Перейти на главную страницу
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт - Петербург
2010
Диссертационная работа выполнена на кафедре фармакологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования
доктор медицинских наук, профессор Крауз Владислав Алексеевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Звартау Эдвин Эдуардович
доктор биологических наук Хныченко Людмила Константиновна
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова
Защита диссертации состоится « 1 » июля 2010 года в 1500 часов на заседании
Диссертационного совета Д 001.022.03 при Учреждении Российской академии
медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-западного отделения РАМН, 197376, Санкт-Петербург, Каменоостровский
проспект, 69/71.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор Л. В. Пучкова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время антигипоксанты находят широкое применение для лечения и профилактики заболеваний различного генеза, таких как острые нарушения мозгового кровообращения, вегетососудистые дистонии, невротические состояния, депрессии, циркуляторные энцефалопатии, острые интоксикации нейролептиками и ряда других заболеваний [Оковитый С. В. и соавт., 2005; Воронина Т. А. и соавт., 2002;
Зозуля Ю. А. и соавт., 2000, 2005].
К антигипоксантам относят вещества, способствующие улучшению утилизации организмом кислорода и снижению потребности в нем органов и тканей, суммарно повышающие устойчивость к гипоксии [Виноградов В. М. и соавт., 1973, 2001; Смирнов и соавт., 1992; Зарубина И. В., 2004; Лукьянова Л. Д., 2004].
Антигипоксанты ингибируют свободно-радикальные процессы, перекисное окисление липидов, улучшают энергетический обмен клетки, оказывают мембранотропное действие и модулирующее влияние на работу мембраносвязывающих ферментов, ионных каналов и рецепторов, в частности, бензодиазепиновых, гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), ацетилхолиновых, повышая активность синаптических процессов [Воронина Т. А. и соавт., 2002]. Вместе с тем роль и участие различных нейротрансмиттерных систем, в том числе и ГАМК, в эффектах антигипоксантов изучены недостаточно.
В исследованиях В. А. Крауза и его сотрудников было показано, что действие различных нейротропных лекарственных средств в норме отличается от их эффектов в условиях экспериментального невротического состояния и определяется исходным состоянием ЦНС [Крауз В. А. и соавт., 1984, 1986; Крауз В. А., 1982, 2002].
Согласно современным представлениям одним из основных звеньев патогенеза невротических расстройств является циркуляторная гипоксия [Айрапетянц М. Г., Вейн А. М., 1982; Айрапетянц М. Г., 2005, 2006].
Несмотря на большое разнообразие синтетических лекарственных средств, которые применяются для лечения неврозов, остаётся актуальной разработка эффективных и безопасных препаратов природного происхождения [Blumenthal M., Commission E., 1998, 2000; Mills S., Bone K., 2000; Murray M. T., Pizzorno Y. E., 1998]. Известно, что фитопрепараты способствуют улучшению симптоматики при лечении многих хронических заболеваний, в том числе невротических расстройств [Пастушенков Л. В., Лесиовская Е. Е., 1991;
В этом отношении большой интерес представляют фитопрепараты из надземной части остолодочника остролистного Oxytropis oxyphylla Pall. – оксофил [Патент РФ №2116797 от 10.08.1998] и донника лекарственного Melilotus officinalis (L.) Desr. – мелилотин [Патент РФ № 2223110 от 14.10.2002], разработанные в Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии.
Нейротропные эффекты фитоантигипоксантов (оксофила и мелилотина) связаны с наличием в растениях биологически активных веществ различных классов, в том числе и нейроактивных аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой, цистеина, аланина, фенилаланина, глицина, лейцина, триптофана) [Бахтина С. М., 1996; Пастушенков Л. В., Лесиовская Е. Е., 1991]. В нашей работе наряду с антигипоксантами растительного происхождения (оксофил и мелилотин) были исследованы также антигипоксанты синтетического происхождения (мексидол и когитум) [Воронина Т. А. и соавт., 2002, 2003; Зозуля И.С., 2005].
Доказано, что у животных и людей существуют индивидуальные различия как по устойчивости к стрессу, так и по эффективности стресспротекторов [Вальдман А. В., 1984; Лапин И. П., 1998; Середенин С. Б., 1998, 2001; Арушанян Э. Б., 2000, 2004; Лесиовская Е. Е., 2001]. Вместе с тем, несмотря на многочисленные клинические и экспериментальные данные, механизмы индивидуальной устойчивости изучены недостаточно и требуют дальнейшей разработки [Arushanian E. B., 2005, 2007; Seredenin S. B., 1993, 1994, 2003]. Представляется перспективным исследовать эффекты антигипоксантов у животных с различной индивидуальной устойчивостью в стрессовой ситуации.
Изучение влияния оксофила и мелилотина на тревожность, когнитивные функции, а также на нейротрансмиттерные системы ранее не проводилось.
Цель исследования. Провести фармакологический анализ участия ГАМК в эффектах антигипоксантов растительного (оксофил и мелилотин) и синтетического (мексидол и когитум) происхождения на поведение, уровень тревожности и когнитивные функции крыс с различной индивидуальной устойчивостью в условиях нормы и экспериментального невротического состояния.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние оксофила, мелилотина, мексидола и когитума на поведение, уровень тревожности и когнитивные функции высоко- и низкоустойчивых животных в стрессовой ситуации в условиях нормы и экспериментального невротического состояния.
2. Исследовать влияние веществ, ингибирующих синтез и распад ГАМК, в регуляции поведенческих реакций животных в норме и в условиях экспериментального невротического состояния.
3. Оценить участие ГАМК в эффектах антигипоксантов в условиях экспериментального невротического состояния.
4. Определить влияние исследуемых антигипоксантов на общесоматические показатели (массу тимуса, селезёнки, надпочечников и состояние слизистой желудка) животных с различной индивидуальной устойчивостью в стрессовой ситуации в условиях экспериментального невротического состояния.
5. Провести биохимические исследования влияния антигипоксантов на метаболические изменения в структурах головного мозга и крови высоко- и низкоустойчивых в стрессовой ситуации животных при экспериментальном невротическом состоянии.
Впервые установлено, что тиосемикарбазид, угнетающий синтез ГАМК, и аминооксиуксусная кислота, ингибирующая её распад, проявляют анксиогенное действие в различной степени в зависимости от типа индивидуальной устойчивости в стрессовой ситуации. При этом тиосемикарбазид оказывает более выраженное действие в группе высокоустойчивых, а аминооксиуксусная кислота – в группе низкоустойчивых невротизированных животных. Влияние исследуемых веществ на сохранение энграмм памяти у интактных животных отличается от такового у невротизированных крыс с различной степенью устойчивости в стрессовой ситуации.
Показано участие гамма-аминомасляной кислоты в анксиолитическом и ноотропном эффектах антигипоксантов у животных высоко- и низкоустойчивых в стрессовой ситуации как в норме, так и при экспериментальном невротическом состоянии.
Впервые установлено, что стресспротективный эффект проявляют оксофил и мелилотин в группе низкоустойчивых невротизированных животных, тогда как в группе высокоустойчивых невротизированных крыс не оказывают такого действия. Наиболее выраженный антигипоксический эффект оксофил и мелилотин проявляют в группе низкоустойчивых невротизированных животных. При этом более выраженное уменьшение содержания малонового диальдегида (МДА) на фоне действия исследуемых препаратов в условиях хронической невротизации отмечено в коре больших полушарий, чем в гиппокампе по сравнению с контрольной группой невротизированных крыс.
Материалы диссертации используются в лекционном курсе на кафедре фармакологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии на занятиях по дисциплине фармакология, клиническая фармакология.
Апробация диссертации прошла на совместном межкафедральном заседании кафедр фармакологии, физиологии и патологии, биохимии и лаборатории фармакологических исследований СПХФА 10 февраля 2010 года.
Для проведения экспериментальных исследований использовали нелинейных белых крыс самцов массой 180–200 г (n=700), полученных из питомника «Рапполово» РАМН (Ленинградская область). Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе со свободным доступом к воде при 12 часовом световом дне. Крыс помещали в экспериментальную комнату за один день до начала опыта, который выполняли в интервале 11.00–16.00 по местному времени при естественном освещении.
АГ = Н + Х ЭЛ = D + U
По результатам тестирования формировали 2 группы животных с близкими этологическими показателями в зависимости от их эмоционального состояния в тесте «открытое поле» и «норковый рефлекс», которые условно разделили на высокоустойчивых (ВУ) и низкоустойчивых (НУ)
[Лесиовская Е. Е., 1989; Маркель А. Л., 1981].
В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) оценивали анксиолитическую активность препаратов. Крысу помещали в центр установки, которая состояла из крестообразно расходящихся от центральной площадки под прямым углом 4–х рукавов: два противоположных, отрытых, без стенок и два закрытых, темных. Высота над полом 1 м. Эксперименты проводили при обычном освещении в течение 5 минут. Определяли время, проведённое животными в открытых и закрытых рукавах, число заходов в открытые и закрытые рукава, количество свешиваний и выглядываний с открытого рукава, количество стоек, груминг, время нахождения на центральной площадке, латентный период первого захода в открытый рукав, число уринаций и дефекаций [Воронина Т. А., 2000; Лапин И. П., 2000; Crus A.P.M., Frei F.,
В тесте «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) оценивали влияние препаратов на обучаемость и сохранение энграмм памяти [Буреш Я. и др., 1991; Руководство.., 2005]. УРПИ вырабатывали на основе однократного электрокожного подкрепления в установке, состоящей из двух камер – большой (освещённой) и малой (тёмной) с электрифицированным полом, сообщающихся между собой круглым отверстием. Для выработки условной реакции животное помещали на 3 минуты в середину освещённой камеры хвостом к отверстию. Исследуя освещённое помещение, крыса находила проход в тёмную камеру и проникала в неё. Через 15 секунд на решетчатый пол камеры подавали переменный ток (50 Гц, 2-3 с), величину которого для каждого животного подбирали индивидуально. Отверстие между камерами оставалось открытым. За перебежавшей в светлую камеру крысой наблюдали в течение последующих 3 минут и, если она не пыталась вернуться в тёмное помещение, УРПИ считалась выработанной в одном сочетании. Животных, повторно зашедших в тёмную камеру в течение 3 минут, исключали из опыта. Крыс с выработанной реакцией избегания помещали в клетку, где они обычно содержались. Через 24 часа после выработки пассивно-оборонительного навыка животное помещали в светлую камеру и проводили проверку сохранения условной реакции. Незахождение крысы в тёмную камеру расценивали как сохранение навыка пассивного избегания, а укорочение времени её нахождения в освещённой камере и проникновение в тёмную камеру – как амнезию навыка [Руководство.., 2005].
Результаты, полученные в тестах «открытое поле» и «норковый рефлекс», показали, что высокоустойчивые (ВУ) в стрессовой ситуации животные проявляли преимущественно уравновешенный тип поведения. Показатели ориентировочной и поисковой активности в этой группе существенно не отличались от таковых в группе низкоустойчивых (НУ) крыс. Однако эмоциональная лабильность и агрессивность НУ животных были повышены соответственно в 3,5 и 1,2 раза по сравнению с группой ВУ крыс, что свидетельствует о повышенном исходном уровне тревожности этой группы животных.
В условиях хронической невротизации показатели ориентировочной, поисковой активности и агрессивности между двумя группами животных не отличались. Между тем, эмоциональная лабильность в группе НУ невротизированных животных была повышена в 3 раза по сравнению с группой ВУ невротизированных крыс.
На фоне хронической невротизации уменьшались показатели ориентировочной активности и агрессивности как в группе ВУ, так и в группе НУ крыс по сравнению с интактными животными, тогда как эмоциональная лабильность увеличивалась на 75% (в 1,8 раза) в группе ВУ и на 54%
Таким образом, в условиях экспериментального невроза снижаются показатели горизонтальной (ориентировочной) активности, вертикальной (поисковой) активности и агрессивности, тогда как показатель эмоциональности (количество дефекаций и уринаций) достоверно увеличивается, что характеризует наличие повышенной эмоциональной возбудимости у животных.
Результаты, полученные в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» показали, что у интактных крыс в группе НУ в стрессовой ситуации время пребывания в открытых рукавах и число заходов в открытые рукава были значительно выше – в 3,3 и 1,8 раза соответственно по сравнению с группой ВУ животных, что свидетельствует о низком исходном уровне тревожности этой группы особей (рис. 1).
![]() ![]() |
|
Примечание – * – достоверность различий по сравнению с контролем 1 (p < 0,05).
1 – контроль 1; 2 – когитум; 3 – оксофил; 4 – мексидол; 5 – мелилотин; 6 – контроль 2; 7 – когитум на фоне невротизации; 8 – оксофил на фоне невротизации; 9 – мексидол на фоне невротизации; 10 – мелилотин на фоне невротизации
Однако на фоне хронической невротизации НУ в стрессовой ситуации животные проявляли высокую степень тревоги, что выражалось в уменьшении времени их нахождения в открытых рукавах лабиринта (в 2,7 раза) и количестве заходов в открытые рукава (в 1,5 раза). При этом число выглядываний и свешиваний в открытые рукава увеличивалось в 1,9 и 1,6 раза соответственно. Крысы выполняли неполные выходы из рукавов с демонстрацией так называемой «оценки риска» в виде вытянутой позы со свешиванием с лабиринта (рис. 1).
У высокоустойчивых интактных крыс, напротив, отмечался более высокий исходный уровень тревожности, тогда как в условиях экспериментального невроза показатели тревожности этой группы снижались: увеличивалось время нахождения их в открытых рукавах (в 3 раза) и на центральной площадке (в 5 раз) с одновременным увеличением числа заходов в открытые рукава (в 1,6 раза) по сравнению с интактными животными (рис. 1).
В тесте «условная реакция пассивного избегания» установлено, что в контрольной группе животных 1 (интактные) при воспроизведении УРПИ через 24 часа после обучения все особи (в группе ВУ) и 80% (в группе НУ) помнили об ударе током и не заходили в тёмную «опасную» камеру в течение всего времени наблюдения. Остальные крысы в группе НУ заходили в темный отсек с большим латентным периодом. Невротизированные крысы – 90% (в группе ВУ) и 80% (в группе НУ) также сохраняли навык пассивного избегания и не заходили в опасный отсек.
Таким образом, полученные экспериментальные данные показали, что в группе низкоустойчивых животных исходный уровень тревожности ниже, чем в группе высокоустойчивых крыс, тогда как в условиях экспериментального невротического состояния НУ животные проявляли высокую степень тревоги по сравнению с группой ВУ невротизированных крыс.
В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» установлено, что в обеих группах животных на фоне действия тиосемикарбазида, который является ингибитором глутаматдекарбоксилазы и вследствие этого уменьшает содержание ГАМК в ЦНС, наблюдалось однонаправленное изменение поведенческих реакций животных, которое характеризуется повышенным уровнем тревожности (рис. 2).
Антигипоксантов на тревожность и когнитивные функции при экспериментальном невротическом
13 10 2014
4 стр.
25 12 2014
3 стр.
11 10 2014
5 стр.
Учебно-методическое и информационное обеспечение дисциплины клиническая фармакология
14 12 2014
1 стр.
Работа выполнена в отделе нейрофармакологии им. С. В. Аничкова Научно-исследовательского института экспериментальной медицины Северо-Западного отделения рамн
25 12 2014
3 стр.
10 10 2014
5 стр.
04 09 2014
4 стр.
08 10 2014
4 стр.