Практикум по микробиологии учебное пособие

Культуральные

свойства

Питательные среды

Среда Сабуро

Форма колоний

.

.
.

9.Консистенция

Микроскопическая картина

Исследуемый

продукт

9 см³ 9 см³ 9 см³

Н₂О Н₂О Н₂О

1 см³ 1 см³ 1 см³

…

I разведение II разведение III разведение

(1:10) (1:10²) (1:10³)

Рис. 12 Схема приготовления разведений продукта

и высева его в чашки Петри
Рекомендации при приготовлении I разведения (1:10):

из кондитерских изделий с кремом, из маргарина

1 г крема или маргарина взвешивают с соблюдением правил асептики и вносят в пробирку с 9 см³ воды. Затем пробирку помещают в водяную баню с температурой 50…55⁰С. Выдерживают пробирку на водяной бане до полного расплавления крема. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и для последующих разведений отбирают 1 см³ жидкости, находящейся под слоем масла;

из продуктов, имеющих плотную и неоднородную консистенцию (например, из колбасных изделий, овощных консервов)

1 г средней пробы исследуемого продукта взвешивают с соблюдением правил асептики, помещают в стерильную ступку. В ступку также вносят 9 см³ стерильной воды, и материал растирают с песком в течение 10…15 мин вблизи пламени горелки до получения однородной массы. Далее дают взвесям осесть и отбирают 1 см³ надосадочной жидкости для приготовления разведения 1:100.

Чашечные методы количественного учета микроорганизмов

Сущность чашечных методов количественного учета микроорганизмов заключается в посеве разведений продукта на стерильные плотные питательные среды в чашки Петри с последующим культивированием и подсчетом выросших в чашках колоний. При этом считается, что каждая колония является результатом размножения одной клетки.

Учет результатов при использовании чашечных методов

Количество выросших колоний подсчитывают в каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне, пользуясь лупой с увеличением от 4 до 10 раз. При большом количестве колоний и равномерном их распределении дно чашки делят на сектора, подсчитывают число колоний в 2-3 секторах, находят среднеарифметическое число колоний и умножают на разведение (10 – при первом разведении продукта, 100 – при втором разведении и т.д.).

Если инкубированные чашки с первым разведением (1:10) не содержат колоний, то результат выражают так: меньше 1х10 КОЕ/см³ (КОЕ – колониеобразующие единицы);

Если в чашках Петри с I разведением (1:10) содержится меньше, чем 15 колоний, то результат выражается так: количество микроорганизмов менее Мх10 КОЕ/г, где М – число выросших колоний;

Если количество колоний более15, то подсчитывают количество колоний в чашках, умножают на разведение и полученный результат округляют в соответствии с ГОСТом 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов»:

до числа, кратного 5, если количество колоний в чашке менее 100;
до числа, кратного 10, если количество колоний в чашке более 100.

Пример: Посеяно I разведение продукта 1:10. В чашке Петри выросло 194 колонии. Полученный результат округляем до 200.

Количество микроорганизмов в продукте: 200х10=2,0х10³КОЕ/г.

Чашечными методами определяют следующие микробиологические показатели: КМАФАнМ, количество спор грибов и дрожжей, содержание гнилостных бактерий, коагулазоположительных стафилококков.

Определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

Перед посевом чашки маркируют.

По 1 см³ разведений продукта вносят в чашки Петри. Пипетку с посевным материалом держат под углом 45⁰С, касаясь концом пипетки дна чашки. Затем в каждую чашку наливают по 12-15 см³ мясопептонного агара или среды для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, расплавленной и охлажденной до 45⁰С. Сразу после заливки агара содержимое тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала. Если ожидают ползучий рост микроорганизмов посевы после застывания агара заливают вторым слоем питательной среды или 3…5 см³ водного раствора агара. После застывания среды чашки Петри переворачивают крышками вниз и помещают в термостат при (30±1)⁰С на 72 часа (допускается предварительный учет через 48 часов с последующим окончательным учетом через 24 часа).

Определение количества грибов и дрожжей

Ведут так же, как и определение КМАФАнМ, только в качестве питательной среды используют сусло-агар или среду Сабуро. Инкубацию посевов ведут при температуре 24⁰С в течение 5 суток с предварительным учетом через 3 суток.

Определение протеолитических (гнилостных) бактерий

Соответствующее разведение продукта засевают на молочный агар инкубацию посевов проводят при 30 ⁰С в течение 72 часов. Протеолитические бактерии на молочном агаре при своем росте образуют зоны просветления агара (зоны протеолиза). Пептонизирующие бактерии образуют узкие зоны пептонизации.

Определение коагулазоположительных стафилококков

Ведут так же, как и определение КМАФАнМ. В качестве питательной среды используют молочно-солевой или желточно-солевой агар. Культивирование проводят при 37 ⁰С в течение 24…48 часов. При росте на желточно-солевом агаре вокруг колоний образуются перламутровые зоны помутнения агара, а на молочно-солевом агаре – небольшие зоны пептонизации.3

Определение аэробных спорообразующих бактерий

рода Bacillus

Исследуемый материал или разведение продукта перед посевом пастеризуют при 75…85 ⁰С в течение 20 мин. Далее ведут определение так же, как и при определении КМАФАнМ. После пастеризации вегетативные клетки погибают, а споры после посева на МПА и культивирования при 37 ⁰С прорастают и в течение 24…48 час образуют колонии.

Методы, основанные на накоплении микроорганизмов

с последующей их идентификацией

Эти методы используются для выявления микроорганизмов, содержание которых незначительно в сравнении с общим количеством микроорганизмов. Сущность этих методов заключается в посеве продукта или его разведений на накопительные жидкие среды. Если после культивирования обнаруживают рост микроорганизмов (образование осадка, помутнение среды, накопление газа в поплавках), то в дальнейшем проводят пересев из пробирок, в которых замечен рост на дифференциально-диагностические среды для идентификации выросших на накопительной среде микроорганизмов.

К таким методам относятся определение наличия БГКП, сальмонелл.

Определение бактерий группы кишечной палочки

Для посева используют то количество продукта, в котором предусматривается отсутствие БГКП (1 см³ молока или 1 см³ первого разведения молока). Посев проводят в пробирки со средой Кесслера с поплавками. Посевы помещают в термостат с температурой 37⁰С на 24 часа.

При отсутствии признаков роста (газообразования в поплавках, помутнения среды) дают заключение об отсутствии БГКП и соответствии исследуемого продукта нормативу на БГКП.

При положительной бродильной пробе для окончательного заключения о наличии в продуктах БГКП из подозрительных пробирок производят посев на чашки со средой Эндо или Левина. Посев производят петлей из каждой пробирки так, чтобы получить рост изолированных колоний. Чашки помещают в термостат.

Учет результатов. При отсутствии на среде Эндо или Левина колоний, типичных для БГКП (на среде Эндо – красных с металлическим блеском, на среде Левина – черных с металлическим блеском, темных с черным центром, сиреневых с темным центром) считают, что продукт соответствует нормативу. При наличии на среде Эндо или Левина типичных колоний их окрашивают по Граму и микроскопируют. Обнаружение грамотрицательных, не содержащих спор палочек указывает на наличие БГКП в анализируемой пробе и несоответствии продукта по микробиологическому нормативу.

Определение сальмонелл

Асептически взвешенные навески сухих компонентов или стерильно отмеренные объемы жидких компонентов (обычно 25 г или 25 см³) засевают в колбы с магниевой средой или средой Мюллера (накопительные среды для сальмонелл), соблюдая соотношение продукта и среды не менее 1 : 9.

Для жидких продуктов допускается использование среды с двойной концентрацией ингредиентов при соотношении продукта и среды 1 : 1.

Колбы с посевами помещают в термостат с температурой 37 ⁰С на 18…24 часа.

После инкубации в термостате производят высев из колб с накопительными средами на поверхность дифференциально-диагностических сред (среду Плоскирева или висмут-сульфитный агар). Для получения отдельных колоний петлей берут минимальное количество посевного материала и производят посев штрихом. Чашки с посевами помещают в термостат с температурой 37 ⁰С. Проверку посевов осуществляют дважды: через 24 и 48 ч после инкубации в термостате.

Учет результатов. На среде Плоскирева колонии сальмонелл бесцветные, прозрачные, плоские, на висмут-сульфитном агаре – черные, с характерным металлическим блеском, зеленоватые с черным ободком, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией.

При отсутствии типичных колоний сальмонелл на каждой из сред конечный результат анализа записывают как «отрицательный», т.е. в исследуемой массе продукта сальмонеллы отсутствуют.

При наличии на любой из питательных сред на чашках Петри типичных или подозрительных колоний на сальмонеллы, производят их дальнейшее изучение по биохимическим и другим признакам.

Другие методы определения качественных

микробиологических показателей

6.2.4.1 Определение анаэробных сульфитредуцирующих клостридий

В пробирки, содержащие 9 см³ расплавленной и охлажденной до 45 ⁰С плотной среды Вильсона-Блера вносят, соблюдая правила асептики, 1 см³ соответствующих разведений исследуемого продукта. Тщательно перемешивают содержимое пробирки, помещают в термостат и культивируют при 37⁰С в течение 24 часов. За положительный титр принимают то максимальное разведение продукта, в посеве которого произошло почернение среды.

6.2.4.2 Определение бактерий рода Proteus

Ведут методом Шукевича. Для определения 0,5 см³ анализируемой взвеси (разведения) вносят в конденсационную воду свежескошенного агара, не касаясь поверхности среды.

Вертикально поставленные пробирки термостатируют при 37 ⁰С в течение 24 часов. На скошенном агаре палочка протея прорастает в виде голубоватого вуалеобразного налета. При микроскопии препарата обнаруживаются грамотрицательные неспорообразующие палочки.
2-е занятие
На втором занятии студенты исследуют посевы разведений продукта, подсчитывают количество выросших колоний в чашках Петри на мясопептонном агаре или среде для определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, среде Сабуро и т.д. Учет результатов при использовании чашечных методов ведут согласно п. 2.2.2. Изучают посевы продукта или его разведений в пробирках со средой Кесслера и поплавками. Если в пробирках со средой Кесслера газообразования в поплавках не наблюдается, то делают заключение об отсутствии БГКП во взятом на анализ объеме продукта. Полученные данные сравнивают с нормируемым значением, пользуясь приложением 3. Затем изучают качественный состав микрофлоры исследуемого продукта.

Изучение культуральных свойств выросших в чашках колоний

Чашки с посевами внимательно осматривают. Отмечают колонии микроорганизмов, отличающиеся по культуральным свойствам.

Рассматривая выросшие колонии в проходящем свете невооруженным глазом (макроскопически) и с помощью лупы описывают культуральные свойства по методике, описанной в разделе 5.2.2.

Изучение морфологических свойств микроорганизмов

При изучении морфологии выросших в чашках колоний на предметных стеклах готовят фиксированные мазки (при исследовании колоний одноклеточных микроорганизмов: бактерий, дрожжей) или препараты типа «раздавленная капля» (при исследовании колоний микроскопических грибов).

Фиксированные мазки окрашивают по Граму (см разд. 3.2.1) и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива (на х90). При микроскопровании препаратов обращают внимание на форму клеток; их взаимное расположение; наличие спор; отношение к окраске по Граму. Эти признаки позволяют отнести микроорганизмы к определенной группе.

Исследование препаратов микроскопических грибов ведут по методике, описанной в разделе 4.2.1.

Оформление и анализ результатов исследований

В отчете студенты кратко конспектируют теоретический материал. Результаты определения микробиологических показателей записывают, сравнивают с нормируемыми значениями (см. приложение 2). По результатам исследований студенты делают вывод о качестве исследованного продукта.

При изучении качественного состава микрофлоры продукта результаты исследований вносят в таблицу:

Таблица 1. Культуральные и морфологические признаки выросших в чашках колоний

После заполнения таблицы делается вывод о качественном составе микрофлоры исследованного продукта.

Контрольные вопросы

Какая главная задача микробиологического контроля сырья, полуфабрикатов и готовой продукции на предприятиях пищевой промышленности?
Кем и на основании каких документов проводится микробиологическое исследование пищевых продуктов?
Дать определение понятиям «безопасность» и «микробиологическая стойкость» пищевых продуктов.
Перечислить группы микробиологических критериев безопасности пищевых продуктов.
Какие микробиологические показатели относятся к группе показателей санитарного состояния пищевых продуктов?
Что такое общая бактериальная обсемененность (КМАФАнМ)? С какой целью определяется этот показатель?
В каких продуктах КМАФАнМ не определяется?
С какой целью в пищевых продуктах определяют БГКП?
Какие требования предъявляются к санитарно-показательным микроорганизмам?
С какой целью и в каких продуктах определяются условно-патогенные микроорганизмы?
Зачем в пищевых продуктах определяют содержание грибов и дрожжей? Во всех ли пищевых продуктах эти показатели нормируются?
Какие патогенные микроорганизмы нормируются в пищевых продуктах?
Дать понятие о системе критических контрольных точек (НАССР), используемой за рубежом.
Какие микробиологические показатели нормируются в определенных пищевых продуктах (в кремовых изделиях, в колбасных изделиях, в питьевом молоке, в маргарине и т.д.)?
Как готовятся разведения пищевых продуктов?
В чем сущность чашечных методов определения микроорганизмов в пищевых продуктах?
Какие микробиологические показатели определяются чашечными методами?
В чем сущность методов, основанных на накоплении микроорганизмов с последующей идентификацией? Какие микробиологические показатели определяются этими методами?
Какими методами определяются КМАФАнМ, наличие БГКП, титр анаэробных сульфитредуцирующих клостридий?
Как описываются культуральные свойства выросших в чашках колоний микроорганизмов?
Каким образом проводят определение коагулазоположительных стафилококков?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №7

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАКВАСОК И КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
Цель занятия: Ознакомиться с полезной микрофлорой заквасок и классификацией кисломолочных продуктов в зависимости от состава микрофлоры заквасок.

Ознакомиться с микробиологическими методами контроля качества заквасок и кисломолочных продуктов.

Освоить метод микроскопического исследования заквасок и кисломолочных продуктов на наличие посторонней микрофлоры.
Оборудование и материалы: Микроскоп; спиртовка; предметные стекла; бактериологические петли; иммерсионное масло; краска Муромцева; фильтровальная бумага; лоток с рельсами; промывалка.

Кисломолочные продукты (кефир, сметана, творог, ряженка, йогурт, кисломолочный бифидопродукт, кисломолочный продукт с ацидофильной палочкой); жидкие закваски на стерильном молоке;

КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Закваски – чистые культуры или смесь чистых культур молочнокислых бактерий, вносимые в молоко с целью получения высококачественных кисломолочных продуктов. Закваски используются также в производстве маргарина.
На заводах и в лабораториях по производству бактериальных препаратов выпускают жидкие и сухие бактериальные концентраты, а также маточные закваски в виде сухих и жидких заквасок. Эти бактериальные препараты высылают на предприятия, где путем последовательного их пересева в возрастающие объемы молока, получают лабораторные закваски (при культивировании микрофлоры бактериальных препаратов на стерильном молоке) и, далее, производственные закваски (путем пересева лабораторной закваски на стерильное или пастеризованное молоко). Производственные закваски используют в производстве кисломолочных продуктов.

Производственные закваски на предприятии получают в отделениях чистых культур или в специальном боксе при микробиологической лаборатории предприятия. В этих помещениях необходимо поддерживать асептические условия. Не допускается одновременно проводить посевы по контролю готовой продукции, контролю условий производства и готовить закваски. Нельзя применять закваски и бактериальные концентраты с истекшим сроком хранения. Флаконы с заквасками вскрывают непосредственно перед употреблением и используют все содержимое флакона сразу.

Морфологические свойства некоторых бактерий,

входящих в состав микрофлоры заквасок
Молочнокислые стрептококки

Представляют собой шаровидные или овальные клетки размером до 1-2 мкм в диаметре, располагающиеся короткими цепочками или попарно. Молочнокислые стрептококки неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму окрашиваются положительно. Клетки ароматобразующих стрептококков (Streptococcus diacetylactis, Streptococcus acetoinicus) мельче, чем клетки молочного и сливочного стрептококков (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris), а клетки термофильного стрептококка (Streptococcus thermophilus) самые крупные.

К гомоферментативным относятся молочный и сливочный стрептококки, а к гетероферментативным – ароматические стрептококки.

Промежуточное положение между гомоферментативными и гетероферментативными молочнокислыми стрептококками занимает термофильный стрептококк, поэтому его иногда называют среднегетерогенным видом.

Рис. 13 Молочнокислые стрептококки:

а – молочный стрептококк; б – сливочный стрептококк; в – термофильный стрептококк

Молочнокислые палочки

Лактобактерии представляют собой палочки, одиночные, соединенные попарно и цепочками размером (4…10х0,5…0,6) мкм. Они неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму красятся положительно.

Молочнокислые палочки относятся к роду Lactobacillus, включающему три подрода: термобактерии, стрептобактерии и бета-бактерии. Термо- и стрептобактерии являются гомоферментативными, а бета-бактерии - гетероферментативными молочнокислыми палочками. К термобактериям относятся 8 видов палочек, наиболее известными из которых являются Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus. Подрод стрептобактерий включает 7 видов, среди которых в молочной промышленности используются Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum. В подрод бета-бактерий входят 11 видов палочек, наиболее изученными из которых являются Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum.

Клетки стрептобактерий мельче, чем клетки термобактерий, и часто располагаются в виде цепочек. Бета-бактерии имеют наиболее мелкие и тонкие клетки.

Рис. 14 Молочнокислые палочки:

а – болгарская палочка; б – ацидофильная палочка; в – сырная палочка
7.1.2 Характеристика микрофлоры некоторых кисломолочных продуктов
Кефир готовится с использованием естественной симбиотической закваски – кефирного грибка. Кефирные грибки – прочное симбиотическое образование. Они имеют всегда определенную структуру и передают свои свойства и структуру последующим поколениям. Они имеют неправильную форму, сильноскладчатую или бугристую поверхность, консистенция их упругая, мягко-хрящеватая, размеры от 1-2 мм до 3-6 см и более. В состав кефирного грибка входят ряд молочнокислых бактерий: мезофильные молочнокислые стрептококки видов Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris; ароматобразующие бактерии видов Streptococcus diacetylactis, Leuconostoc dextranicum; молочнокислые палочки рода Lactobacillus; уксуснокислые бактерии; дрожжи. При микроскопировании срезов кефирного грибка обнаруживаются тесные переплетения палочковидных нитей, которые образуют строму грибка, удерживающую остальные микроорганизмы.

Процесс сквашивания и созревания кефира ведут при температуре 20-22⁰С в течение 10-12 часов.

Творог, сметана. При приготовлении этих продуктов процесс сквашивания молока проводят при температуре 30⁰С в течение 6-8 часов. В состав микрофлоры этих продуктов входят гомоферментативные стрептококки: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris; гетероферментативные ароматобразующие стрептококки: Streptococcus diacetylactis, Streptococcus acetoinicus и ароматобразующие лейконостоки вида Leuconostoc dextranicum. Гомоферментативные молочнокислые стрептококки и гетероферментативный ароматический стрептококк Streptococcus diacetylactis входят также в состав микрофлоры закваски для маргарина.

Сметану Любительскую, молочно-белковую пасту «Здоровье», творог, вырабатываемый ускоренным методом, а также напитки пониженной жирности с плодово-ягодными наполнителями готовят с использованием мезофильных и термофильные стрептококков. Мезофильные стрептококки осуществляют активное течение молочнокислого процесса и участвуют в обеспечении влагоудерживающей способности сгустка. Основной функцией термофильных стрептококков является обеспечение необходимой вязкости сгустка, способности его к удерживанию сыворотки и восстановление структуры после перемешивания. Сквашивание молока в этом случае ведут при температурах 35-38⁰С в течение 6-7 часов.

Йогурт, простоквашу Южную, ряженку и варенец готовят с использованием термофильных молочнокислых бактерий. Процесс сквашивания ведут при температуре 40-45⁰С в течение 3-5 часов. В состав микрофлоры йогурта и простокваши Южная входят термофильный стрептококк (Streptococcus thermophilus) и болгарская палочка (Lactobacillus bulgaricus) в соотношении 4:1…5:1. Применяют также симбиотическую закваску этих микроорганизмов. В производстве ряженки и варенца используют закваску термофильного молочнокислого стрептококка в количестве 3-5%. Иногда добавляют болгарскую палочку.

Продукты лечебно-профилактического назначения. К ним относятся: ацидофильное молоко, ацидофилин, ацидофильно-дрожжевое молоко, ацидофильная паста, детские ацидофильные смеси, кисломолочные продукты с использованием бифидобактерий. Использование бактерий рода Lactobacillus acidophilus в производстве продуктов детского и диетического питания обусловлено наличием у них способности выделять специфические антибиотические вещества, подавляющие рост бактерий группы кишечной палочки, дизентерийной палочки, сальмонелл, коагулазоположительных стафилококков и др. Бактерицидные свойства ацидофильной палочки усиливаются в присутствии молочной кислоты. Основным пороком кисломолочных продуктов с использованием ацидофильных палочек является перекисание продукта. Это происходит в том случае, когда не проводят быстрого охлаждения продукта. Продукты, обогащенные бифидобактериями, характеризуются высокими диетическими свойствами, так как содержат ряд биологически активных соединений: свободные аминокислоты, летучие жирные кислоты, ферменты, антибиотические вещества, микро- и макроэлементы.

Определение наличия посторонних микроорганизмов в заквасках

и в кисломолочных продуктах
Контроль качества заквасок. Качество лабораторной и производственной заквасок на стерилизованном молоке контролируют по активность (предельной кислотности и продолжительности свертывания молока). В случае ее снижения проверяют чистоту закваски путем микроскопирования.

Качество производственной закваски на пастеризованном молоке контролируют по активности, микроскопическому препарату, кислотности, наличию БГКП и органолептическим свойствам сгустка. БГКП не допускаются в 10 см³ закваски.

Контроль кефирных грибковой и культуральной заквасок проводят по кислотности, наличию БГКП и микроскопическому препарату. В кефирных культуральных заквасках БГКП не допускаются в 3 см³.

Контроль чистоты закваски по микроскопическому препарату включает приготовление фиксированного препарата из закваски, окраски его краской Муромцева и микроскопирование его с объективом х90 в 10 полях зрения. При этом обращают внимание на наличие посторонних микроорганизмов, содержание которых в заквасках не допускается.

Наличие посторонних микроорганизмов в заквасках можно определить и посевом жидких заквасок на питательные среды.

Так, споровые формы бактерии определяют посевом заквасок, выдержанных при 85 ⁰С в течение 10 минут, в стерильное молоко с добавлением парафина для выращивания в анаэробных условиях и без парафина – для культивирования споровых форм бактерий в аэробных условиях. Если после культивирования при 30 ⁰С в течение 2-х суток в пробирках с парафином парафиновая пробка поднимается, а молоко пептонизируется, то это указывает на наличие в заквасках анаэробных споровых палочек рода Clostridium.

Наличие грибов и дрожжей определяют путем посева разведений закваски в чашки Петри с суслом-агаром или средой Сабуро с последующим культивированием при 24…26 ⁰С в течение 3-5 суток.

Уксуснокислые бактерии определяют методом предельных разведений путем засева соответствующих разведений в стерильное обезжиренное молоко и термостатирования посевов при температуре 30⁰С в течение 3-5 суток. Учет результатов проводят по желтому кольцу, образующемуся на поверхности свернувшегося молока.

Микробиологический контроль производства кисломолочных продуктов заключается в проведении контроля технологического процесса, санитарно-гигиенического контроля условий производства и готовой продукции.

При контроле технологии проверяют эффективность пастеризации молока не реже 1 раза в 10 дней.

Особое внимание уделяют контролю качества заквасок на наличие бактерий группы кишечной палочки, отбирая пробы из трубопровода при подаче закваски в ванну. Исследуют также смесь после заквашивания и сквашивания. В последнем случае пробы отбирают из ванны, резервуара или бутылки при термостатном способе производства. Определяют наличие БГКП, которые не должны содержаться в 1 см³.

Контроль технологических процессов производства кисломолочных продуктов проводят один раз в месяц.

Готовую продукцию контролируют на наличие БГКП, а при необходимости – по микроскопическому препарату не реже одного раза в 5 дней. БГКП не допускаются в 0,1 см³ кефира, простокваши, йогурта, ацидофильно-дрожжевого молока и других кисломолочных напитков. В сметане 20%-ой и 25%-ой жирности БГКП не должны обнаруживаться в 0,01 см³, в твороге – в 0,001 г. В твороге нормируется также содержание золотистого стафилококка (не допускаются в 0,01 г). Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы не допускаются в 25 см³ (г) всех видов кисломолочных продуктов.

При ухудшении микробиологических показателей готового продукта проводят дополнительный контроль технологических процессов для установления причин, влияющих на качество продукта.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Студенты знакомятся с микрофлорой представленных к исследованию заквасок и кисломолочных продуктов (кефира, сметаны, творога, йогурта, варенца, ряженки и др.), готовят фиксированные из них мазки, окрашивают их краской Муромцева (см разд. 2.2.3) и микроскопируют с использованием иммерсионного объектива (х90) в 10 полях зрения.

Оформление и анализ результатов исследований
Студенты конспектируют теоретический материал. Рассматривают анализируемые продукты под микроскопом. При этом обращают внимание на качественный состав полезной микрофлоры и наличие посторонних микроорганизмов. Микроскопическую картину зарисовывают и под каждым рисунком делают вывод о качестве исследованного образца.
Контрольные вопросы

Какими морфологическими признаками характеризуются молочнокислые стрептококки?
Что такое закваски? Из чего готовятся производственные закваски на молочных предприятиях?
Какими морфологическими признаками характеризуются молочнокислые палочки?
Перечислите группы кисломолочных продуктов в зависимости от состава микрофлоры заквасок.
Охарактеризуйте микрофлору продуктов, приготовляемых с использованием многокомпонентных заквасок. Какие это продукты?
Какие кисломолочные продукты получают с использованием мезофильных молочнокислых стрептококков? При какой температуре проводят сквашивание таких продуктов?
Какие продукты готовят с использованием ацидофильных палочек и бифидобактерий? В чем ценность этих продуктов?
Какие микроорганизмы входят в состав микрофлоры йогурта, ряженки, варенца?
Как осуществляют контроль наличия в заквасках и кисломолочных продуктах посторонних микроорганизмов путем микроскопии.
Какие микробиологические показатели определяют при контроле качества заквасок и кисломолочных продуктов?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №8

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ДРОЖЖЕЙ

Цель работы: Ознакомиться с основными морфологическими, физиологическими и производственно-ценными свойствами культурных дрожжей. Изучить технически вредную микрофлору, сопутствующую производственным дрожжам. Освоить микробиологические методы контроля качества производственных дрожжей, применяемых в хлебопечении и бродильных производствах. Научиться определять концентрацию дрожжевых клеток в дрожжевой суспензии с помощью счетной камеры Горяева.
Оборудование и материалы: Микроскоп; бактериологические петли; предметные и покровные стекла; счетная камера Горяева; фильтровальная бумага; 96 % этиловый спирт; лоток с рельсами; промывалка.

Красители: метиленовая синь (1:40), синька Финка (раствор метиленовой сини 1:5000), карболовый фуксин Циля, 0,5 % спиртовый раствор йода; 5% раствор H₂SO₄; набор красок для окраски по методу Грама (бумажки, пропитанные генцианвиолетом, раствор Люголя; фуксин рабочий).

Водная суспензия производственных дрожжей, чистые культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsbergensis в пробирках на скошенном сусло-агаре.
8.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
8.1.1 Характеристика дрожжей, используемых в хлебопечении

и в бродильных производствах
Дрожжи, используемые в хлебопечении и в бродильных производствах, относятся к семейству сахаромицетов, роду Saccharomyces.

Дрожжи-сахаромицеты имеют овальную форму (см. рис. 6а), размножаются в производственных условиях почкованием, а в неблагоприятных условиях – аскоспорами.

Температурный оптимум для размножения дрожжей находится в пределах 25…30 ⁰С. Низкие температуры дрожжи переносят хорошо, хотя размножение их приостанавливается (минимальная температура развития дрожжей 2…3 ⁰С). При температуре 40 ⁰С рост и развитие дрожжей прекращается, дрожжи отмирают.

Культурные дрожжи относятся к ацидофилам, т. е. развиваются в кислой среде, оптимальное значение рН для дрожжей 4,5…5,0. Являются факультативными анаэробами. В аэробных условиях они активно растут и размножаются, а в анаэробных – осуществляют спиртовое брожение (эффект Пастера).

Дрожжи чувствительны к высокой концентрации растворенных в среде веществ. При высокой концентрации сахара в среде жизнедеятельность дрожжей прекращается, так как при этом увеличивается осмотическое давление среды и наступает плазмолиз клеток. Величина предельной концентрации сахара для различных рас дрожжей неодинакова.

Различают дрожжи верхового и низового брожения. Дрожжи верхового брожения в стадии интенсивного брожения распределяются на поверхности сбраживаемой среды в виде довольно толстого слоя пены и остаются в таком состоянии до окончания брожения. К таким дрожжам относятся спиртовые и хлебопекарные дрожжи. Дрожжи низового брожения, развиваясь в сбраживаемой жидкости, не переходят в поверхностный слой – пену, быстро оседают по окончании брожения, образуя плотный слой на дне бродильной емкости. К дрожжам низового брожения относятся пивные дрожжи. Такие различия при сбраживании жидких сред дрожжами верхового брожения и дрожжами низового брожения обусловлены тем, что дрожжи верхового брожения принадлежат к пылевидным дрожжам, не склеивающимися друг с другом, а дрожжи низового брожения относятся к хлопьевидным дрожжам, так как имеют клейкие оболочки, что приводит к агглютинации и быстрому осаждению клеток.

Кроме общих свойств, дрожжи, используемые в том или ином производстве, обладают специфическими свойствами. Более того, в одном и том же производстве применяют разновидности, различающиеся по одной или нескольким технологическим особенностям. Разновидности дрожжей одного вида называют расами. Каждое производство располагает несколькими расами дрожжей. Основными технологическими особенностями различных рас являются величина клеток, способность сбраживать и утилизировать различные сахара.

Дрожжи, используемые в хлебопекарном производстве

Роль дрожжей в хлебопекарном производстве заключается в разрыхлении теста. Дрожжи сбраживают сахара муки и мальтозу, образующуюся из крахмала с выделением спирта и углекислого газа. При этом образуются побочные продукты (уксусный альдегид, бутиловый, изобутиловый, изоамиловый спирты, органические кислоты, ароматические вещества – диацетил и ацетоин, эфиры и др.), которые создают вкус и аромат хлеба.

При производстве пшеничного хлеба применяют дрожжи Saccharomyces cerevisiae, а при производстве ржаного хлеба _ дрожжи двух видов Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces minor, причем преобладают дрожжи второго вида. Дрожжи Saccharomyces minor отличаются более высокой кислотоустойчивостью, чем дрожжи первого вида, менее требовательны к источникам витаминного и азотного питания, более спиртоустойчивы.

Требования, предъявляемые к хлебопекарным дрожжам:

Должны быть устойчивы к высоким концентрациям соли (до 3 – 4 %) и сахара в тесте;
Должны хорошо размножаться при оптимальных значениях рН 4,5…5,0 и температуре 26…28 ⁰С;
Должны обладать высокой бродильной энергией (мальтазной и зимазной активностью). Мальтазная активность – это время (в мин), необходимое для выделения 10 см³ СО₂ при сбраживании 10…20 см³мальтозы при 30 ⁰С дрожжами, взятыми в количестве 2,5 % к объему среды. Мальтазная активность характеризует способность дрожжей гидролизовать мальтозу муки и зависит от активности содержащегося в дрожжах фермента мальтазы. Мальтазная активность дрожжей хорошего качества должна быть не более 100 мин. Зимазная активность - это время (в мин), необходимое для выделения 10 см³ СО₂ при сбраживании 10…20 см³глюкозы при 30 ⁰С дрожжами, взятыми в количестве 2,5 % к объему среды. Зимазная активность дрожжей хорошего качества должна быть не более 60 мин. О бродильной активности хлебопекарных дрожжей можно также судить по их подъемной силе – периоду времени (в мин), в течение которого тесто, замешанное на испытуемых дрожжах, поднимается до определенного уровня в формочке. Все эти показатели относятся к технологическим показателям качества хлебопекарных дрожжей;
Должны быть стойкими к инфицированию при хранении в прессованном виде и в высушенном состоянии.

Дрожжи, используемые в бродильных производствах

Пивные дрожжи относятся к двум видам: Saccharomyces cerevisiae и Saccharomyces carlsbergensis.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются дрожжами верхового брожения и в пивоварении используются редко, в основном для темных и специальных сортов пива. Эти дрожжи в производственных условиях сбраживают сусло при 12…15 ⁰С.

Дрожжи Saccharomyces carlsbergensis относятся к дрожжам низового брожения и в производстве осуществляют главное брожение при 5…10 ⁰С. Они нашли широкое применение в пивоваренном производстве и используются для приготовления стандартного и сортового пива.

Требования, предъявляемые к пивным дрожжам:

Должны обладать высокой бродильной активностью. Бродильная активность определяется степенью сбраживания сусла, т.е. отношением массы сброженного экстракта к массе сухих веществ (СВ) в начальном сусле;
Должны обладать флокуляционной способностью, т.е. способностью медленно и полно оседать на дно бродильных аппаратов в конце главного брожения;
Должны иметь умеренную способность к размножению. Очень активное размножение дрожжей нежелательно, т.к. при этом расходуются экстрактивные вещества сусла и образуется большое количество побочных продуктов. В среднем в процессе брожения биомасса дрожжей увеличивается в 3…4 раза;
Должны быть стойкими к неблагоприятным условиям и инфицированию;
Должны обладать стойкостью морфологических и физиологических свойств;
Должны придавать пиву характерный вкус и аромат.

Спиртовые дрожжи. В спиртовом производстве применяют дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae. Основными требованиями, предъявляемыми к расам дрожжей при производстве спирта являются:

Высокая бродильная активность. Спиртовые дрожжи должны образовывать максимум спирта;
Способность сбраживать как моносахара, так и дисахариды и некоторые декстрины;
Способность сбраживать растворы, содержащие довольно большие концентрации сахара;
Высокая кислотоустойчивость;
Способность осуществлять спиртовое брожение при высоком содержании спирта в растворе.

8.1.2 Микрофлора производственных дрожжей
Культурные дрожжи должны быть стойкими к инфицированию. Тем не менее, посторонние микроорганизмы попадают в засевные производственные дрожжи при неправильном ведении технологического процесса, при недостаточно тщательной мойке и дезинфекции оборудования и коммуникаций, несоблюдении санитарного режима в отделении чистых культур и т.д.
Чаще всего производственным дрожжам сопутствуют молочнокислые, уксуснокислые бактерии и дикие дрожжи, которые, так же как и культурные дрожжи, используют сахара питательной среды в качестве основного источника питания, что снижает выход спирта. Эти микроорганизмы образуют органические кислоты и другие продукты, которые могут отрицательно влиять на органолептические показатели готовой продукции (хлеба, пива) и бродильную активность культурных дрожжей. Хлебопекарные дрожжи, инфицированные посторонними микроорганизмами, имеют низкую ферментативную активность и стойкость.

Молочнокислые бактерии чаще других микроорганизмов встречаются в производственных дрожжах. Они принадлежат к трем родам: Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Стрептококки и лейконостоки имеют шаровидную форму клеток. Стрептококки располагаются друг относительно друга попарно, короткими и длинными цепочками, а лейконостоки в основном попарно. Отличием этих двух родов друг от друга является то, что лейконостоки в отличие от стрептококков образуют слизистые капсулы. Лактобациллы являются палочковидными бактериями, которые в зависимости от вида могут располагаться поодиночке или короткими цепочками. Общими признаками этих бактерий являются грамположительная окраска, отсутствие спорообразования, каталазу они не образуют, не восстанавливают нитраты в нитриты, являются факультативными анаэробами. Молочнокислые стрептококки хорошо развиваются в средах, содержащих 3…6 % спирта, а палочковидные формы молочнокислых бактерий не теряют своей активности даже при 10…12 % спирта.

Уксуснокислые бактерии относятся к двум родам Acetobacter и Gluconobacter. В производстве пива чаще всего встречаются бактерии вида A. аceti. Для этих бактерий характерна чрезвычайная изменчивость формы клеток – от эллиптических до палочковидных, прямых или слегка изогнутых. Грамотрицательные, спор не образуют, некоторые виды имеют слизистую капсулу. При росте в жидкой среде образуют пленки беловатого или сероватого цвета. Реакция на каталазу положительная. Аэробы. Оптимальное значение рН 5,4-6,3, но могут расти и при рН 4,0-4,5. Эти бактерии устойчивы к антисептическим веществам хмеля, высокой кислотности, толерантны к спирту. Некоторые виды выделяют соединения, токсичные для дрожжей.