов в соотношении 1:1 и кипятим 5 мин
      
   2. 
      В полученные «карманы» геля осторожно наносим пробы, которые из-за разности в плотности с катодным буфером опускаются на дно кармашков
      
   3. 
      В нижнюю часть камеры заливаем анодный буфер
      
5. 
   Проведение электрофореза
   
   1. 
      Полностью собираем систему для проведения электрофореза и подключаем ее к источнику тока: сначала форез ведется при токе 15 мА, после перехода лидирующего красителя из концентрирующего в разделяющий гель силу тока увеличивают до 30 мА (в случае использования стабилизации по напряжению – 50 В и 120 В, соответственно)
      
   2. 
      Выключаем систему, после того как полоса лидирующего красителя дойдет до нижней границы геля
      
6. 
   Фиксация и окраска геля
   
   1. 
      Гель снимаем со стекол и помещаем в фисирующий раствор
      
   2. 
      Затем гель окрашиваем и отмываем от избыточного фона краски согласно протоколу метода
      
7. 
   Анализ результатов
   
   1. 
      Фотографируем гель, используя систему гель-документирования
      
   2. 
      Анализируем полученные результаты, используя специальные программы
      

Задача 1. Электрофоретическая характеристика смеси белков и определение молекулярных масс входящих в нее компонент.
Задача 2. Анализ экспрессии белка в клетках E.coli (сравнение неидуцированного контроля и биомассы содержащей белок).

Электрофорез для разделения белков (15-200 кДа) по Лэммли

Глицин-ПААГ электрофорез (протокол)
Стоковые растворы:

Замечания:

Для всех растворов необходимо использовать либо бидистиллированную либо деионизированную (milliQ) воду.

Все растворы готовить только на Трис (а не Трис-HCl); рН доводить концентрированной соляной кислотой (не доводить рН NaOH ни в коем случае!!! – это приводит к увеличению ионной силы буфера и образующийся NaCl сильно влияет на силу тока при э/ф).

Стоки, содержащие акриламид и бисакриламид необходимо растворять при постоянном перемешивании (на вортексе), после доведения объема обязательно профильтровать. Хранить при +4°С не более 3-х месяцев.

Концентрат геля (30, 8% Т, 2,7% С):

Акриламид – 30 г

Бисакриламид – 0,8 г

Растворить и довести объем до 100 мл, обязательно профильтровать.

Хранить при +4С не более 3-х месяцев.
Буфер для концентрирующего геля (4-х кратный):

0,5 М Tris-HCl, 0,4% SDS, рН 6,8.

Объем: 200 мл.

рН доводить перед добавлением SDS. Хранить при +4С.

Буфер для разделяющего геля (4-х кратный):

1,5 М Tris-HCl, 0,4% SDS, рН 8,8.

Объем: 200 мл.

рН доводить перед добавлением SDS. Хранить при +4С.

Буфер для э/ф:

0,025 М Tris-HCl (3 г)

0,192 М глицин (24,4 г)

0,1% SDS (1 г)

рН ~8,3.

Объем: 1000 мл.

рН не доводить. Хранить при +4С.


Буфер для образцов (2-х кратный):

0,02 М Tris-HCl

0,0021 М ЭДТА

2% SDS

10% 2-меркаптоэтанол

20% глицерин

0,002% бромфенолового синего

рН 8,0.

Хранить при -20С не более 6 месяцев.
Заливка геля:
Концентрирующий гель: Разделяющий гель (10%):

650 мкл концентрата геля 3,3 мл концентрата геля

1250 мкл концентрирующего буфера 2,5 мл разделяющего буфера

5 мкл ТЕМЕД 10 мкл ТЕМЕД

3 мл воды 4,09 мл воды

дегазировать дегазировать

50 мкл 10% персульфата аммония 100 мкл 10% персульфата аммония

Объем: 5 мл Объем: 10 мл

Персульфат аммония (10% раствор): 30 мг персульфата аммония + 270 мкл воды (каждый раз готовится свежий раствор или приготовленный 10% раствор хранят при -20С не более 1 месяца).
Подготовка образцов: 20 мкл белка +20 мкл буфера для образцов, кипятить 5 мин.
Раствор для фиксации и окрашивания геля:

125 мл изопропанола

50 мл уксусной кислоты

325 мл воды

1,25 г Кумасси R-250

Объем: 500 мл.

Краску профильтровать. Хранить в плотно закрытой бутылке под тягой.
Раствор для отмывки:

50 мл уксусной кислоты

50 мл изопропанола

400 мл воды

Объем: 500 мл.

Хранить в плотно закрытой бутылке под тягой.

Электрофорез для разделения низкомолекулярных белков и пептидов (1-30 кДа)

Трицин-ПААГ электрофорез (протокол)

Стоковые растворы:

Замечания:

Для всех растворов необходимо использовать либо бидистиллированную либо деионизированную (milliQ) воду.

Все растворы готовить только на Трис (а не Трис-HCl); рН доводить концентрированной соляной кислотой (не доводить рН NaOH ни в коем случае!!! – это приводит к увеличению ионной силы буфера и образующийся NaCl сильно влияет на силу тока при э/ф).

Стоки, содержащие акриламид и бисакриламид необходимо растворять при постоянном перемешивании (на вортексе), после доведения объема обязательно профильтровать. Хранить при +4°С не более 3-х месяцев.

Анодный буфер:

200 мМ Трис-HCl, pH 8.9 (готовится из 10х стока).

Приготовление 10-кратного стока: 121.1 г Трис растворить в 450 мл воды MilliQ, довести рН до 8.9 концентрированной HCl. Довести объем раствора до 0.5 л, профильтровать. Хранить при +4С.
Катодный буфер:

100 мМ Трис-HCl, 100 mM трицин (рН должен быть в районе 8.25). Готовится из 10х стока. Перед использованием добавить SDS до 0.1%.

Приготовление 10-кратного стока: Смешать 60.55 г Трис и 89.59 г Трицина. Добавить воды MilliQ до 500 мл (рН не подводить, однако результирующий рН должен быть в районе 8.25), профильтровать. Хранить при +4С.
Буфер для геля:

3.0 M Трис-HCl, pH 8.45.

На 100 мл буфера – 36,33 г Трис, растворить до объема примерно 90 мл, затем довести рН до 8,45 концентрированной HCl. После этого в мерном цилиндре довести объем до 100 мл и профильтровать. Хранить при +4°С.
Сток акриламида AAк (концентрирующий гель):

48% акриламида, 1.5% бис-акриламида

(49.5%Т, 3%С): на 50 мл стока – 24г акриламида, 0,75 г бис-акриламида.

Сток акриламида ААр (разделяющий гель):

46.5% акриламида, 3.0% бис-акриламида

(49.5%Т, 6%С): на 50 мл стока – 23,25г акриламида, 1,5 г бис-акриламида.
Заливка геля:
Разделяющий гель (16,5%) Концентрирующий гель

2 мл воды 4 мл воды

3 мл буфера для геля 1.5 мл буфера для геля

3 мл сток AA_р 0.5 мл сток AA_к

1.2 г (0.95 мл) глицерина - глицерина

90 мкл 10% SDS 45 мкл 10% SDS

45 мкл 10% персульфата аммония 50 мкл 10% персульфата аммония

4 мкл ТЕМЕД 5 мкл ТЕМЕД

Персульфат аммония (ПА 10% раствор): 30 мг персульфата аммония + 270 мкл воды (каждый раз готовится свежий раствор или приготовленный 10% раствор хранят при -20С не более 1 месяца).
Буфер для образцов (2-х кратный):

0,1 M Трис-HCl, pH 6.8

24% глицерин

8% SDS

4% 2-меркаптоэтанол

4 мМ ЭДТА

3 мМ азид натрия

0,02% Coomassie Blue G-250

Подготовка образцов: 20 мкл белка +20 мкл буфера для образцов, кипятить 5 мин.
Раствор для фиксации геля:

200 мл изопропанола

50 мл уксусной кислоты

250 мл воды

Объем: 500 мл.

Хранить в плотно закрытой бутылке под тягой.

Раствор для окрашивания геля:
50 мл уксусной кислоты

550 мл воды

125 мг Кумасси G-250

Объем: 500 мл.

Краску профильтровать. Хранить в плотно закрытой бутылке под тягой.

Раствор для отмывки:

50 мл уксусной кислоты

450 мл воды

Объем: 500 мл.

Хранить в плотно закрытой бутылке под тягой.
Список вопросов к коллоквиуму:

• 
  Электрофорез как метод разделения биологических макромолекул.
  
• 
  Виды электрофореза, их сравнение, преимущества и недостатки.
  
• 
  Использование электрофореза в полиакриламидном геле для разделения молекул белков и пептидов в соответствии с их молекулярной массой.
  
• 
  Анализ результатов, которые были получены в результате выполнения практической части спецкурса (определение гомогенности белковых препаратов и молекулярных масс белков, входящих в анализируемый препарат).
  

Список литературы

1. 
   Л.А.Остерман «Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование», Москва, «Наука» 1981.
   
2. 
   «Protein electrophoresis», Amersham Biosciences (www.amershambiosciences.com)
   
3. 
   Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970; 227: 680-685.
   
4. 
   Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem., 1987; 166: 368-379.
   

Список необходимого оборудования

Для проведения практикума необходима лаборатория (примерная площадь - 20 м²) оснащенная следующим оборудованием и расходными материалами:

1. 
   Вертикальная камера для электрофореза с комплектующими*;
   
2. 
   Источник питания с регулировкой силы тока или/и напряжения*;
   
3. 
   Система гель-документирования;
   
4. 
   Холодильник (+4º), с морозильной камерой (-20º) для хранения растворов*;
   
5. 
   Электронные аналитические весы* и набор шпателей для взвешивания;
   
6. 
   Система для получения деионизированной воды (milliQ);
   
7. 
   Магнитная мешалка с набором магнитных якорей;
   
8. 
   Мерные цилиндры (100 и 500 мл), мерные стеклянные стаканы.
   
9. 
   Стеклянные бутыли для хранения растворов.
   
10. 
    Один комплект пипеток-дозаторов (10, 200 и 1000 мкл)*;
    
11. 
    Пробирки конусные (15 и 50 мл), пробирки типа эппендорф (0,5 и 1,5 мл), наконечники для пипеток (20, 200, 1000, 5000 мкл)*.
    
12. 
    Список необходимых реактивов: акриламид, N,N' –метиленбисакриламид, Трис, додецилсульфат натрия (SDS), персульфат аммония, N,N,N',N' – тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), глицин, трицин, глицерин, β-меркаптоэтанол, ЭДТА, бромфеноловый синий, Кумасси R 250, Кумасси G 250, изопропанол, уксусная кислота, глутаровый альдегид, набор маркеров молекулярных масс белков (15-150 кДа) и набор низкомолекулярных маркеров молекулярных масс белков и пептидов (1-30 кДа).