Занятие № тема: Методы выделения ядовитых веществ („лекарственных ядов) из биологического материала пораженных животных полярными растворителями

Открытие диазепама

1. Реакция с нингидрином. Эту реакцию на диазепам выполняют так же, как и на хлордиазепоксид. В отличие от хлордиазепоксида, нингидрин с диазепамом дает красный или оранжево-красный цвет, а хлордиазепоксид за тех же условий дает коричневый цвет.

2. Открытие диазепама с помощью метода хроматографии. Для открытия диазепама применяют метод хроматографии в тонком слое силикагеля КСК так же, как и для открытия хлордиазепоксида.

3. Открытие диазепама по УФ- и ИК-спектрам. Диазепам в 2 моль/л растворе сульфатной кислоты диазепам имеет максимумы поглощения при 241, 284 и 359 нм. В ИК-области спектра диазепам (диск с калий бромидом) имеет основные пики при 1681, 1484 и 1313см^-1.

4. Открытие диазепама в крови и мочи.

Методика выполнения реакции. К 10 мл мочи или 5 мл крови прибавляют такой же объем фосфатного буферного раствора (рН = 7). Полученную жидкость 2 раза по 5 мин. взбалтывают с новыми порциями диэтилового эфира (объем диэтилового эфира должен равняться объему водной фазы). Эфирные извлечения объединяют и дважды взбалтывают с 0,1 моль/л раствором натрий гидроксида (по 2 мл), а потом с 2 мл воды. После отделения водной фазы эфирное извлечение взбалтывают с 3 мл 2 моль/л раствора хлоридной кислоты на протяжении 10 мин., а потом от эфирного слоя отделяют хлорнокислое извлечение. Оптическую плотность этого извлечения измеряют в диапазоне длины волн от 200 до 300 нм. Параллельно измеряют оптическую плотность стандартного диазепама, который прошел все стадии обработки, которой испытал исследуемый препарат в процессе выделения его из крови или мочи.

Наличие максимумов поглощения при 242 и 287 нм свидетельствует о том, что в крови или мочи содержится диазепам.

Открытие нитразепама

1. Реакция диазотирования. Эту реакцию на нитразепам выполняют так же, как и на хлордиазепоксид.

2. Реакция с нингидрином. Реакцию нитразепама с нингидрином выполняют так же, как и на хлордиазепоксид, тем не менее, вследствие реакции нитразепама с этим реактивом образуется желто-коричневый цвет, тогда как хлордиазепоксид дает коричневый, а диазепам - красный или оранжево-красный цвет.

3. Метод хроматографии. Для открытия нитразепама применяют метод хроматографии в тонком слое силикагеля. Хроматографирование проводят с помощью системы растворителей, которая состоит из этилацетата, метилового спирта и 25 %-го раствора аммиака (85:10:5). Пятна нитразепама на хроматографической пластинке проявляют с помощью реактива Драгендорфа, модифицированного за Мунье. Этим методом открывают и метаболиты нитразепама.

4. Открытие нитразепама по ИК- и УФ-спектрам. Раствор нитразепама в этиловом спирте имеет максимумы поглощения при 218 и 260 нм. Нитразепам в 0,05 моль/л растворе сульфатной кислоты имеет максимум поглощения при 277 и изгиб возле 340 нм. В ИК-области спектра нитразепам (диск с калий бромидом) имеет основные пики при 1692, 1615, 1352 и 702 см^-1.

Открытие оксазепама

1. Реакция диазотирования.

Методика выполнения реакции. 25-30 мл эфирного извлечения выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл 6 моль/л раствора хлоридной кислоты и фильтруют. 1 мл фильтрата вносят в колбу вместительностью 25 мл и кипятят на протяжении 5-10 мин. Жидкость в колбе оставляют до охлаждения. После этого к жидкости в колбе прибавляют 3 мл 1 %-го раствора натрий нитрита. Охлаждают в холодильнике или в ледяной воде на протяжении 15 мин. Потом прибавляют 0,5 мл 10 %-го раствора мочевины, а через 15 мин. - 1 мл спиртового раствора 1-нафтола и 1 мл 20 %-го раствора натрий гидроксида. При наличии оксазепама в моче или крови появляется красный цвет.

2. Открытие оксазепама методом хроматографии. 5-10 мл эфирного извлечения, выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилового спирта. Каплю полученного раствора наносят на хроматографическую пластинку. Для хроматографирования используют систему растворителей, которая состоит из хлороформа, пропилового спирта и ацетона (9:4:1). Для открытия пятен оксазепама на хроматографических пластинках применяют насыщенный раствор натрий тиосульфата. Тогда, когда в исследуемом эфирном извлечении находится оксазепам, его пятна окрашиваются в оранжевый или желтый цвет.

3. Открытие оксазепама по УФ- и ИК-спектрам. Растворы оксазепама в этиловом спирте имеют максимумы поглощения при 230 и 315 нм. В ИК-области спектра оксазепам (диск с калий бромидом) имеет основные пики при 1706, 1687, 830 и 693 см^-1.
Экспресс-анализ острых интоксикаций

Большое значение для составления плана химико-токсикологического анализа имеют данные обзора объектов исследования, а также результаты выполнения предварительных проб. На основе результатов предварительных проб можно исключить ряд веществ из плана химико-токсикологического анализа и предусмотреть, какие вещества могут присутствовать в биологическом материале. При положительном результате предварительных проб на определенные вещества, исследование этих веществ включается в план анализа. При отрицательном результате предварительных проб на соответствующие вещества дальнейшее исследование их не проводят и не включают в план химико-токсикологического анализа.

Предварительная проба для открытия барбитуратов в моче. В делительную воронку вносят 50 мл мочи, к которой по каплям прибавляют 10 % раствор сульфатной кислоты до рН = 4,5 и 50 мл диэтилового эфира. Содержимое делительной воронки взбалтывают. После разделения фаз отделяют эфирное извлечение. Водную фазу еще раз взбалтывают с 50 мл диэтилового эфира. Эфирные извлечения объединяют и испаряют насухо. Сухой остаток растворяют в 1 мл хлороформа. К хлороформному раствору прибавляют 2 капли свежеприготовленного 1 % раствора гидроксида лития в метиловом спирте. Появление голубого цвета указывает на наличие барбитуратов в моче.

Предварительная проба на наличие хлордиазепоксида в крови. От 5 до 10 мл плазмы крови или мочи подщелачивают аммиаком и дважды взбалтывают с хлороформом по 10 мл. Объединенные хлороформные извлечения взбалтывают с 2 мл воды. Водную фазу отделяют, а хлороформный слой взбалтывают с 5 мл 6 моль/л раствора хлоридной кислоты на протяжении 5 мин. Водные хлоридные извлечения отделяют от хлороформа, нагревают на водном нагревателе, а потом эти извлечения нагревают при 125 °С на парафиновом нагревателе на протяжении 30 мин. (при этом образуется 5-хлорбензофенон). К охлажденной жидкости прибавляют 0,5 мл 10 % раствора нитрата натрия и оставляют на 3 мин. Потом прибавляют 0,5 мл 0,5 % раствора сульфамината аммония и оставляют на 3 мин. После этого прибавляют 0,5 мл 0,1 % раствора N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорида. При наличии хлордиазепоксида в крови или мочи появляется вишнево-красный цвет.

Предварительная проба на наличие нитразепама в моче. Нитразепам можно открыть в моче в несмененном виде в виде 7-амино- и ацетиламино-производных, которые являются метаболитами этого препарата: 5 мл мочи подщелачивают аммиаком до рН - 10 и прибавляют 2,5 г дитионита натрия. Смесь взбалтывают на протяжении 10 мин, а потом нагревают при 50 °С в продолжение часа и охлаждают. Охлажденную жидкость 10 мин взбалтывают с 10 мл смеси, которая состоит из равных объемов метиленхлорида и этилацетата. После этого от водной фазы отделяют слой смеси органических растворителей и взбалтывают его с 10 мл 5 % раствора буры. Водную фазу отделяют от фазы органических растворителей. К фазе органических растворителей прибавляют 5 мл 0,2 моль/л раствора хлоридной кислоты и взбалтывают. После этого отделяют фазу органических растворителей. 4 мл кислой водной фазы охлаждают и прибавляют 0,2 мл 0,4 моль/л раствора нитрита натрия. Через 5 мин к кислому раствору прибавляют 0,2 мл 2 % раствора сульфамината аммония. Жидкость хорошо перемешивают и оставляют на 5 мин, а потом прибавляют 0,2 мл 0,4 % раствора N-1-нафтилетилэндиамина дигидрохлорида. При наличии нитразепама в моче появляется вишнево-красный цвет (λ = 555 нм).

Предварительные пробы на наличие салициловой кислоты в моче и крови.

1. К 1 мл мочи прибавляют 2-3 капли реактива Триндлера. Появление пурпурового цвета указывает на наличие салициловой кислоты в моче.

2. К 0,5 мл мочи или плазмы крови прибавляют 4,5 мл 0,55 % раствора нитрата железа (ІІІ) в 0,04 моль/л растворе нитратной кислоты. Появление пурпурового цвета указывает на наличие салициловой кислоты в исследуемых объектах.

3. К 1 мл мочи (крови) прибавляют 3 капли 5 % раствора FеСl₃ - образуется фиолетовый цвет.

Предварительная проба на наличие аминазина в моче.

1. К 1 мл мочи прибавляют 1 мл реактива, который состоит из 80 мл 10 % раствора сульфатной кислоты и 20 мл 5 % раствора феррум (ІІІ) хлорида. При наличии аминазина и других производных фенотиазина в моче раствор окрашивается в розово-лиловый цвет.

2. К 1 мл мочи прибавляют 1 мл реактива ФПН. Появление розового цвета указывает на наличие аминазина или других производных фенотиазина в моче.

Предварительная проба на наличие этанола.

К 1 мл мочи (крови) прибавляют 1 мл 10 % раствора К₂Сr₂О₇ в 50 % растворе H₂SO₄ - образуется зеленый цвет.

Изолирование ядовитых веществ из биологических жидкостей организма проводят методом экстракции органическими растворителями из кислой или щелочной среды в зависимости от природы яда, в присутствии высаливателей.

Выделение производных 1,4-бензодиазепина из крови при направленном методе анализа. К 2 мл крови прибавляют 2 мл 2 моль/л хлоридной кислоты и нагревают на водном нагревателе в мерной пробирке с обратным холодильником в течение 1 часа. После охлаждения к гидролизату прибавляют насыщенный раствор гидроксида натрия до рН 8-10 и экстрагируют хлороформом два раза по 5 мл. Органический слой отделяют и делят на две части. Одну часть упаривают до 0,3 мл и используют для открытия с помощью реакций идентификации и метода хроматографии в тонком слое сорбента.

Открытие производных 1,4-бензодиазепина с помощью метода хроматографии в тонком слое сорбента (при направленном анализе).

На хроматографическую пластинку «Силуфол» наносят экстракты из гидролизатов крови, а также бензофеноны свидетеля. Подсушенную на воздухе пластинку хроматографируют в камере насыщенной парами бензола. Проявляют пластинку по реакции диазотирования и азосоединения: опрыскивают последовательно 0,1 % раствором нитрита натрия, 2 моль/л раствором хлоридной кислоты, через 1 мин. - 0,5 % раствором сульфамината аммония и 0,1 % щелочным раствором β-нафтола.

Другу часть извлечения используют для количественного определения. Для этого извлечение упаривают досуха, растворяют в 3 мл води и прибавляют 1 мл 0,1 % раствора нитрита натрия. Через 5 мин прибавляют 0,5 мл 1 % раствора сульфамината аммония. Раствор встряхивают в течение 5 мин, а потом прибавляют 1 мл 0,1 % щелочного раствора β-нафтола. Через 15 мин измеряют оптическую плотность раствора (кювета 10 мм, светофильтр зеленый).

Выделение производных фенотиазина из крови. 5 мл крови вносят в стакан вместительностью 100 мл, прибавляют 20 мл 30 % раствора ацетатной кислоты и оставляют на 2 часа. Потом 30 % раствором гидроксида натрия доводят рН до 5-6. От добавления основания выпадает осадок, который отцентрифугируют. Центрифугат сливают, а осадок настаивают с 20 мл 30 % раствора ацетатной кислоты на протяжении 20 мин. Потом прибавляют раствор гидроксида натрия до рН 5-6 и снова центрифугируют. Объединенные центрифугаты вносят в делительную воронку и два разы экстрагируют хлороформом (по 10 мл). Хлороформ упаривают и извлечение используют для исследования (подтверждение результатов предварительных проб).

Анализ полученных вытяжек из крови и мочи на наличие указанных групп веществ проводят с помощью осадочных и цветных реакции как указаны в соответствующих методических указаниях.

Количественное определение производных фенотиазина. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл 0,2 моль/л раствора хлоридной кислоты. Потом еще 2 раза промывают по 0,5 мл 0,2 моль/л раствора хлоридной кислоты. К 1,5 мл исследуемого раствора, который содержит от 20 до 100 мкг/мл производных фенотиазина прибавляют при охлаждении водой и перемешивании смеси 0,5 мл 1 моль/л раствора мышьяковой кислоты и 1,5 мл концентрированной хлоридной кислоты. Реакционную смесь нагревают на протяжении 10 мин. на водном нагревателе при температуре 37 °С, потом охлаждают до комнатной температуры. Общий объем доводят до 5 мл 0,2 моль/л раствором хлоридной кислоты. Определяют оптическую плотность раствора на ФЭК (кювета 10 мм, светофильтр - зеленый).

Открытие производных барбитуровой кислоты в вытяжках из биологических жидкостей организма с помощью метода хроматографии в тонком слое сорбента проводят так, как представлено в методическом указании № 5.

Анализ производных барбитуровой кислоты в биологических жидкостях методом ГРХ. Условия хроматографирования: прибор "Цвет-100" с пламенно-ионизационным детектором. Колонка стеклянная, при ее отсутствии -металлическая, диаметром 3 мм, длиной 1 м, заполненная 3 % C₂F - и на суперкопорте 80-100 меш. Температура испарителя 200 °С. Температура колонки 180 °С. Газ-носитель: азот, скорость потока 24 мл/мин.

Подготовка пробы на анализ: 2 мл исследуемой биологической жидкости подкисляют 0,5 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты и после добавления 2,5 г безводного сульфата натрия экстрагируют в делильной воронке 15 мл диэтилового эфира. Эфирный слой отделяют, растворитель удаляют досуха в ротационном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1 мл хлороформа (ч.д.а.); 2 мкл хлороформного раствора вводят в газовый хроматограф.

Качественный анализ проводят по параметрам удержания относительно ноксирона, а количественный расчет - методом абсолютной калибровки. Стандартные растворы барбитуратов готовят в хлороформе в концентрации 100 мкг/мл.

ИСХОДНЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

Методы изолирования и открытие производных фенотиазина и 1, 4-бензодиазепина.
Методы изолирования веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера.
Условия проведения предварительных и подтверждающих исследований.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

Проводить открытие производных фенотиазина и 1, 4-бензодиазепина в щелочных и кислых вижяках из биологического материала.
Выполнять предварительные пробы для открытия хинина, алкалоидов опия и их синтетических аналогов в биологических жидкостях организма.
Выделять эти ядовитые вещества из крови и мочи.
Открывать их с помощью метода хроматографии в тонком слое сорбента, УФ-спектроскопии, иммунноферментного метода анализа.
Количественно определять эти группы ядов.
Давать оценку результатам анализа.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

Основные: 1. Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия. - М. Высшая школа. 1995.- С.

Приложению: 1. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М. Медицина. 1975. - С. 215-222.

2. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - К. Высшая школа. 1982.- С. 168-170, 173-174, 177-178, 180, 193, 195.

ЗАНЯТИЕ № 12.

ТЕМА: Экспресс-анализ биологических жидкостей (кровь, моча) при острых отравлениях хинином, алкалоидами опия и их синтетическими аналогами.

ЦЕЛЬ: Овладеть методиками выделения хинина, алкалоидов опия и их синтетических аналогов из крови и мочи, открытие и определение их в извлечениях.

ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ ОРИЕНТАЦИЯ СТУДЕНТОВ

Химико-токсикологический анализ биологических жидкостей (кровь, моча, промывные воды желудка, смывы из ротовой полости, рук и др.) живых лиц одно из направлений лабораторного экспресс-анализа при острых интоксикациях. Он должен быть быстрым, чтобы полученные результаты можно было использовать при жизни больного, и чувствительным, чтобы определить яд в крови и мочи на уровне терапевтических доз.

БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

Химические, физико-химические свойства, применение исследуемых соединений (курсы фармацевтической химии, фармакологии).
Фармакокинетика, фармакодинамика токсичных веществ (курс фармакотерапии).
Техника выполнения осадочных, цветных, микрокристаллоскопических реакций и физико-химическое определение этих веществ (аналитическая химия).

ПРОГРАММА САМОПОДГОТОВКИ

Общая характеристика и классификация отравлений.
Основные и дополнительные факторы, которые влияют на развитие отравлений.
Наркомании и токсикомании.
Организация помощи при острых интоксикациях и основные направления детоксикации организма.
Общие принципы диагностики острых отравлений.
Применение хроматографических методов анализа (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ) в экспресс-диагностике острых отравлений.
Применение иммунохимических методов анализа в экспресс-диагностике острых отравлений.
Чуствительность, специфичность и точность иммуноферментного метода анализа.
Экспресс-анализ биологических жидкостей на наличие хинина, кодеина.
Количественное фотоколориметрическое определение морфина, кодеина.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

Мужчину 28 лет в состоянии наркотического опьянения привезли в больницу. Проведите экспресс-анализ биологических жидкостей на морфин и кодеин. Как доказать, что отравление вызвано опием.
В больницу попал мужчина в бессознательном состоянии. Как доказать, что отравление было вызвано хинином.
Вместе с потерпевшим в больницу поступили 185 мл промывных вод желудка. Из обстоятельств дела стало известно, что возле потерпевшей было найдено 2 бутылки из-под кофекса. На какое вещество необходимо провести исследование промывных вод желудка и биологических жидкостей.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ

Предварительная проба на наличие хинина в моче. В делительную воронку вносят 2 мл мочи, которую подщелачивают раствором аммиака, а потом прибавляют 4 мл хлороформа и взбалтывают на протяжении 5 мин. От водной фазы отделяют слой органического растворителя, который взбалтывают с 3 мл 10 % раствора сульфатной кислоты. Синяя флуоресценция водной фазы указывает на наличие хинина в моче. Флуоресценция становится более выраженной, если кислую водную вытяжку облучить УФ-светом.

Предварительная проба на наличие кодеина в моче. В делительную воронку вносят 50 мл мочи, подщелачивают раствором аммиака до рН = 10, прибавляют 50 мл хлороформа и взбалтывают на протяжении 5 мин. Хлороформное извлечение отделяют от водной фазы, вытяжку взбалтывают с 3 мл воды на протяжении 3 мин. Водную фазу отделяют от хлороформа, фильтруют через безводный натрий сульфат и испаряют досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилового спирта. Полученный спиртовый раствор используют для открытия кодеина одним из следующих способов:

а) на фильтровальную бумагу наносят каплю полученного спиртового раствора и прибавляют каплю реактива Марки. При наличии кодеина пятно приобретает красноватый цвет, который переходит в сине-фиолетовый;

б) на фильтровальную бумагу наносят каплю 0,5 % раствора ванадата аммония и каплю 2 % раствора сульфатной кислоты. При наличии кодеина появляется зеленый цвет, который переходит в синий.

Выделение хинина, алкалоидов опия и их синтетических аналогов из биологических жидкостей организма проводят с помощью метода экстракции органическими растворителями из щелочной среды, в зависимости от природы яда и от того анализ направлен или ненапрвленный.

Для подтверждения результатов предварительных проб необходимо провести открытие этих ядовитых веществ в полученных извлечениях из биологических жидкостей организма с помощью метода хроматографии в тонком слое сорбента, метода УФ-спектроскопии, как указано в соответствующих методических указаниях, и алкалоидов опия - иммуноферментного метода анализа.

Открытие алкалоидов опия в моче с помощью иммуноферментного метода анализа.

Открытия проводят с помощью иммуноферментной тест-системы в состав которой входят:

1. Полистероловые планшеты на 96 лунок

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A
B
C
D
E
F
G
H

2. Набор из 10 реагентов (Р):

Р1 - 1 моль/л натрий карбонатный буферный раствор с бактериостатиком, рН 9,6 ± 0,3 (1 ампула, 4 мл)

Р2 - модифицированный морфин для адсорбции на планшете, лиофилизированный (1 ампула)

Р3 - 1,5 моль/л калий фосфатный буферный раствор с бактериостатиком, рН 7,4 ±0,2 (1 ампула)

Р4 - 12,5 % раствор детергента типа твин-20 (1 ампула, 4 мл);

Р5 - положительный контроль (стандарт), 10 мкг морфина в солевом растворе с бактериостатиком (1 флакон, 1 мл);

Р6 - антитела кролика против опиатов, меченные пероксидазой хрона -коньюгат лиофилизированный (1 ампула, 40 ± 10 мкг);

Р7 - 1 моль/л фосфатно-цитратный буферный раствор с бактериостатиком (1 ампула, 1 мл);

Р8 - ортофенилендиамин (2 таблетки, 8 мг);

Р9 - гидроперит (1 таблетка);

Р10 - отрицательный контроль - солевой раствор с бактериостатиком (1 ампула, 1 мл).
Анализ опиатов с помощью ИФА начинают с приготовления растворов.

РАСТВОР 1 - Р1 развести 20 мл дистиллированной воды (сохранять не больше 10 дней при температуре 4-6 °С).

РАСТВОР 2 - Р2 растворить в 20 мл раствора 1 (использовать в продолжение часа).

РАСТВОР 3 – Р3 растворить в 600 мл дистиллированной воды (сохранять не больше 7 дней при температуре 4-6 °С).

РАСТВОР 4 - Р4 растворить в 600 мл раствора 3 и использовать для промывания планшетов (сохранять не больше 7 дней при температуре 4-6 °С).

РАСТВОР 5 - Р5 растворить в 20 мл раствора 4 до концентрации морфина 500 мг/мл (положительный контроль). Используют для приготовления стандартных растворов (СР) в количественном варианте ИФА (сохранять не больше 5 ч при температуре 4-6° С).

РАСТВОР 6 - Р6 растворить в 5 мл раствора 4 (сохранять не больше 24 ч при температуре 4-6 °С).

РАСТВОР 7 - Р7 развести в 21 мл дистиллированной воды (сохранять не больше 10 дней при температуре 4-6 °С).

РАСТВОР 8 - Р8 (одну таблетку) растворить в 21 мл раствора 7, прибавляя 0,05 мл раствора пероксида водорода. Последний готовят путем растворения 1 таблетки Р9 в 50 мл дистиллированной воды. Раствор пероксида водорода пригоден для использования, если при разбавлении его в 15 раз оптическая плотность при длине волны 230 нм будет равна 1,2 ± 0,05.
После получения рабочих растворов приступают к последовательному выполнению отдельных операций ИФА.

1. Адсорбция антигена (модифицированного морфина) на планшете. Промывка планшетов.

Планшеты предварительно обрабатывают этанолом (20 мл на 1 планшет) и высушивают в термостате. Во все лунки вносят по 0,2 мл раствора 2 и ставят планшет в холодильник на 18 ч (при температуре 4-6° С), после чего раствор 2 из лунок удаляют стряхиванием.

2. Промывание планшетов

Во все лунки вносят по 0,2 мл раствора 4 и через 1 мин удаляют раствор стряхиванием, остатки раствора 4 - постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге. Операцию повторяют 3 раза. Промытые планшеты, готовые для проведения ИФА, сохраняют на протяжении 5 дней в холодильнике.

3. Внесение положительного контроля и СР у лунки планшета.

У лунки А1 и В1 вносят по 0,05 мл раствора 5. В лунке А1 - положительный контроль. У лунки, начиная с В1 к Н1, вносят по 0,05 мл раствора 4. Перемешивают содержимое лунки В1, отбирают 0,05 мл раствора и переносят в звонкую С1, перемешивают. Из лунки Д1 переносят 0,05 мл в следующую звонкую и так далее, к лунке Н1, из лунки Н1 0,05 мл раствора удаляют. В каждой лунке, с А1 к Н1, должно быть по 0,05 мл СР с концентрацией морфина 500, 250, 127, 62, 31, 15,5 и 7 мг/мл (для построения калібрувального графика можно приготовить на планшете и второй ряд СР).

4. Внесение анализируемых образцов.

Берут 0,1 мл досліджуваноі мочи и к ней прибавляют 0,9 мл раствора 4, после чего разбавленный в 10 раз образец мочи вносят в 2 лунки (по 0,05 мл в каждую).

5. Внесение отрицательного контроля

Отрицательный контроль (Р10) в количестве 0,1 мл доказывают раствором 4 к объему 10 мл и по 0,05 мл вносят у лунки А11 и А12.

6. Связывание антигена с антителами, меченными пероксидазою хрена.

Во все лунки с растворами вносят по 0,05 мл раствора 6, встряхивают планшет на протяжении 5 мин на шейкері и інкубують в термостате при температуре 37 ± 2° С на протяжении 30 мин.

7. Промывка планшета.

Промывку планшета проводят, как описано выше (пункт 2).

8. Добавление субстрата.

Во все лунки с анализируемыми растворами прибавляют по 0,2 мл раствора 8, приготовленного непосредственно перед его внесением. Смесь выдерживают 10-15 мин. в темном месте при комнатной температуре и останавливают реакцию, прибавляя во все лунки планшета по 0,025 мл 2 моль/л раствора хлоридной или сульфатной кислоты. Добавление кислот для остановки реакции необходимо проводить максимально быстро, чтобы интервал времени между добавлением кислоты в первую и последнюю лунку был минимальным.

9. Оценка результатов анализа

Результаты анализа оценивают визуально, сравнивая окраска лунок стандарта морфина (А 1-Н1) с окраской лунок в исследуемых пробах, или спектрофотометрично при длине волны 492 нм (плейт-фотометр ІФКО-2).

Количество морфина в исследуемых пробах определяют по калібрувальним графику зависимости средней оптической плотности двух-трех параллельных определений от концентрации морфина-стандарта в полулогарифмических координатах. По оси абсцисс откладывают значение С (С - концентрация морфина в мг/мл), по оси ординат - отношение оптической плотности А/А₀ (А - оптическая плотность стандартного раствора, А₀ - оптическая плотность «слепого» опыта при отсутствии морфина).

Данные для построения калібрувального графику заносят в таблицу, как это указано ниже.

Форма записи данных для построения калібрувального графику при ІФА

№ п/п	С, мг/мл	lg	А	А₀	А /А₀
1	500	2,7	0,40	0,88	0,47
2	250
3	125
4	62
5	31
6	15
7	7,5	0,9	0,68	0,88	0,80

Количественное определение морфина. В мерную колбу на 25 мл вносят 5 мл раствора силиката калия, 4 мл воды, 2 мл 0,5 н. раствора хлоридной кислоты, 9 мл кремнемолібденової кислоты. Через 3 мин к смеси прибавляют 2 мл исследуемого раствора и перемешивают. Потом прибавляют 5 мл 6 % раствора аммиака. Жидкость окрашивается в синий цвет. Измеряют оптическую плотность (светофильтр - красный, кювет 10 мм) и по калібрувальним графику определяют количество морфина.

ИСХОДНЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

Физико-химические свойства и идентификацию хинина, алкалоидов опия и их синтетических аналогов в биологических жидкостях организма;
Применение и теоретические основы імуноферментного анализа.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

1. Выполнять предварительные пробы для открытия хинина, алкалоидов опия и их синтетических аналогов в биологических жидкостях организма;

2. Выделять эти ядовитые вещества из крови и мочи;

3. Обнаруживать их с помощью метода хроматографии в тонком слое сорбента, Уф-спектроскопії, імуноферментного метода анализа;.

4. Количественно определять эти группы отрут;

5. Давать оценку результатам анализа.

ИСТОЧНИКА ИНФОРМАЦИИ:

Основные: 1. Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия. - К. Высшая школа. 1995.- С.

Приложению: 1. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - Г. Медицина. 1975. - С. 215-222.

2. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - К. Высшая школа. 1982.- С. 168-170, 173-174, 177-178, 180, 193, 195.

ЗАНЯТИЕ № 13.

ТЕМА: Итоговое занятие по теме: „Лікарські яда „лужної” хлороформной вытяжки. Острые отравления”.

ЦЕЛЬ: Обобщение материала за темой „Лікарські яда „лужної” хлороформной вытяжки. Острые отравления”.

ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ ОРИЕНТАЦИЯ СТУДЕНТОВ

Довольно часто среди отравлений встречаются отравление алкалоидами, большинство из которых принадлежит к наркотическим веществам. Кроме того, на данном этапе развития нашего общества для получения психического и физического комфорта используются также синтетические вещества, которые изготовляются в большинстве случаев кустарно. Это приводит к еще большей токсичности полученных веществ. При передозировке этими веществами может настать смерть вследствие угнетения центра дыхания или разладов со стороны сердечно-сосудистой системы. Поэтому необходимо обобщить и систематизировать материал по исследованию веществ основного характера в биологических жидкостях и трупном материале.

БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

Химические, физико-химические свойства, применение производных 1, 4-бензодиазепина, фенотиазина, п-амінобензойної кислот, ізохіноліну (курсы фармацевтической химии, фармакологии).
Хроматографічні методы аналіза (курс аналитической, физической химии).
Теоретические основы экстракции (курс физической химии и аналитической химии).

ПРОГРАММА САМОПОДГОТОВКИ

Методы изолирования алкалоидов, производных ПАБК, фенотиазина, 1, 4-бензодиазепина.
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, метаболизм, изолирование, открытие производных тропану (атропин, скополамін, кокаин).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, метаболизм, изолирование, открытие производных пиридина и піперидину (никотин, анабазин, коніїн, ареколін, пахікарпін).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, метаболизм, изолирование, открытие производных хинолина (хинин).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, метаболизм, изолирование, открытие производных піразолону (антипирин, анальгин, амідопірин).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, первое помощь, метаболизм, изолирование, открытие производных п-амінобензойної кислоты (новокаин, дикаїн, новокаїнамід).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, первое помощь, метаболизм, изолирование, открытие производных индола (резерпин, бруцин, стрихнин).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, метаболизм, изолирование, открытие производных фенантренізохіноліну (морфин, кодеин).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, первое помощь, метаболизм, изолирование, открытие алкалоидов опия (папаверин).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, первое помощь, метаболизм, изолирование, открытие синтетических аналогов морфина (апоморфін, дионин, героин, промедол).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, первое помощь, метаболизм, изолирование, открытие ациклічних алкалоидов (ефедрин).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, первое помощь, метаболизм, изолирование, открытие производных фенотиазина (тизерцин, дипразин, аміназин).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, первое помощь, метаболизм, изолирование, открытие производных 1,4 бензодиазепина (оксазепам, нітразепам, хлордіазепоксид, діазепам).
Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, метаболизм, изолирование, открытие растительных алкалоидов (галантаміну, секуриніну, аконітину).
Гашиш. Применение, анализ.
Количественное определение алкалоидов, производных ПАБК, фенотиазина, 1, 4-бензодиазепина разнообразными методами.
Тшх-скринінг “врачебных” отрут. Системы растворителей (общие и отдельные), проявители, коэффициенты подвижности для отдельных групп веществ, елюати.
Общая характеристика и классификация отравлений.
Основные и дополнительные факторы, которые влияют на развитие отравлений.
Наркомании и токсикомании. Стадии развития заболевания.
Организация помощи при острых интоксикациях и основные направления детоксикации организма.
Общие принципы диагностики острых отравлений.
Применение хроматографічних методов анализа (ТШХ, ГРХ, ВЕРХ) в экспресс-диагностике острых отравлений.
Применение імунохімічних методов анализа в экспресс-диагностике острых отравлений.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

Выберите органы трупа женщины для исследования на хинин и пахікарпін. Объясните свой выбор и проведите химико-токсикологический анализ биологического материала.
При проведении подтверждающих реакций на ефедрин оказалось, что с реактивом Драгендорфа и солью Рейнеке образовались осадки, а с раствором нінгідрину окраска не была. Который нужно сделать вывод? Обгрунтуйте заключення или дальнейшее действие.
На исследование поступили недокуренные папиросы, которые были изъятые в наркоманов в состоянии наркотического опьянения. Проведите химико-токсикологический анализ данных объектов.
Найден труп мужчины 35 лет, возле которого лежали разбитые ампулы из прозрачного составила с черной надписью „0,2 % раствор секуриніну нитрат”. Проведите судейско-токсикологический анализ.
Сделан криминальный аборт пахікарпіном с летальным концом. Проведите химико-токсикологическое исследование внутренних органов.
Зафиксировано острое отравление женщины 42 лет. По словам родственников, больная злоупотребляла таблетками радедорма. Проведите направленное химико-токсикологическое исследование по целью подтверждения диагноза - отравление радедормом.
Состоялось острое отравление ребенка. Среди детских игрушек была найдена пустая упаковка из-под аміназину. Проведите химико-токсикологическое исследование для подтверждения клинического диагноза - отравление аміназином.
С суїцидною целью был принятый левомепромазин. Проведите химико-токсикологическое исследование мочи.
В больницу поступил ребенок с признаками отравления тропановими алкалоидами. Проведите химико-токсикологическое исследование промывных вод, мочи, крови.
Составьте один из вариантов схемы химико-токсикологического исследования печени трупа человека на новокаин в присутствии новокаїнаміду.
При исследовании „лужного” хлороформного экстракта из промывных вод желудку с помощью Тшх-скринінгу после обработки хроматограми 10 % раствором серной кислоты и под действием Уф-світла отмечали наличие пятна с голубой флюоресценціею. Выполните подтверждающие реакции на это вещество.
Выберите один из ниже описанных объектов для исследования на ефедрин: промывные воды желудку, моча, кровь, слюна и смывы из ротовой пустоты. Дайте пояснение своему выбору и проведите химико-токсикологический анализ биологического материала.
Найден труп мужчины, который много времени находился на учете в связи с применением наркотиков. Проведите исследование внутренних органов на морфин и кодеин.
При исследовании „лужної” хлороформной вытяжки в общей системе растворителей только с реактивом Драгендорфа образовалось окрашенное пятно. При проведении хроматографічного исследования в отдельной системе с „свідком” - новокаином, последний дал пятно после проявления со значением R_f, близким к R_f исследуемого экстракта. Но после елюювання пятна из необработанной зоны и проведении подтверждающих исследований (реакции образования азобарвника, Віталі-Морена) елюат не дал положительного результата. Объясните ситуацию.
В „лужній” хлороформной вытяжке при действии сульфатной кислоты наблюдалась голубая флюоресценция. Чем было вызвано отравление. Какие реакции дополнительно необходимо провести.
В больницу с острой интоксикацией попал мужчина, который работал ветеринаром. С целью самоубийства он принял вещество, при этом сначала наблюдалось повышение давления, возбуждение со стороны ЦНС, а потом ее угнетение. Чем было вызвано отравление? Проведите химико-токсикологический анализ.
При проведении реакции „лужної” хлороформной вытяжки с реактивом Драгендорфа наблюдали образование кристаллов в виде букв К і Х. Как проводить дальнейший анализ?
При проведении реакции „лужної” хлороформной вытяжки с реактивом Бушарда наблюдали образование золотисто-жовтих кристаллов в виде дубовых листочков. Как проводить дальнейший анализ?
При проведении исследования „лужної” хлороформной вытяжки с реактивом Манделіна получили стойкую зеленую окраску. Чем вызванное отравление? Проведите дальнейшие исследования „лужної” хлороформной вытяжки.

ИСХОДНЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

Методы изолирования “врачебных” отрут из биологического материала.
Условия проведения изолирования “врачебных” отрут из биологического материала.
Химический^-химические-физико-химические свойства и идентификацию хинина, алкалоидов опия и их синтетических аналогов, производных фенотиазина, 1, 4-бензодиазепина в биологических жидкостях организма;
Применение и теоретические основы імуноферментного анализа.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

1. Составлять план проведения исследований.

ИСТОЧНИКА ИНФОРМАЦИИ:

Основные: 1. Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия. - К. Высшая школа. 1995.- С. 169-177, 220-283.

Приложению: 1. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - Г. Медицина. 1975. - С. 215-222.

2. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - К. Высшая школа. 1982.- С. 168-170, 173-174, 177-178, 180, 193, 195.

ЗАНЯТИЕ № 14.

ТЕМА: Открытие и определение минеральных веществ (минеральные кислоты, щелочи, аммиак, соли щелочных металлов) в биологическом материале.

ЦЕЛЬ: Овладеть методиками выделения минеральных веществ (минеральные кислоты, щелочи, аммиак, соли щелочных металлов) из объектов исследования и их анализа.

ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ ОРИЕНТАЦИЯ СТУДЕНТОВ

В связи со случаями отравлений минеральными веществами (минеральные кислоты, щелочи, аммиак, соли щелочных металлов, которые есть описаны в литературе и встречаются в практике химико-токсикологического анализа, выделение нитритов из объектов исследования и их анализ в диализате является необходимым элементом подготовки для химика-токсиколога.

БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

Пути проникновения ядовитых веществ в организм (курс фармакологии, токсикологической химии).
Пути вывода ксенобіотиків из организма (курс фармакологии, токсикологической химии).
Реакции открытия ионов: калия, натрия, аммония, сульфат-, нитрат-, хлорид- и ионов-нитрит-ионов (курс аналитической и фармацевтической химии).

ПРОГРАММА САМОПОДГОТОВКИ

Особенности выделения минеральных веществ из биологического материала. Очистка вытяжек от примесей.
Применение, токсичное действие, выделение, открытие минеральных кислот (сульфатная, хлоридна, нитратная).
Применение, токсичное действие, выделение, открытие щелочей (натрий гідроксид, калий гідроксид).
Применение, токсичное действие, выделение, открытие амоніаку.
Применение, токсичное действие, выделение, открытие солей щелочных металлов (нитриты, нитраты) и N-нітрозосполук.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

На одежде пострадавший выявлен черные обугленные пятна. Предложите схему химико-токсикологического исследования указанного объекта.
Ротовая пустота и пищевод трупа человека, который погиб имеют черный цвет. Предложите схему химико-токсикологического исследования огранів трупа.
Ротовая пустота, пищевод, слизистая оболочка желудку трупа имеют желтый цвет. Предложите схему химико-токсикологического исследования огранів трупа.
В каких случаях нецелесообразно проводить исследование органов трупа на амоніак?
Реакция диализата с сульфаніловою кислотой и с реактивом Грісса давали слабо красноватый цвет. Какие ваши дальнейшие действия относительно ХТА на возможное вещество?
Водные вытяжки из гнилостного биологического материала имели ярко выраженную щелочную реакцию. На какие вещества целесообразно проводить ХТА указанного объекта?
При выполнении реакции на ионы-сульфаты-ионы с диализатом получен положительный результат. Можно ли сделать вывод, что отравление вызвано сульфатной кислотой?

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Вещества, которые изолируют из биологического материала

настаиванием исследуемых объектов с водой

К группе веществ, которые изолируют из биологического материала настаиванием его с водой, принадлежат минеральные кислоты, щелочи и некоторые соли минеральных кислот. Для очистки водных вытяжек с биологической материала применяют фильтрование или центрифугування, а потом - метод диализа.

Некоторые авторы относят минеральные кислоты, щелочи и соли минеральных кислот к группе веществ, которые изолируются из биологического материала методом диализа. Такая характеристика этой группы веществ не совсем точная, поскольку диализ не является методом изолирования, а применяется при анализе этих соединений как метод очистки водных вытяжек.

Химико-токсикологическое исследование соответствующих объектов на наличие минеральных кислот, щелочей и солей проводят тогда, когда материалы дела свидетельствуют о возможном отравлении этими веществами, а также в случае положительных результатов предварительных проб на кислоты, щелочи и соли в исследуемых объектах.

Для исследования наличия минеральных кислот и щелочей берут желудок с содержимым, остатки пищи, рвотные массы и некоторые другие объекты. При исследовании биологического материала на наличие солей берут те самые объекты и печень.

Если минеральные кислоты и щелочи после отравления превратились в трупном материале на соответствующие соли, то исследование этих солей не проводят, поскольку соли многих кислот и щелочей в определенных количествах всегда содержатся в органах и тканях человека и животные.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ

Изолирование минеральных кислот, щелочей и солей

из биологического материала.

Методика изолювання: исследуемые объекты измельчают и прибавляют воду к укрытию ею твердых долек биологического материала. Смесь воды и биологического материала настаивают на протяжении 1-2 ч при частом перемешивании, потом фильтруют. Для ускорения фильтрования применяют воронки или стаканчики с пористым дном, которые присоединяют к водоструйному насосу. Вместо фильтрования можно осуществлять центрифугування.

Для повнішого освобождения водных вытяжек из биологического материала от примесей белковых и некоторых других веществ применяют метод диализа. С этой целью полученные водные вытяжки из биологического материала 2-3 раза діалізують (по 4-6 ч), а потом объединенные диализаты упарюють на водном нагревателе к небольшому объему (5-10 мл). Упарені диализаты исследуют на наличие кислот, щелочей и солей.

При исследовании одежды и некоторых других объектов на наличие на них кислот и щелочей можно использовать водные вытяжки без дополнительной очистки их методом диализа.

МИНЕРАЛЬНЫЕ КИСЛОТЫ

Для доказательства содержимого минеральных кислот в диализатах определяют кислотность этих диализатов и наличие в них анионов соответствующих кислот. Определение кислотности диализатов проводят с помощью кислотно-основных индикаторов, которые изменяют окраску в кислой среде (метилового фиолетового, метилового оранжевого и конго красного).

Методика выполнения реакции: до 0,2-0,5 мл диализата прибавляют 1-2 капле раствора индикатора, изменение окраски которого свидетельствует о наличии кислот в диализате. При добавлении к диализату метилового фиолетового, который имеет два интервала рн перехода окраски (от 0,1 до 1,5 и от 1,5 до 3,2) может изменяться окраска от желтого до зеленого (при рн = 0,1-1,5) или от зеленого до фиолетового (при рн = 1,5...3,2). Красная окраска метилового оранжевого (при рн = 3,0....4,4) переходит в желтое. Сине-фиолетовая окраска конго красного при рн = 3,0...5,2 переходит в красное.

Для проверки кислотности вытяжек (диализатов) и для приблизительного определения рН среды можно использовать бумагу, пропитанная универсальным индикатором. После установления кислотности вытяжек (диализатов) проводят исследование этих жидкостей на наличие анионов сульфатной, нитратной, хлоридной и других кислот.

Наличие анионов сульфатной, нитратной или хлоридной кислоты в извлечениях или диализатах еще не является доказательством отравления этими кислотами. Анионы сульфатной, нитратной или хлоридной кислоты могут входить в состав тканей и биологических жидкостей организма. Поэтому эти анионы всегда могут содержаться в извлечениях из биологического материала. Для доказательства отравлений минеральными кислотами необходимо отогнать эти кислоты из полученных вытяжек (диализатов).

Следует помнить, что переганятись могут лишь кислоты, а не их соли, которые перешли у вытяжки из биологического материала. Учитывая, что сульфатная и нитратная кислоты перегоняются при относительно высокой температуре, эти кислоты переводят в более улетучивающие соединения, которыми есть соответствующие оксиди (SO₂, NO). После відгонки полученных оксидів их переводят у кислоты, которые обнаруживают с помощью качественных реакций.

Сульфатная кислота

Об отравлении сульфатной кислотой может свидетельствовать внешний вид исследуемых объектов. Например, у лиц, которые выпили концентрированную сульфатную кислоту, могут быть повреждения тканей губ, языка, пищевода, желудка, а также одежды, на которую попала сульфатная кислота. Тем не менее доказательством отравления сульфатной кислотой являются открытия ее в дистиллятах, полученных после перегонки этой кислоты из диализатов.

Выделение сульфатной кислоты из биологического материала. Исследуемые органы трупов измельчают, заливают водой к получению густой массы, которую оставляют на 1-2 ч. Полученную вытяжку фильтруют, а фильтрат діалізують, после чего из диализата отгоняют сульфатную кислоту.

При химико-токсикологическом исследовании сульфатной кислоты на одежде или других предметах эту кислоту изолируют этиловым спиртом, в котором растворяется сульфатная кислота и не растворяются ее соли. Исследуемый материал измельчают и заливают этиловым спиртом. Смесь исследуемого объекта и этилового спирта настаивают на протяжении 1-2 ч при периодическом перемешивании, а потом відфільтровують спиртовую вытяжку. Фильтрат на водном нагревателе выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 10 мл воды, полученную жидкость кипятят на протяжении нескольких минут и охлаждают к комнатной температуре. Из полученной жидкости отгоняют сульфатную кислоту, которую исследуют в дистилляте.

<предыдущая страница