Карань Л.С.1, Шопенская Т.А.1, Федорова М.В.1, Колясникова Н.М.1,2, Платонов А.Е.1, Шипулин Г.А.1, Русакова Н.М.3, Шишкина Л.В.3, Ткаченко Г.А.4, Говорухина М.В.5, Мазрухо Т.В.5, Валенцева А.А.6, Найда Е.А.7, Клиновая Е.П.8
1 ФГУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора РФ, Москва, Россия;
2 ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П. Чумакова РАМН; Московская обл., Россия;
3 ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Волгоградской области», Волгоград, Россия;
4ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт», Волгоград, Россия
5 ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области», Ростов-на-Дону, Россия;
6 МУЗ Городская больница №1 им. Семашко г.Ростов-на-Дону, Ростов-на-Дону, Россия;
7 МУЗ Городская поликлиника №16 г.Ростов-на-Дону, Ростов-на-Дону, Россия;
8 МУЗ Центральная районная больница Сальского района г.Ростов-на-Дону, Ростов-на-Дону, Россия;
Введение: Лихорадка Западного Нила (ЛЗН) – острая вирусная природно-очаговая, трансмиссивная, летне-осенняя арбовирусная инфекционная болезнь, которая характеризуется лихорадочно-интоксикационным синдромом и частым поражением центральной нервной системы, встречается в странах с умеренным климатом. Возбудитель лихорадки Западного Нила (ЛЗН) – вирус Западного Нила (ВЗН), принадлежит к роду Flavivirus семейства Flaviviridae и является членом антигенного комплекса вируса японского энцефалита. По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей внутри вида различают 5 генотипов (не утверждены на момент 2009 года международным комитетом по таксономии вирусов, и порядок цифрового обозначения генотипов различается в российских и зарубежных публикациях): I - эпидемические штаммы, циркулирующие повсеместно: в Евразии, Африке, Америке и Австралии (вирус Кунджин из Австралии рассматривается как вариант ВЗН первого генотипа); II - изоляты из Южной и Центральной Африки и с Мадагаскара, изоляты из Туркмении, Украины и Белоруссии, в 2002 г. РНК ВЗН этого генотипа обнаружена в комарах Cq. richiardii и An.hyrcanus в Астраханской области, в 2004 г. – в ястребе-тетеревятнике Accipiter gentilis в Венгрии и у больных в Ростовской области, в 2007 ВЗН II генотипа вызвал вспышку ЛЗН в Волгоградской области; V - штаммы из Индии, IV - два штамма из Краснодарского края, многочисленные изоляты от комаров Uranotaenia unguiculata и озерных лягушек Rana ridibunda в Волгоградской области, единичные находки в An.hyrcanus в Астраханской области; III - штамм Rabensburg, выделенный в Чехии.
С 1994 г. стали регистрироваться крупные вспышки ЛЗН, в том числе и в тех странах, где ранее случаи этого заболевания не наблюдались. В 1999 г. ЛЗН была зарегистрирована на востоке США и затем распространилась по всей территории этой страны. В Российской Федерации крупная вспышка ЛЗН также произошла в 1999 г. и охватила Волгоградскую, Астраханскую области и Краснодарский край (около 500 случаев). В последующие годы в этих регионах, а также в Ростовской области, продолжают регистрироваться случаи заболевания с подъемами в 2005 г. (Астраханская область, 73 случая) и в 2007 г. (Волгоградская область – 64 случая). В 2010 году зарегистрирована самая крупная вспышка ЛЗН на юге России, с 1999 года зарегистрировано более 360 случаев заболевания в Волгоградской области и более 40 – в Ростовской области.
Клиническая картина ЛЗН в последние 20 лет претерпела изменения, резко возросла тяжесть ее течения, летальность во время вспышек составляет 4-6%. В связи с этим ЛЗН вошла в число болезней, представляющих серьезную угрозу для здоровья населения. Своевременный выбор адекватной терапии в современных условиях должен основываться на комплексе лабораторных методов, позволяющих обеспечить раннюю дифференциальную экспресс-диагностику заболевания при поступлении больного в стационар.
Цель: Генетический анализ вспышек, вызванных вирусом ЛЗН на эндемичных территориях юга России.
Материалы и методы: Во время вспышки 2010 г. ЛЗН исследовано 139 сывороток крови из Волгоградской области и 38 из Ростовской области, а также аутопсийный материал от 5 умерших пациентов из Волгоградской области. Детекцию вирусной РНК осуществляли по разработанной нами методике, основанной на ПЦР в режиме реального времени и включающей праймеры и зонд, специфичный 5' нетранслируемой области и участку С гена ВЗН. Тест-система была апробирована на штаммах Еg-101, астраханском штамме Нр-94, азербайджанских штаммах А-72 и А-1640, а затем в течение 3 лет проводились испытания на клиническом материале: сыворотках крови, спинно-мозговой жидкости от больных, у которых диагноз ЛЗН был поставлен на основании клинико-эпидемиологических данных и обнаружения специфических IgM к вирусу ЛЗН, а также на материале из внешней среды: тканях мозга птиц, комарах и клещах. Аналитическая чувствительность тест-системы составила 5х103 коп/мл при выделении РНК из 100 мкл плазмы крови и 5х102 коп/мл – из 1000 мкл плазмы крови. Специфичность при анализе гетерологичных штаммов вирусов - 100%.
Основные результаты: В ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора изучение ЛЗН началось в 1999 году на материале из Волгоградской области, в течение последующих лет (2000, 2001, 2002, 2003, 2007) велись динамические наблюдения за присутствием вируса в комарах и птицах, в клиническом материале от больных лихорадками, менингитами и энцефалитами в эпидемический сезон в данном регионе. В 2004 и 2010 гг. исследовалась сыворотки от больных из Ростовской области на наличие вирусной РНК с ее последующим генотипированием.
При исследовании переносчиков и резервуарных хозяев инфекции в 2000 – 2003 гг. на территории Волгоградской области вирусная РНК обнаружена в комарах Culex pipiens и воронах Corvus corone.
В эти годы в Волгоградской области все случаи заболевания и инфицирования комаров и птиц были вызваны вирусом Западного Нила I генотипа и относились к так называемому «волгоградскому клону». При секвенировании полноразмерной последовательности генома от умершего больного в 1999 г. была установлена высокая степень гомологии данного изолята со штаммом, выделенном в Румынии из комаров во время вспышки ЛЗН в 1996 году. Данный «волгоградский» изолят циркулировал на территории Волгоградской области вплоть до 2003 года. В 2003, 2004 годах на территории Волгоградской области не наблюдалось случаев заболевания ЛЗН.
Возвращение эпидемической активности вируса зарегистрировано в 2005 году (4 случая), она продолжалась в 2006 году (7 больных) и новый подъем отмечался в 2007 году (64 больных).
В 2007 году нами был исследован следующий клинический материал из Волгоградской области: 16 проб лейкоцитарной фракции крови и 77 образцов сывороток крови от 56 больных ЛЗН. Вирусная РНК была обнаружена в 10 пробах. При секвенировании РНК 9 изолятов выявлена их принадлежность ко II генотипу ВЗН, ранее не встречавшемуся в Европе, США и Азии.
Также вирусная РНК была обнаружена в тканях мозга 1 погибшего от ЛЗН в 2007 году в Волгоградской области пациента, и проведено секвенированние полноразмерного генома данного изолята. При секвенировании показана уникальность данной вирусной популяции, вызвавшей вспышку ЛЗН в Волгограде в 2007 г. Близкого «генетического родственника» для волгоградских изолятов 2007 года найдено не было среди когда-либо изученных штаммов, нуклеотидные последовательности которых расшифрованы и депонированы в GenBank.
Во время этой вспышки была показана способность ВЗН II генотипа вызывать все виды клинического течения ЛЗН: от лихорадки легкой степени тяжести до энцефалитов с летальным исходом.
В 2010 году во время вспышки ЛЗН в Волгоградской области вирусная РНК обнаружена в аутоптатах 3 умерших пациентов и в 43 из 139 исследованных сывороток. При секвенировании 4 образцов показана 99,6% гомология ВЗН, вызвавшего вспышку в 2010 году в Волгоградской области, с изолятами 2007 года с этой же территории (рис.1).
Впервые клинический материал из Ростовской области, полученный от больных ЛЗН эпидсезона 2004 года, нами был изучен ретроспективно в 2007 году. При исследовании 6 сывороток от 6 больных ЛЗН вирусная РНК была выявлена в 2 пробах и при генотипировании отнесена ко II генотипу ВЗН, аналогичному изолятам вируса, вызвавшего вспышку в Волгоградской области в 2007 году. В 2010 году РНК ВЗН выявлена в 11 пробах из 38 исследованных. При секвенировании 2 образцов было показано, что вспышка вызвана WNV II генотипа, и вирус идентичен волгоградским образцам 2007 и 2010 годов (рис.1).
Заключение: ЦНИИ эпидемиологии предложена лабораторная методика, позволяющая выявлять РНК вируса ЛЗН в сыворотках крови пациентов, в аутопсийном материале от инфицированных людей с целью применения как одного из диагностических методов, а также в ткани мозга птиц и комарах при проведении вирусологического мониторинга на территориях эндемичных по данному заболеванию.
I генотип
Волгоградские изоляты 1999 – 2003 гг.
Волгоградские и ростовские изоляты 2004, 2007, 2010 гг.
II генотип
Рис.1 Дендрограмма генетического родства изолятов ВЗН, входящих в группу Krnd-88-190, основанная на нуклеотидной последовательности участка Е гена длиной 973 н.п.
Дендрограмма построена с помощью программы Mega 3.1 и использованием Neighbor Joining и модели расстояния Kimura 2-parameter.