Занятие № тема: Методы выделения ядовитых веществ („лекарственных ядов) из биологического материала пораженных животных полярными растворителями

ЗАНЯТИЕ № 2.

ТЕМА: Методы выделения ядовитых веществ („лекарственных” ядов) из биологического материала пораженных животных полярными растворителями.

ЦЕЛЬ: Овладеть методами (общими и частными) выделения из биологического материала (печени) “лекарственных” ядов.

ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ ОРИЕНТАЦИЯ СТУДЕНТОВ

К группе ядовитых веществ, изолирующихся из биологического материала полярными растворителями, принадлежат вещества разных химических классов, которые используются в медицинской практике в качестве лекарственных средств. В завышенных дозах эти вещества могут вызвать отравление. Для возможности исследования этих групп веществ в судебно-химическом анализе для химика-токсиколога необходимо изучение методов (общих и частных) их выделения из биологического материала с целью дальнейшего проведения идентификации этих веществ.

БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

1. Растворимость в воде и органических растворителях барбитуратов, салициловой кислоты, лекарственных веществ - производных пиразолона, фенотиазина, 1,4-бенздиазепинов, п-аминобензойной кислоты (курс органической и фармацевтической химии).

2. Понятие о рН и константе ионизации (курс неорганической и аналитической химии).

3. Теоретические основы экстракции (курс физической химии и аналитической химии).

4. Хроматографические методы анализа (курс аналитической, физической химии).

ПРОГРАММА САМОПОДГОТОВКИ

1. Физико-химические свойства веществ, изолируемых из биологического материала экстракцией полярными растворителями.

2. Основные причины и частота отравлений лекарственными веществами.

3. Растворители, используемые для экстракции “лекарственных” ядов из биологического материала. Перспектива их применения. Примеры.

4. Условия разделения „лекарственных” ядов на подгруппы. Выбор рН среды.

5. Основные этапы изолирования “лекарственных” ядов по методу А.А. Васильевой.

6. Основные этапы изолирования “лекарственных” ядов по методу Стаса-Отто.

7. Основные этапы изолирования “лекарственных” ядов по методу В.А. Карташова.

8. Основные этапы изолирования “лекарственных” ядов по методу В.П. Крамаренка.

9. Основные этапы изолирования “лекарственных” ядов по методу Изотова.

10. Основные этапы изолирования “лекарственных” ядов по методу Поповой.

11. Основные этапы изолирования “лекарственных” ядов по методу Саломатина.

12. Основные этапы изолирования “лекарственных” ядов по методу Валова.

13. Способы измельчения навесок биологического материала в химико-токсикологическом исследовании на “лекарственные” яды. Преимущества и недостатки данных способов.

14. Факторы влияния на эффективность изолирования веществ из биологического материала.

15. Факторы влияния на эффективность изолирования веществ из водных извлечений органическими растворителями.

16. Методы очистки извлечений от примесей и концентрирование выделенных веществ.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

Биологический материал подвергся процессу гниения. Выберите метод изолирования неизвестного яда из него.
Отравление было вызвано фенобарбиталом. Выберите метод изолирования яда. Объясните выбор метода.
Каким методом изолирования пользуются при исследовании на неизвестный яд? Объясните выбор метода.
Возле трупа пострадавшего была найдена баночка из-под диазепама. Выберите метод изолирования яда. Объясните выбор метода.
Произошло острое отравление ребенка. Среди детских игрушек была найдена пустая упаковка из-под аминазина. Выберите метод изолирования яда. Объясните выбор метода.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДОВ ИЗОЛИРОВАНИЯ

Для изолирования «лекарственных» ядов используют общие и частные методы.

К общим методам изолирования принадлежат такие: экстракция водой, подкисленной оксалатной кислотой; экстракция этанолом, подкисленным оксалатной кислотой; экстракция ацетоном или ацетонитрилом. Первые два метода широко введены в практику химико-токсикологического анализа; изолирование ядов ацетонитрилом используется успешно за границей, экстракция ацетоном - перспективный метод изолирования, разработанный в 80-х годах В.А. Карташовим.

Изолирование ядов экстракцией полярными растворителями включает такие этапы:

1. Подготовка пробы к анализу: измельчение органов трупа с помощью ножниц, мясорубки, гомогенизатора.

2. Взятие навески (1-100 г в зависимости от содержания ядовитого вещества в объекте и чувствительности метода).

3. 3-разовая экстракция яда подкисленным растворителем или без подкисления.

4. Объединение, процеживание, центрифугирование экстракта (последнее при необходимости).

5. Экстракция ядов из кислой среды органическим растворителем - получение «кислого» извлечения.

6. Экстракция ядов из щелочной среды органическим растворителем - получение «щелочного» извлечения.

При использовании как экстрагента этанола предусмотрено осаждение белков абсолютным этанолом из концентрированного спиртового извлечения с последующим фильтрованием извлечения и разбавлением водой. При использовании как экстрагента ацетонитрила предусмотрено разбавление ацетонитрильного извлечения 2,5% раствором натрий сульфата перед экстракцией ядов неполярными или малополярними растворителями (гексаном, эфиром, хлороформом).

Химико-токсикологическая оценка методов изолирования

Метод изолирования ядов экстракцией подкисленной водой не пригоден для анализа биологического материала, в котором прошли гнилостные изменения, в связи с образованием устойчивых эмульсий на стадии экстракции веществ из водного извлечения органическим растворителем и недостаточной очистки экстрактов. Данный метод мало пригоден для анализа барбитуратов и других веществ, мало растворимых в подкисленной воде. Этих недостатков не имеют методы изолирования ядов экстракцией этанолом, ацетоном, ацетонитрилом.

Метод изолирования подкисленной водой дешевле и безопаснее, чем органическими экстрагентами, и с успехом применяется при исследовании объектов, которые не находятся на стадии гнилостных изменений.

Частные методы изолирования используют при целенаправленном (направленном) химико-токсикологическом анализе на конкретную химическую группу ядов или индивидуальные вещества. В этих методах учитываются физико-химические особенности веществ, которые будут изъяты: например, для барбитуратов используют подщелоченную воду, что обусловлено растворимостью их солей в воде; для экстракции барбитуратов из подкисленных водных извлечений используют эфир, а не обще принятый экстрагент хлороформ, что также связано с лучшей растворимостью имидной формы этих соединений в эфире, чем в хлороформе.

При использовании общих методов изолирования все яды этой большой группы делятся на две подгруппы: те, что экстрагируются органическими растворителями из кислой водной среды - «кислое» хлороформное извлечение и из щелочного - «щелочное» хлороформное извлечение. В «кислое» хлороформное извлечение попадают вещества кислотного, нейтрального, слабоосновного характера и частично средней основности, которые не дают устойчивых солей с кислотами; в «щелочное» - вещества основного характера. Разделение веществ, которые изучаются, на две подгруппы облегчает анализ и повышает специфичность открытия ядов.

МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ

Изолирование ядов из органов трупа проводят по одной из методик, описанных ниже, учитывая состояние объекта и физико-химических свойства исследуемого вещества.

Изолирование „лекарственных” ядов водой, подкисленной щавелевой кислотой (метод А.А. Васильевой)

Измельченный объект (органы трупа) помещают в колбу и заливают двойным объемом (по отношению к навеске) дистиллированной воды. Потом подкисляют смесь 10% раствором оксалатной кислоты до рН 2-3 по универсальной индикаторной бумаге. После 2-х часов настаивания при постоянном помешивании смеси получают водное извлечение, которое процеживают через двойной слой марли. Операцию настаивания повторяют на протяжении часа с одинарным объемом подкисленной воды. Процеживают, кислые водные извлечения объединяют, помещают в делительную воронку и трижды встряхивают с отдельными порциями хлороформа (15, 10, 10 мл). Хлороформные извлечения объединяют и фильтруют через небольшой бумажный фильтр, предварительно смоченный хлороформом, в сухую колбу с надписью «Кислое хлороформное извлечение». Водный слой в делительной воронке подщелачивают 25% раствором аммиака до рН 8-9 по универсальной индикаторной бумаге и снова встряхивают трижды с отдельными порциями хлороформа (15, 10, 10 мл). Хлороформные извлечения объединяют, фильтруют, как описано выше, в колбу с надписью «Щелочное хлороформное извлечение». При экстрагировании ядов хлороформом из щелочного водного извлечения образуются устойчивые эмульсии, для разрушения которых можно применять центрифугирование содержимого воронки или прибавить к смеси безводного натрий сульфата.

Изолирование „лекарственных” ядов подкисленным спиртом (современная модификация метода Стаса-Отто)

Измельченный объект (органы трупа) помещают в стакан, заливают 96% этанолом до образования зеркальной поверхности, смесь подкисляют 10% спиртовым раствором оксалатной кислоты до рН 2-3 по универсальной индикаторной бумаге и оставляют на сутки при периодическом перемешивании. Потом кислое спиртовое извлечение отделяют, фильтруют через смоченный этанолом бумажный фильтр. Операцию настаивания повторяют 2-3 раза. Спиртовые кислые извлечения объединяют и упаривают на водной бане при 40-50° С до густоты сиропа. Сиропообразную жидкость обрабатывают 96% этанолом, приливая его каплями до тех пор, пока этанол не перестанет вызывать помутнения извлечения. Осадку дают отстояться и потом отфильтровывают его через небольшой фильтр (диаметр 5-6 см), предварительно смоченный спиртом. Фильтр промывают небольшим количеством спирта. Фильтрат сгущают в фарфоровой чашке на водной бане до густоты сиропа и снова повторяют операцию осаждения до тех пор, пока этанол не перестанет осаживать белки. Потом извлечение снова упаривают на водной бане до густоты сиропа, остаток растворяют в 25-30 мл теплой дистиллированной воды и мутный раствор фильтруют через небольшой бумажный фильтр, смоченный водой, в делительную воронку. Водно-спиртовый раствор экстрагируют три раза хлороформом порциями по 15, 10, 10 мл. Хлороформные извлечения фильтруют через фильтр, смоченный хлороформом, в сухую колбу с надписью «Кислое хлороформное извлечение». Водный остаток в делительной воронке подщелачивают 25% раствором аммиака до рН 8-9 по универсальной индикаторной бумаге и снова проводят экстракцию хлороформом, как описано выше. Объединенные хлороформные извлечения помещают в сухую колбу с надписью «Щелочное хлороформное извлечение».

Изолирование „лекарственных” ядов ацетоном (метод В.А. Карташова)

5 г гомогенизированой ткани внутренних органов помещают в пеницилиновый флакон емкостью 20 мл, прибавляют 5 мл ацетона; смесь перемешивают, закрывают полиэтиленовой пробкой и взбалтывают на протяжении 10 мин. Потом содержимое флакона центрифугируют 5 мин. при 2500 об/мин. и жидкость над осадком сливают через небольшой ватный тампон в флакон емкостью 30 мл. Операцию экстрагирования повторяют еще 3 раза. К объединенным ацетоновым извлечением прибавляют 20 мл 0,5 моль/л раствора хлоридной кислоты и экстрагируют 2 раза н-гексаном по 10 мл. Органическую фазу отделяют и отбрасывают. Из водной фазы вещества экстрагируют эфиром 2 раза по 10 мл. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр и выпаривают в потоке теплого воздуха досуха. Сухой остаток исследуют на вещества кислого характера. Водную фазу подщелачивают до рН 11, прибавляют 5 г натрий хлорида и экстрагируют 2 раза эфиром по 10 мл. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют, растворитель упаривают, сухой остаток исследуют на вещества основного характера.

Изолирование алкалоидов водой, подкисленной сульфатной кислотой (метод В.П. Крамаренка)

100 г измельченного биологического материала помещают в колбу или стакан, заливают 0,01 моль/л раствором сульфатной кислоты до образования зеркальной поверхности. Если рН раствора после перемешивания содержимого колбы выше, чем 2,5 то прибавляют каплями 20% раствор сульфатной кислоты до указанного значения рН. Смесь оставляют на 2 часа, периодически взбалтывая. По окончании этого времени водное извлечение отделяют и процеживают через слой марли. Операцию экстрагирования проводят трижды. Кислые извлечения собирают вместе и центрифугируют. Жидкость над осадком сливают, а осадок снова заливают 20-30 мл 0,01 моль/л раствора сульфатной кислоты (рН 2,5), перемешивают, настаивают 2 часа, после чего извлечение центрифугируют. Центрифугаты объединяют, насыщают аммоний сульфатом и оставляют на 1-2 часа. Если образовался осадок, его отделяют центрифугированием. Освобожденную от белков, кислую жидкость дважды экстрагируют эфиром порциями по 40 мл. Эфирный слой отделяют, а к водному извлечению прибавляют 20% раствор натрий гидроксида до рН 8,5-9 и трижды проводят экстракцию веществ основного характера отдельными порциями хлороформа, равными третей части объема водной фазы. Хлороформные извлечения объединяют, фильтруют через сухой фильтр, а потом растворитель упаривают на водяной бане при температуре 40-50° досуха. В зависимости от поставленной задачи сухой остаток растворяют в 5-6 мл хлороформа или в 20 мл 0,1 моль/л раствора хлоридной кислоты и проводят исследование на алкалоиды. При необходимости исследуется и эфирный экстракт, полученный из кислого водного извлечения, на вещества, которые экстрагируются из кислой водной среды органическим растворителем.

Экспресс-метод изолирования производных фенотиазина подкисленным ацетонитрилом (метод Е.М. Саломатина)

50 г измельченного биологического материала помещают в колбу, подкисляют 10% раствором хлоридной кислоты до рН 2-3 и проводят экстракцию ядов последовательно 100, 50 и 50 мл ацетонитрила на протяжении 30, 15 и 15 мин. соответственно с использованием механического встряхивания. Ацетонитрильное извлечение фильтруют через смоченный дистиллированной водой бумажный фильтр в делительную воронку, которая содержит 500 мл 2,5% водного раствора натрий сульфата. Содержимое делительной воронки перемешивают до образования гомогенного раствора, подкисляют 6 моль/л раствором хлоридной кислоты до рН 2,0-3,0 (по универсальной индикаторной бумаге) и трижды по 10 мин. экстрагируют порциями эфира (по 100 мл). Водно-ацетонитрильный раствор, который остался после экстракции эфиром, подщелачивают насыщенным водным раствором натрий гидроксида до рН 13 по универсальной индикаторной бумаге и трижды экстрагируют по 10 мин. порциями эфира по 100 мл. Эфирные экстракты упаривают под вакуумом на роторном испарителе при 40° С до объема 35-40 мл и фильтруют в мерную колбу емкостью 50 мл через бумажный фильтр диаметром 5-6 см, содержащий 1,5-2 г безводного натрий сульфата. Колбу и фильтр промывают 10-15 мл эфира, который присоединяют к фильтрату в мерной колбе. Содержимое колбы доводят до метки эфиром и исследуют.

Изолирование барбитуратов подщелоченной водой (метод П. Валова)

К 100 г измельченного биологического материала прибавляют воду и 10% раствор натрий гидроксида (180 и 20 мл соответственно). Смесь перемешивают и оставляют на 30 мин. при периодическом перемешивании, потом процеживают и центрифугируют на протяжении 30 мин. при 3000 об/мин. К центрифугату прибавляют 20 мл 10% раствора натрий вольфрамата и 0,5 моль/л раствора сульфатной кислоты до рН 2. После чего смесь нагревают 20 мин. на кипящей водяной бане, потом центрифугируют 30 мин. Центрифугат процеживают через ватный тампон, сливая из осадка. Тампон промывают 10 мл воды, присоединяя ее к процедженому центрифугату. К кислому извлечению прибавляют равный объем эфира и взбалтывают 15 мин. Органическую фазу отделяют и взбалтывают с 50 мл 10% раствора натрий гидроксида, после чего отделяют водный слой, подкисляют его 25% раствором сульфатной кислоты до рН 2 и взбалтывают с равным объемом эфира. Отделяют эфирный слой и проводят с ним анализ экстракта на барбитураты.

Изолирование барбитуратов водой, подкисленной сульфатной кислотой (метод В.И. Поповой)

100 г измельченного биологического материала (печень, почки, мозг) заливают 0,01 моль/л раствором сульфатной кислоты до рН 2,0-3,0 и оставляют на 2 часа при периодическом перемешивании. Потом извлечение сливают, операцию настаивания с подкисленной водой повторяют еще 2 раза по одному часу, заливая объект новыми порциями 0,01 моль/л раствора сульфатной кислоты (по 80 мл). Извлечения объединяют, процеживают через 3 слоя марли, измеряют объем, потом центрифугируют (3000-5000 об/мин.) на протяжении 20-30 мин. 25 или 50 мл центрифугата вносят в колонку (40x2,5), заполненную гелем сефадексом Є-25 (размер частичек в сухом состоянии 100-300 мкм). На полиэтиленовой трубке в нижней части колонки открывают зажим - внесенное в колонку извлечение сорбируется (над гелем должен оставаться небольшой слой жидкости). После этого в колонку дважды вносят по 2 мл 0,01 моль/л раствора сульфатной кислоты, каждый раз открывая зажим. Для элюирования барбитуратов колонку соединяют с установленным выше сосудом, заполненным 0,01 моль/л раствором сульфатной кислоты, открывают зажим снизу колонки. Первые 150 мл элюата отбрасывают, а следующие 200 мл переносят в делительную воронку, куда прибавляют 50 мл хлороформа; содержимое воронки взбалтывают 10 мин. Экстракцию новыми порциями хлороформа проводят 2 раза. Хлороформные извлечения объединяют, упаривают при 40° до сухого остатка, который и исследуют.

Изолирование метаболитов производных 1, 4-бенздиазепина (метод Б.М. Изотова)

К 25 г гомогенизата органа прибавляют 6 моль/л раствор хлоридной кислоты в соотношении 1:2 и проводят гидролиз объектов в колбе с обратным холодильником на глицериновой бане при температуре 140-145° на протяжении 60 мин. Гидролизат центрифугируют при 5000 об/мин на протяжении 15 мин, фильтруют, подщелачивают 30% раствором натрий гидроксида до рН 8-9 и экстрагируют трижды порциями 50, 25, 25 мл смесью хлороформ-пентанол (9:1). Органическую фазу отделяют в мерную колбу на 100 мл, фильтруя через слой безводного натрий сульфата и доводят до метки, после чего исследуют на бензофеноны (продукты метаболизма производных 1, 4-бенздиазепина).

ИСХОДНЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

Методы изолирования “лекарственных” ядов из биологического материала.
Условия проведения изолирования “лекарственных” ядов из биологического материала.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

Проводить изолирование “лекарственных” ядов из биологического материала разными методами.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

Основные: 1. Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия. - М. Высшая школа. 1989.- 172-183.

Приложению: 1. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М. Медицина. 1975. - С. 119-133.

2. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - К. Высшая школа. 1982.- 110-121.

ЗАНЯТИЕ № 3.

ТЕМА: Открытие ядовитых веществ „кислой” хлороформной извлечения (производных барбитуровой и салициловой кислот и пиридина).

ЦЕЛЬ: Овладеть методиками выполнения осадочных, цветных и микрокристалоскопических реакций, которые используются для открытия барбитуратов, производных салициловой кислоты в извлечениях с целью дальнейшего их применения в химико-токсикологическом анализе.

ПРОФЕССИОНАЛЬНАЯ ОРИЕНТАЦИЯ СТУДЕНТОВ

Злоупотребление снотворными занимает по распространенности в мире далеко не последнее место. Индивидуальные последствия чрезмерного употребления снотворных (особенно производных барбитуровой кислоты) превышают последствия от злоупотребления опиатами и гашишем, вместе взятыми. Часто это приводит к наркомании, иногда причиняет от передозировки острую интоксикацию, иногда смерть. Салицилаты - достаточно часто становятся причиной отравлений, особенно у детей, вследствие неосторожного применения мазей, которые содержат эти вещества. Для возможности исследования этих групп веществ при судебно-химическом анализе для химика-токсиколога необходимо изучение методик открытия ядовитых веществ в извлечениях.

БАЗОВЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

Химические свойства исследуемых классов соединений (курс органической химии).
Техника выполнения реакций осаждения, капельных, в пробирках и микрокристаллоскопических реакций (курс аналитической химии).
Характерные реакции на производные салициловой, барбитуровой кислот (курсы органической и фармацевтической химии).

ПРОГРАММА САМОПОДГОТОВКИ

1. Физико-химические свойства ядовитых вещества, экстрагируемых органическими растворителями из кислых извлечений, полученных настаиванием биологического материала подкисленной водой, или подкисленным спиртом.

2. Методы изолирования барбитуратов из биологического материала, которые применяются в химико-токсикологическом анализе.

3. Общие реакции открытия барбитуратов из экстрактов.

4. Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, метаболизм, изолирование, открытие барбитуратов (барбамил, барбитал, фенобарбитал, бутобарбитал, этаминал-натрий, бензонал, гексенал).

5. Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, метаболизм, открытие производных салициловой кислоты. Зависимость окраски салицилатов ферума от рН среды.

6. Открытие аспирина в извлечениях из биологического материала.

7. Физико-химические свойства, применение, токсичное действие, метаболизм, открытие производных пиридина (ноксирон).

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

Из обстоятельств дела известно, что потерпевший принимал снотворное - эффект сна не наблюдался. Выделенное из биологического материала вещество дало положительную реакцию на барбитураті с аммиачным раствором кобальт ацетата. Наличие какого барбитурата можно предусмотреть?
Найден труп женщины 56 лет, рядом - конвалюта из-под фенобарбитала. Проведите химико-токсикологический анализ внутренних органов.
При выполнении микрокристалоскопической реакции выделения кислотной формы барбитуратов, изолированных из биологического материала, образовались кристаллы двух типов. Какие ваши дальнейшие действия.
При проведении исследований „кислой” хлороформной извлечения получили положительные результаты со следующими реактивами: солями кобальта и изопропиламином, солями кобальта и щелочью, солями купрума и пиридином, цинкхлорйодом, а также мурексидная реакция. Чем было вызвано отравление?
Найден труп мужчины 49 лет. Из обстоятельств дела стало известно, что он болел эпилепсией. Проведение судебно-токсикологического анализа дало следующие результаты: фиолетовый цвет раствора с солями кобальта и изопропиламином, сине-фиолетовый цвет с солями кобальта и щелочью. Чем было вызвано отравление.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Производные барбитуровой кислоты

В современной медицине применяется большое количество барбитуратов (производных барбитуровой кислоты). Барбитураты - одна из групп веществ, которые имеют большое токсикологическое значение. Сама барбитуровая кислота (малонилмочевина) не применяется в медицине, тем не менее широко используются ее производные.

Барбитуровая кислота образует со щелочами соли. Кислотные свойства барбитуровой кислоты обусловлены наличием атомов гидрогена в -NH- гpyпах, находящихся рядом с карбонильной группой -CO-.

Барбитураты, применяемые в медицине, это 5,5-замещенные (барбамил, барбитал, фенобарбитал, бутобарбитал, этаминал) и 1,5,5-замещенные (гексенал, бензонал) барбитуровой кислоты.

БАРБАМИЛ (амитал-натрий, амобарбитал-натрий, амилобарбитал-натрий)

Физико-химические свойства: 5-этилбарбитурат натрия - белый аморфный гигроскопический порошок без запаха. Хорошо растворяется в воде и

этиловом спирте, практически не растворим в диэтиловом эфире, экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Применение. Этот препарат применяется как успокоительное и протисудорожное средство.

Действие на организм. Барбамил оказывает снотворное действие, а в высших дозах - наркотические свойства.

Метаболизм. Около 45 % барбамила метаболизируют. Метаболитом барбамила является 5-этил-(3-метилбутил)-барбитуровая кислота, которая выделяется с мочой.

Выделение из организма. Часть барбамила выделяется из организма с мочой в несмененном виде. В моче выявлено еще два метаболита барбамила, состав которых не установлен.
БАРБІТАЛ (веронал)

Физико-химические свойства: 5,5-диэтилбарбитуровая кислота - белый кристалличес-кий порошок. Как фармацевтический препарат применяется и натриевая соль барбитала (мединал).

Барбитал растворяется в этиловом спирте (1:15), диэтиловом эфире (1:40), хлороформе (1:75), воде (1:160). Он растворяется также в растворах щелочей и карбонатов щелочных металлов. Мединал растворяется в воде (1:5), слабо растворяется в этиловом спирте (1:600), практически не растворяется в диэтиловом эфире и хлороформе. Барбитал экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Применение. Барбитал применяется как успокоительное и снотворное средство. Он принадлежит к барбитуратам продолжительного действия. Иногда его назначают больным в смесях с бромидами, антигрипином и т.п.

Действие на организм. Успокоительное и снотворное действие на организм.

Метаболизм. К метаболитам принадлежат 5-этил--оксиэтилбарбитуровая кислота, ее глюкуронид и 5-этилбарбитуровая кислота.

Выделение из организма. Барбитал по сравнению с другими барбитуратами медленно всасывается из ЖКТ и еще медленнее выделяется из организма. Его можно открыть в организме даже через 10 суток после употребления. Большая часть дозы принятого барбитала выделяется с мочой в несмененном виде. Незначительная часть дозы барбитала выделяется с мочой в виде метаболитов.
ФЕНОБАРБИТАЛ (люминал)

Физико-химические свойства: 5-этилбарбитуровая кислота - белый кристаллический порошок, слабо-горький на вкус, растворяется в этиловом спирте (1:15), хлороформе (1:50), растворах

щелочей, слабо растворяется в воде (1:1000). Фенобарбитал экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Применение. Он применяется для лечения эпилепсии, хореи, эклампсии, бессоннице и других заболеваний. В небольших дозах фенобарбитал нашел применение при начальных стадиях гипертонической болезни, стенокардии и т.п. Он входит в такие препараты как „барбовал”, „валокардин”, „валордин”, „корвалол”, „корвалтаб”, „корвалдин” и др.

Действие на организм. Фенобарбитал имеет снотворное, успокоительное и противосудорожное, спазмолитическое действие. Фенобарбитал, по сравнению с другими барбитуратами, относительно медленно всасывается из пищевода и имеет пролонгированное действие.

Метаболизм. Фенобарбитал метаболизирует несколькими путями. Главными метаболитами фенобарбитала есть гидроксифенилбарбитуровая кислота и n-оксифенобарбитал. Небольшое количество фенобарбитала превращается в о-оксифенобарбитал. Открыто еще три метаболита фенобарбитала, состав которых не изучен.

Выделение из организма. Метаболиты частично выделяются с мочой в виде глюкуронидов. Часть принятой дозы фенобарбитала выделяется с мочой в неизмененном виде.
БУТОБАРБИТАЛ

Физико-химические свойства: Бутобарбитал (5-бутил-5-этилбарбитуровая кислота) - белый кристаллический порошок или белые гранулы, слабогорькие на вкус, без запаха, растворяется в

этиловом спирте (1:1), хлороформе (1:3), диэтиловом эфире (1:10), слабо растворяется в воде (1:250).

Бутобарбитал экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Применение. Он входит в состав таблеток «беллоид», который кроме бутобарбитала содержит эрготоксин и сумму алкалоидов белладонны. Этот препарат применяют при бессонные, повышенной раздражительности, функциональных расстройствах высшей нервной системы.

Действие на организм. Бутобарбитал - барбитурат середне продолжительного действия на организм. Проявляет снотворное и успокоительное действие на организм.

Метаболизм. Метаболитом бутобарбитала является 5-(3-гидроксибутил)- 5-этилбарбитуровая кислота.

Выделение из организма. Метаболиты частично выделяются с мочой в виде глюкуронидов. Часть принятой дозы бутобарбитала выделяется с мочой в несмененном виде.

ЭТАМИНАЛ-НАТРИЙ

Физико-химические свойства. Этаминал-натрий (нембутал-натрий, пентобарбитал-натрий, пентал), 5-этил-5-( 2-амил)-барбитурат натрия — белый порошок, растворимый в воде и этиловом

спирте, практически не растворимый в диэтиловом эфире. Этаминал экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Применение. Этаминал применяется как снотворное средство при бессоннице.

Действие на организм. Этаминал за своим строением и действием близок к барбамилу. Однако этаминал-натрий быстро разлагается в организме и действует менее продолжительно, чем барбамил.

Метаболизм. Этаминал-натрий быстро всасывается из пищевода и метаболизирует. Главными метаболитами этаминал-натрия является этил-5-(окси-3-метил-1-бутил)-5-барбитуровая кислота, метил-5-(окси-3-метил-1-пропил)-5-барбитуровая кислота. Одним из метаболитов этаминал-натрия является мочевина.

Выделение из организма. Метаболиты преимущественно выделяются с мочой.
БЕНЗОНАЛ

Физико-химические свойства. Бензонал (бензобарбитал), 5-фенилбарбитуровая кислота - белый кристаллический порошок, горький на вкус. Тяжело растворяется в воде и этиловом спирте, легко - в диэтиловом эфире, хлороформе и диметил-

формамиде. Бензонал экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Применение. Бензонал применяется в основном для лечения судорожных форм эпилепсии. Иногда он применяется для лечения больных, страждающих на припадки, которые не сопровождаются судорогами. Применяют также для терапии гипербилирубинемии, гемолитической болезни у детей.

Действие на организм. Бензонал является индуктором микросомальных ферментов печени, поэтому эффективность другого лекарства может уменьшаться. При передозировке наблюдается нарушение речи, сонливость, головная боль, заторможенность, вялость, снижение аппетита. Потенцирует действие седативных и снотворных препаратов.

Метаболизм. Метаболитами бензонала являются бензойная кислота и фенобарбитал, который в свою очередь тоже метаболизирует.

Выделение из организма. Бензонал и его метаболиты выделяются преимущественно с мочой.
ГЕКСЕНАЛ

Физико-химические свойства. Гексенал (эвипан натрия), 1,5-циклогексен(-1-ил)-барбитурат натрия - натриевая соль гексобарбитала. Это белая или едва желтоватая пенообразная горькая масса. Под влиянием влаги воздуха гексенал расплывается,

а под действием углекислого газа - разлагается. Хорошо растворяется в воде, этиловом спирте и хлороформе, слабо - в диэтиловом эфире. Гексенал экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Применение. Гексенал применяют для наркоза в сочетании с нитроген (І) оксидом, фторотаном и некоторыми другими веществами. Для кратковременного наркоза (на протяжении 15-20 мин.) гексенал можно применять и отдельно.

Действие на организм. Гексенал проявляет снотворное действие, а в больших дозах имеет наркотические свойства. Он принадлежит к барбитуратам короткого периода действия.

Метаболизм. В организме гексенал метаболизируют несколькими путями. В ходе метаболизма может гидроксилироваться циклогексильная группа гексеналу. Образованный при этом продукт гидроксилирования может окисляться с образованием 3'-кетогексобарбитала. Этот метаболит, в свою очередь, может N-деметилироваться. Некоторая часть гексенала метаболизирует путем N-деметилирования при атоме нитрогена в положении 3. В результате этого образуется норгексобарбитал. Определенное количество гексенала, который попал в организм, метаболизируется путем разрыва цикла барбитуровой кислоты.

Выделение из организма. Гексенал и его метаболиты преимущественно выделяются с мочой.
САЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА

Физико-химические свойства. Салициловая (о-оксибензойная) кислота - белые иглистые кристаллы или легкий кристаллический порошок без запаха. Эта кислота

перегоняется с водным паром, при осторожном нагревании сублимируется. Растворяется в эфире (1:3), этиловом спирте (1:4), хлороформе (1:55), слабо растворяется в воде (1:550), лучше - в кипящей воде (1:15).

Салициловая кислота экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Применение. Салициловую кислоту применяют в медицине для лечения кожных и других заболеваний. Ее применяют в виде растворов и присыпок при повышенной потливости. Дезинфицирующее действие салициловой кислоты (в пастах, мазях) используется для лечения инфекционных заболеваний кожи. Салициловую кислоту используют как консервант при изготовлении вин, овощных консервов, варенья, соков и т.п.. Следует отметить, что на заводах и фабриках салициловую кислоту для консервирования не применяют. Салициловая кислота как составная часть в незначительных количествах содержится в вишне, малине, землянике и других ягодах.

Действие на организм. При высокой концентрации (10-20 %) салициловая кислота проявляет кератолитическое действие (разрыхляет и отделяет эпидермис). На этом свойстве салициловой кислоты базируется применение ее в составе разных протимозольних средств. В небольших концентрациях (1-2 %) салициловая кислота проявляет кератопластическое действие (оказывает содействие разрастанию эпидермиса). Салициловая кислота угнетает секрецию потовых желез.

При попадании салициловой кислоты вглубь наблюдается раздражение слизистой оболочки желудка, появляется боль в набрюшном участке, тошнота, а иногда и рвота. Поэтому салициловую кислоту не употребляют вглубь. С этой целью применяют соли салициловой кислоты (салицилаты) и ее производные.

Метаболизм. Метаболитами салициловой кислоты являются о-гидроксибензоилглюкуронид и о-карбоксифенилглюкуронид. Часть салициловой кислоты, которая попала в организм, метаболизирует путем гидроксилирования. При этом образуются метаболиты: 2,3-дигидро-ксибензойная кислота, 2,5-дигидроксибензойная кислота и 2,3,5-тригидроксибензойная кислота.

Выделение из организма. Салициловая кислота частично выделяется из организма с мочой в несвязанном виде и в виде коньюгатов с глицином и глюкуроновой кислотой. Метаболиты выделяются из организма с мочой.
АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА

Физико-химические свойства. Ацетилсалициловая кислота (аспирин) - бесцветное кристаллическое вещество без запаха, со слабым вкусом, малорастворима в воде, хорошо растворима в спирте, хлороформе, эфире.

Применение. Ацетилсалициловую кислоту применяют в медицине для снятия болевого синдрома слабой и средней интенсивности разнообразного генеза, лихорадках, зажигательных и ревматических заболеваниях. Могут применять при нестабильной стенокардии, остром инфаркте миокарду. Входит в состав других лекарственных препаратов, например, копацила.

Действие на организм. Аспирин это жаропонижающее, анальгезирующее и противовоспалительное средство, уменьшаю агрегацию тромбоцитов. При длительном употреблении может возникнуть головная боль, обратимые нарушения зрения, шум в ушах, рвота, нарушение свертывания крови. При тяжелых отравлениях возможны тремор, одышка, гипертермия, кома.

Метаболизм. Выделение из организма. Аспирин частично выделяется из организма с мочой в несвязанном виде и в виде коньюгатов.
НОКСИРОН (глютемид, дориден,элродорм)

Физико-химические свойства. Ноксирон или 3-фенилглутаримид – белый кристаллический порошок. Под влиянием щелочей разлагается. Нерастворимый в воде;

растворяется в хлороформе (1:1), этиловом спирте (1:5), диэтиловом эфире (1:12) и других органических растворителях. Ноксирон экстрагируется органическими растворителями из кислых водных растворов.

Применение. Ноксирон применяют как успокоительное и снотворное средство.

Действие на организм. Снотворное действие ноксирона слабее, чем барбитуратов. При продолжительном применении к нему развивается привыкание.

Метаболизм. Ноксирон является рацематом. Каждая энантиомерная форма этого препарата метаболизирует неодинаково. Правовращающая форма метаболизирует с образованием -этил--фенил--оксиглютетимида, часть которого превращается в -этил--фенилглютаконимид. Левовращающая форма метаболизирует с образованием -(1-оксиэтил)--фенилглутаримид. Потом некоторая часть этого метаболита превращается в -фенилглутаримид.

Выделение из организма. Часть указанных метаболитов выделяется с мочой в виде глюкуронидов.
МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ

Выделение барбитуратов из биологического материала

Для выделения барбитуратов из биологического материала продолжительное время применялись методы, разработанные для выделения алкалоидов. В последние десятилетия для выделения барбитуратов из объектов биологическое происхождение предложено ряд специальных методов.

Для изолирования барбитуратов можно применить общие методы (Васильевой, Стаса-Отто), однако лучше всего использовать специальные - Поповой, Валова. Методики проведения изолирования см. занятие № 2.

Особенности изолирования ноксирона

При исследовании мочи и крови на наличие ноксирона его экстрагируют хлороформом. С этой целью к моче или крови прибавляют одинаковый объем хлороформа и взбалтывают на протяжении 15 мин. Хлороформное извлечение отделяют от мочи или крови и взбалтывают с 0,5 н. раствором хлоридной кислоты. Очищенные таким образом хлороформные извлечения исследуют на наличие ноксирона.

Особенности изолирования салициловой кислоты

Для выделения салициловой кислоты из консервов, варенья и других пищевых продуктов их настаивают с 1 %-м раствором карбоната натрия. При этом салициловая кислота превращается в растворимый салицилат натрия. Водное извлечение отфильтровывают, подкисляют раствором сульфатной кислоты. Салициловую кислоту, которая при этом образовалась, экстрагируют органическими растворителями.

Открытие барбитуратов

Для открытия барбитуратов применяют цветные, осаждения, микрокристаллоскопические реакции, методы хроматографии, УФ- и ИЧ-спектроскопии и т.п..

1. Предварительная проба. Для открытия барбитуратов в моче применяют предварительную пробу, которая базируется на реакции этих веществ с кобальт ацетатом и литий гидроксидом.

Методика выполнения реакции. В делительную воронку вносят 50 мл мочи, к которой каплями прибавляют 10 %-й раствор сульфатной кислоты до рН = 4...5 и 50 мл диэтилового эфира. Содержимое делительной воронки взбалтывают. После разделения фаз отделяют эфирное извлечение. Водную фазу еще раз взбалтывают с 50 мл диетилового эфира. Эфирные извлечения объединяют и выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл хлороформа. К хлороформному раствору прибавляют 2 капли свежеприготовленного 1 %-го раствора кобальт ацетата в метиловом спирте и несколько капель свежеприготовленного 1 %-го раствора литий гидроксида в метиловом спирте. После добавления каждой капли названных реактивов жидкость взбалтывают. Появление голубой окраски свидетельствует о наличии барбитуратов в моче.

2. Реакция барбитуратов с изопропиламином и солями кобальта. Для открытия барбитуратов Парри (1924) предложил реакцию, которая базируется на взаимодействии этих веществ с солями кобальта и аммиаком. Позднее другие исследователи заменили аммиак изопропиламином. Во время взаимодействия барбитуратов с изопропиламином и солями кобальта образуются внутрикомплексные соединения:

Методика выполнения реакции. К 2 мл хлороформного раствора исследуемого вещества прибавляют 0,3 мл 1 %-го раствора кобальт ацетата в безводном этиловом спирте и 1 мл 5 %-го раствора изопропиламина в этиловом спирте. При наличии барбитуратов появляется фиолетовая окраска. Вместо этилового спирта можно использовать метиловый спирт.

3. Реакция с солями кобальта и щелочами. Цвиккер (1931 г.) установил, что при добавлении к барбитуратам кобальт хлорида и барий гидроксида образуется окрашенное соединение. В 1932 г. Цвиккер вместо барий гидроксида применил калий гидроксид. Другие исследователи вместо барий гидроксида применили литий гидроксид.

Методика выполнения реакции. Исследуемое вещество или остаток, полученный после выпаривания извлечений из соответствующих объектов, растворяют в 0,2-0,5 мл абсолютного этилового спирта. К этому раствору прибавляют 1-2 капле 1 %-го раствора кобальт ацетата в абсолютном этиловом спирте и 1-2 капле 1 %-го раствора калий гидроксида в абсолютном этиловом спирте. При наличии барбитуратов появляется розовый или красный цвет.

Выполнению этой реакции мешает вода, которая разлагает окрашенное соединение. Поэтому при выполнении реакции используют реактивы, растворенные в абсолютном этиловом или метиловом спирте. Оттенок или интенсивность окраски зависит от того, который применяют спирт, что объясняется разной сольватирую-щей способностью образованных соединений этими спиртами. Эту реакцию дают некоторые сульфаниламидные препараты, пурины, пиримидины и т.п..

4. Реакция с пиридином и солями купрума. При взаимодействии барбитуратов с пиридином и солями купрума образуются малорастворимые комплексные соединения.

Под влиянием пиридина происходят енолизация и частичная ионизация барбитуратов. Пиридин с ионами купрума образует положительно заряженный комплексный ион [Сu(Ру)]²⁺. Во время взаимодействия комплекса пиридина и ионов купрума с ионизированными молекулами барбитуратов образуется внутрикомп-лексное соединение. Минеральные кислоты разлагают это соединение.

Осадки, образованные при взаимодействия барбитуратов с солями купрума и пиридином, могут быть аморфными и кристаллическими.

Методика выполнения реакции. На предметное стекло наносят несколько капель раствора исследуемого вещества в хлороформе и выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 2 капле 10 %-го раствора аммиака и 1-2 капли реактива (раствор сульфата купрума в аммиаке и пиридине). При наличии барбитуратов через 10-15 мин. появляются кристаллические или аморфные осадки.

5. Мурексидная реакция. Для открытия барбитуратов предложены несколько вариантов мурексидной реакции. Один из вариантов этой реакции подается ниже.

Методика выполнения реакции. В фарфоровую чашку к сухому остатку, полученному после выпаривания извлечений из биологического материала, или к небольшому количеству сухого вещества прибавляют 3 капли 3 %-го раствора пероксида водорода и 3 капли реактива, который содержит соль Мора и аммоний хлорид. Содержимое чашки выпаривают, сухой остаток нагревают до появления белого дыма. После охлаждения прибавляют 3 капли 6 н. раствора аммиака. При наличии некоторых барбитуратов и тиобарбитуратов появляется розовый цвет.

Мурексидную реакцию дают барбамил, барбитал, фенобарбитал, натрий этаминал и тиопентал. Не дают этой реакции гексенал, гексобарбитал и циклобарбитал (В. И. Попова).

6. Выделение кислотной формы барбитуратов. Все барбитураты при взаимодействии с сульфатной кислотой дают кристаллы характерной формы.

Методика выполнения реакции. На предметное стекло наносят несколько капель раствора барбитурата в хлороформе, который выпаривают при комнатной температуре. После выпаривания исследуемого раствора на то самое место наносят следующую каплю этого раствора, который также выпаривают досуха. Сухой остаток растворяют в одной капле концентрированной сульфатной кислоты. Через 3-5 мин. после охлаждения раствора рядом с ним наносят каплю воды. Потом эти капли соединяют с помощью капилляра. Через 10-20 мин. (при небольших количествах барбитуратов через 1-2 ч.) появляются кристаллические осадки. Для каждого барбитурата кристаллы имеют определенную форму.

Гадамер, а также К. П. Стюарт и А. Стольман отмечают, что большинство барбитуратов могут находиться в нескольких полиморфных модификациях. Поэтому при идентификации барбитуратов по форме кристаллов следует учитывать возможность появления нескольких кристаллических форм одного и того самого вещества.

7. Реакция с хлорцинкйодом. Барбитураты с данным реактивом дают кристаллы характерной формы.

Методика выполнения реакции. На предметное стекло наносят несколько капель хлороформного раствора исследуемого вещества и выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 1 каплю раствора хлорцинкйода. Через 10-15 мин. под микроскопом наблюдают форму кристаллов, которые образовались. При наличии барбитуратов (барбамил, барбитал, бутобарбитал, этаминал) в исследуемом растворе появляются кристаллические осадки.

8. Реакция со смесью растворов ферум хлорида и калий йодида. Барбитураты с данным реактивом дают кристаллы характерной формы.

Методика выполнения реакции. На предметное стекло наносят несколько капель раствора исследуемого вещества в хлороформе. Этот раствор выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют каплю реактива. Через 10-15 мин. под микроскопом наблюдают форму образованных кристаллов, которые появляются при наличии некоторых барбитуратов (барбамил, бутобарбитал, фенобарбитал, этаминал).

9. Реакция с калий дийодокупратом в растворе йода.

Методика выполнения реакции. На предметное стекло к сухому остатку, который получают после выпаривания раствора исследуемого вещества, прибавляют каплю реактива. При наличии барбитуратов (барбамила, бутобарбитала, этаминала) образуются кристаллические осадки.

10. Реакция с подкисленным спиртовым раствором калий йодида.

Методика выполнения реакции. На предметное стекло к сухому остатку, полученному при выпаривании исследуемого раствора, наносят 2 капли реактива. При наличии барбитуратов (барбитала, бутобарбитала, гексанала, этаминала) через 10-15 мин. появляются кристаллические осадки.

11. Реакция с родамином 6 Ж. Во время взаимодействия родамина 6 Ж с солями барбитуратов (барбамила, гексенала, натрий-этаминал) образуются окрашенные ионные ассоциаты, которые экстрагируются тетрахлорметаном.

Методика выполнения реакции. В делительную воронку вносят 0,1 мл раствора исследуемого вещества, прибавляют 0,2 мл 0,1 %-го раствора родамина 6 Ж и 1 мл тетрахлорметана. Смесь взбалтывают на протяжении 1 мин., при наличии солей барбитуратов слой тетрахлорметана приобретает светло-оранжевый или оранжево-красный окраски.

Эта реакция пригодна для открытия барбамила, гексенала и натрий этаминала в фармакопейных препаратах и лекарственных смесях (В. И. Попова).

12. Открытие барбитуратов по спектрам поглощения в УФ-области. Описанный ниже метод дает возможность открыть отдельные барбитураты и определить, к каким группам барбитуратов они принадлежат.

Методика выполнения реакции. К сухому остатку, полученному выпариванием извлечений из биологического материала или лекарственных форм, прибавляют 5 мл воды. После растворения сухого остатка полученный раствор фильтруют, потом к фильтрату прибавляют 1 каплю 2 н. раствора аммиака (рН 10) и снимают спектр поглощения. При этом 5,5-замещенные (барбитал, барбамил, бутобарбитал, фенобарбитал, циклобарбитал, этаминал) и 1,5,5-замещенные (гексенал, бензонал) барбитуровой кислоты имеют максимум поглощения при длине волны около 240 нм, а производные тиобарбитуровой кислоты - 2 максимума (при 305 и 255 нм). Если к этому раствору добавить 1-2 капли 2 н. раствора сульфатной кислоты (рН 2), то максимум поглощения 1,5,5- и 5,5-замещенных барбитуровой кислоты исчезает. При этих условиях для тиобарбитуратов максимумы поглощения смещаются до 290 и 239 нм. После добавления к этим растворам 1-2 капель 4 н. раствора натрий гидроксида (рН = 13) появляется максимум поглощения 1,5,5-замещенных барбитуровой кислоты при 240 нм, а для 5,5-производных этой кислоты - при 255 нм. Для тиобарбитуратов появляется максимум при 305 нм, а второй максимум исчезает.

Количественное определение барбитуратов

Для количественного определения барбитуратов, выделенных из биологического материала, применяют фотоколориметрический и спектрофотометрический методы. Один из фотоколориметрических методов количественного определения барбитуратов, разработан В. И. Поповой, приводится ниже.

Сухие остатки барбитуратов, выделенных из биологического материала методом изолирования этих веществ водой, подкисленной сульфатной кислотой (см. выше), в зависимости от исследуемого барбитурата растворяют в хлороформе или метиловом спирте. Сухие остатки барбитала, гексенала, фенобарбитала и циклобарбитала растворяют в 6 мл хлороформа, а сухие остатки барбамила и этаминала - в 2 мл метилового спирта. Объемы растворов барбамила и этаминала в метиловом спирте доводят хлороформом до 6 мл. К полученным растворам барбитуратов прибавляют по 5 мл 0,125 %-го раствора кобальт ацетата в метиловом спирте и по 1 мл 50 %-го раствора изопропиламина в метиловом спирте. Оптическую плотность окрашенных в фиолетовый цвет растворов измеряют с помощью фотоэлектроколориметра ФЕК-М (светофильтр зеленый, кювета 20 мм) или прибор другой марки.

Как раствор сравнения применяют смесь пересчитанных реактивов.

Открытие барбамила

1. Барбамил с изопропиламином и солями кобальта дает фиолетовый цвет.

2. Во время взаимодействия барбамила с солями кобальта и щелочами появляется розовый или красный цвет.

3. Барбамил дает положительную мурексидную реакцию.

4. Барбамил с родамином 6Ж образует ионный ассоциат, раствор которого в тетрахлорметане имеет оранжевый цвет.

5. Под действием сульфатной кислоты на барбамил выделяется кислотная форма этого препарата, образуется осадок в виде пластинок или призм, сгруппированных в виде сфероидов. Граница открытия - 21 мкг барбамила в пробе.

6. Хлорцинкйод образует с барбамилом темно-красные или золотистые прямоугольные пластинки или сростки из них. Граница открытия - 7 мкг барбамила в пробе.

7. Барбамил со смесью растворов ферум (III) хлорида и калий йодида образует кристаллический осадок (призмы или сростки из них) оранжево-коричневого или коричневого цвета. Граница открытия - 1,8 мкг барбамила в пробе.

8. Калий дийодокупрат в растворе йода образует с барбамилом кристаллы призматической формы или сростки из них. Граница открытия 2,1 мкг барбамила в пробе.

9. Открытие барбамила за УФ- и ИК-спектрами. Способ открытия барбамила за светлопоглощением в УФ-области спектра описан выше.

В ИК-области спектра барбамил (диск с калий бромидом) имеет основные пики при 1716, 1689 и 1745 см^-1.

10. Открытие барбамила методом хроматографии. На хроматографической пластинке (9 х 12 см), покрытой тонким слоем силикагеля, закрепленным гипсом, отмечают линию старта, на которую наносят каплю хлороформного извлечения из кислого раствора, а правее, на расстоянии 2 см от нее, - каплю раствора «свидетеля» (0,01 %-го раствора препарата в метиловом спирте). Пятна на пластинке подсуши-вают на воздухе, потом пластинку помещают в камеру для хроматографирования, насыщенную парами системы растворителей (хлороформ - н-бутанол - 25 %-й раствор аммиака в соотношении 70:40:5). Когда фронт растворителей поднимется на 10 см выше от линии старта, пластинку вынимают из камеры, подсушивают и опрыскивают 0,02 %-м хлороформным раствором дифенилкарбазида, позже - раствором сульфата ртути. При наличии барбамила пятна на хроматограмме приобретают сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет.

Открытие барбитала

1. Барбитал с изопропиламином и солями кобальта дает фиолетовый цвет.

2. При добавлении к барбиталу солей кобальта и щелочей появляется розовый или красный цвет.

3. Барбитал дает мурексидную реакцию.

4. При добавлении к барбиталу сульфатной кислоты образуется кислотная форма этого препарата. Под микроскопом наблюдается появление бесцветных прозрачных прямоугольных призм. Граница открытия - 80 мкг барбитала в пробе.

5. При взаимодействии барбитала с раствором хлорцинкйода образуются темно-красные, фиолетовые или серовато-розовые прямоугольные пластинки. Граница открытия - 4 мкг барбитала в пробе.

6. Барбитал с солями купрума и пиридином образует фиолетовые кристаллы, которые имеют форму прямоугольников, звездочек. Граница открытия - 14 мкг барбитала в пробе.

7. Открытие барбитала по УФ- и ИК-спектрам. Способ открытия барбитала и других барбитуратов за УФ-спектрами описано выше.

В ИК-области спектра барбитал (диск с калий бромидом) имеет основные пики при 1674, 1754, 1380 и 1707 см^-1.

8. Открытие барбитала методом хроматографии. Для открытия барбитала методом хроматографии применяется способ, описанный для открытия барбамила.

При наличии барбитала на хроматограмме появляются фиолетово-синие или красно-фиолетовые пятна.
Открытие фенобарбитала

1. Во время взаимодействия фенобарбитала с изопропиламином и солями кобальта возникает фиолетовый цвет.

2. Фенобарбитал с солями кобальта и щелочью дает розовый или красный цвет.

3. Фенобарбитал можно открыть с помощью мурексидной реакции.

4. При добавлении концентрированной сульфатной кислоты к фенобарбиталу образуется кристаллический осадок кислотной формы этого препарата; (бесцветные кристаллы в виде иголок, сростки из них, сфероиды). Граница открытия - 41 мкг фенобарбитала в пробе.

5. Фенобарбитал со смесью соли ферум (III) и калий йодида образует оранжево-коричневые или коричневые кристаллы (призмы и их сростки). Граница открытия - 4 мкг фенобарбитала в пробе.

6. Реакция образования n-нитрофенилэтилбарбитуровой кислоты. Небольшое количество вещества растворяют в 3 мл концентрированной сульфатной кислоты. К этому раствору прибавляют 0,5 г калий нитрата и нагревают на протяжении 10 мин на кипящем водном нагревателе. Потом жидкость охлаждают и прибавляют 10 мл воды. При наличии фенобарбитала образуется кристаллический осадок n-нитрофенилэтилбарбитуровой кислоты. Осадок отфильтровывают и перекристализируют из этилового спирта. Высушенный осадок имеет температуру плавления 279 °С. Нитрогрупу в молекуле n-нитрофенилэтилбарбитуровой кислоты можно восстановить до аминогрупы, а потом n-аминофенилэтилбарбитуровую кислоту открыть с помощью реакции диазотирования. Эта реакция специфическая для фенобарбитала, но малочувствительная, ее можно использовать для открытия фенобарбитала в порошках, таблетках и т.п. Аналогичную реакцию дает и бензонал. ее не дают барбитураты, которые не содержат фенильной группы.

7. Открытие фенобарбитала за УФ- и ИК-спектрами. Открытие фенобарбитала за УФ-спектрами проводят так, как и открытие других барбитуратов. В ИК-области спектра фенобарбитал (диск с калий бромидом) имеет основные пики при 1703, 1756, 1406 см^-1.

8. Открытие фенобарбитала методом хроматографии. Условия открытия фенобарбитала методом хроматографии в тонком слое силикагеля такие же, как и условия открытия барбамила.
Открытие бутобарбитала

1. Во время взаимодействия бутобарбитала с изопропиламином и солями кобальта появляется фиолетовый цвет.

2. Бутобарбитал с солями кобальта и щелочами образует соединение розового или красного цвета.

3. Во время взаимодействия бутобарбитала с пиридином и солями меди образуются фиолетовые сростки в виде сфероидов. Граница открытия - 16 мкг бутобарбитала в пробе.

4. При добавлении к бутобарбиталу концентрированной сульфатной кислоты обрауются кристаллы в виде прозрачных призм и сростков из них. Граница открытия - 16 мкг бутобарбитала в пробе.

5. Хлорцинкйод образует с бутобарбиталом кристаллы ромбической формы или сростки из них темно-коричневого цвета. Граница открытия - 6 мкг бутобарбитала в пробе.

6. Во время взаимодействия бутобарбитала со смесью ферум (III) хлорида и калий йодида образуются призматические кристаллы коричневого или оранжевого цвета. Граница открытия - 6 мкг бутобарбитала в пробе.

7. Бутобарбитал с калий дийодокупратом в растворе йода образует осадок в виде чечевицы. Граница открытия - 6 мкг бутобарбитала в пробе.

8. Открытие бутобарбитала по УФ- и ИК-спектрам. Открытие барбитуратов, в том числе бутобарбитала, по спектрам поглощения в УФ-области описано выше. В ИК-области спектра бутобарбитал (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1683, 1712 и 1745 см^-1.

9. Открытие бутобарбитала ТСХ-методом на силикагеле. Для открытия бутобарбитала методом хроматографии в тонком слое силикагеля используется таже методика, как и для открытия барбамила. При наличии бутобарбитала в пробе на хроматографической пластинке появляются фиолетово-синие пятна.

Открытие этаминал-натрия

1. Этаминал-натрий с солями кобальта и изопропиламином дает фиолетовый цвет.

2. С солями кобальта и щелочами этаминал-натрий дает розовый цвет.

3. Этаминал-натрий дает реакцию образования мурексида.

4. Этаминал-натрий образует оранжево-красный цвет с родамином 6Ж. Окрашенное соединение хорошо экстрагируется тетрахлорметаном. Эта реакция может быть использована для открытия этаминал-натрия в порошках, таблетках и т.п.

5. После добавления концентрированной сульфатной кислоты к этаминал-натрию через 10-15 мин образуется осадок (сростки из призматических кристаллов). Граница открытия - 5 мкг этаминал-натрию в пробе.

6. Во время взаимодействия этаминал-натрия с хлорцинкйодом образуется коричневый или оранжево-коричневый кристаллический осадок (призмы или сростки из них). Граница открытия - 4 мкг этаминал-натрия в пробе.

7. Этаминал-натрий со смесью ферум (III) хлорида и калий йодида образует кристаллический осадок коричневого или оранжево-коричневого цвета (призмы и сростки из них). Граница открытия - 0,5 мкг этаминал-натрия в пробе.

8. Открытие этаминал-натрия за УФ- и ИК-спектрами. Этаминал, как и некоторые другие барбитураты, производные 5,5-барбитуровой кислоты, определяют за поглощением света в УФ-области спектра так, как описано выше; в ИК-области спектра этаминал (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1685, 1719 и 1744 см^-1.

9. Открытие этаминала методом хроматографии. На силикагелевой хроматографической пластинке отмечают линию старта, на которую наносят каплю хлороформного извлечения из биологического материала или каплю хлороформного раствора исследуемого вещества. Правее, на расстоянии 2 см от нее, на линию старта наносят каплю раствора «свидетеля» (0,01 %-го раствора препарата в метиловом спирте). Пятна на пластинке подсушивают на воздухе, а потом вносят ее в камеру для хроматографирования, насыщенного парами системы растворителей хлороформ - бензол - ацетон в соотношении 70:15:15.

После того как система растворителей поднимется на 10 см выше от линии старта, пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и опрыскивают смесью, которая состоит из 0,25 г безводного купрум сульфата, 1,5 мл диэтиламина и 48,5 мл метилового спирта. Пластинку дополнительно опрыскивают насыщенным раствором меркурий (І) нитрата. При наличии этаминала в пробе на желтом фоне хроматографической пластинки появляются черные пятна.
Открытие бензонала

1. Во время взаимодействия бензонала с изопропиламином и солями кобальта появляется фиолетовый цвет.

2. С солями кобальта и щелочами бензонал образует сине-фиолетовый цвет.

3. Открытие методом хроматографии. Для открытия бензонала используют методику, которая применяется для открытия барбамила.

Открытие гексенала

1. При добавлении к гексенала солей кобальта и изопропиламина появляется фиолетовый цвет.

2. Гексенал с солями кобальта и щелочью образует розовый или красный цвет.

3. При добавлении к гексеналу концентрированной сульфатной кислоты образуется осадок, который состоит из сростков кристаллов в виде иголок.

4. Гексенал с подкисленным спиртовым раствором калий йодида образует кристаллический осадок.

5. Открытие гексенала по УФ- и ИК-спектрам. Гексенал - натриевая соль гексобарбитала. В процессе выделения гексенала из биологического материала он переходит в гексобарбитал. Спектры поглощения в УФ-области всех 1,5,5-замещенных барбитуровой кислоты, в том числе гексобарбитала, приведены выше.

В ИК-области спектра гексобарбитал (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1712, 1660, 1390 и 1358 см^-1.
Открытие ноксирона

1. Реакция с изопропиламином и солями кобальта. Эту реакцию выполняют так, как при идентификации барбитуратов.

2. Реакция с хлорцинкйодом. При добавлении капли раствора хлорцинкйода к ноксирону через 2-5 мин. образуются кристаллы темно-бурого цвета в виде призм или сростков из них.

3. Перекристаллизация ноксирона с сульфатной кислотой. К остатку ноксирона, полученного после выпаривания хлороформного извлечения на предметном стекле, прибавляют каплю концентрированной сульфатной кислоты. После растворения остатка в кислоте прибавляют каплю воды. При наличии ноксирона через 10-30 мин. образуются сростки бесцветных призматических кристаллов.

4. Открытие ноксирона ТСХ-методом на силикагеле. На пластинку, покрытую тонким слоем силикагеля КСК, наносят каплю исследуемого раствора и каплю раствора «свидетеля». Пятна нанесенных растворов подсушивают на воздухе, потом пластинку вносят в камеру для хроматографирования, насыщенную парами системы растворителей (смесь ацетона и хлороформа в соотношении 1:9). После продвижения растворителей по пластинке на 10 см выше от линии старта пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и опрыскивают 1 %-м раствором меркурий (І) нитрата. При наличии ноксирона в исследуемом растворе на белом фоне пластинки образуются пятна серо-черного цвета. Этот метод дает возможность открыть 10 мкг ноксирона в пробе.

5. Открытие ноксирона за УФ- и ИК-спектрами. Раствор ноксирона в этиловом спирте имеет максимумы поглощения при 251, 257 и 263 нм. В щелочном растворе ноксирон имеет максимум поглощения света при 235 нм и минимум — при 223-225 нм. Как отмечает Кларк, измерение интенсивности поглощения ноксирона в щелочных растворах следует проводить не позже чем через 90 с со времени добавления щелочи, поскольку при наличии щелочи изменяется светопоглощение раствора вследствие разрушения в препарате пиперидинового цикла. В ИК-области спектра ноксирон (диск с бромидом калия) имеет основные пики при: 1686, 1710 и 1200см^-1.

6. Открытие ноксирона в моче. 50 мл мочи вносят в делительную воронку и подкисляют 0,1 н. раствором хлоридной кислоты до рН=4...5. Подкисленную мочу дважды взбалтывают с новыми порциями диэтилового эфира (по 20 мл). Эфирные извлечения объединяют и взбалтывают с 4 мл воды, потом отделяют водную фазу от эфирного извлечения. Это извлечение выпаривают. Сухой остаток растворяют в 5 мл хлороформа. К части хлороформного раствора прибавляют 2 капли свежеприготовленного 1 %-го раствора кобальт ацетата в метиловом спирте и 2 капли свежеприготовленного 1 %-го раствора литий гидроксида в метиловом спирте. Появление синего цвет, который переходит в сине-зеленый, свидетельствует о наличии ноксирона в моче.
Открытие салициловой кислоты

1. Реакция с ферум (ІІІ) хлоридом. При добавлении раствора ферум (III) хлорида к салициловой кислоте жидкость приобретает сине-фиолетовый цвет. Состав и цвет комплексов, которые образуются во время взаимодействия салициловой кислоты с ионами ферума, зависит от рН среды. При рН = 1,8...2,5 образуется моносалицилатный комплекс сине-фиолетового цвета. При рН = 4...8 образуется дисалицилатный комплекс красно-бурого цвета. Трисалицилатный комплекс ферума желтого цвета, образуется при рН =8...11:

Методика выполнения реакции. Эту реакцию можно выполнять двумя способами:

а. Несколько капель хлороформного извлечения, содержащего салициловую кислоту, вносят в фарфоровую чашку и выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют каплю 1 %-го свежеприготовленного раствора ферум (III) хлорида. При этом появляется сине-фиолетовый цвет, которой не исчезает при добавлении 2-3 капель этилового спирта.

б. На кусок фильтровальной бумаги наносят каплю 1 %-го свежеприготовленного раствора ферум (III) хлорида и подсушивают. Потом на то самое место наносят 1-2 капли хлороформного извлечения, содержащего салициловую кислоту. При наличии этой кислоты в вытяжке появляется сине-фиолетовое пятно.

2. Реакция образования метилсалицилата. При нагревании салициловой кислоты с метиловым спиртом в присутствии сульфатной кислоты образуется метиловый эфир салициловой кислоты (метилсалицилат):

Методика выполнения реакции. Несколько капель хлороформного извлечения вносят в пробирку. При слабом нагревании пробирки на водяной бане жидкость выпаривают досуха. К сухому остатку прибавляют 2 капли метилового спирта и 2 капли концентрированной сульфатной кислоты. Содержимое пробирки нагревают на водном нагревателе. Появление характерного запаха метилсалицилата свидетельствует о наличии салициловой кислоты в исследуемой пробе.

3. Открытие салициловой кислоты по УФ- и ИК-спектрам. Салициловая кислота в 0,5 н. растворе натрий гидроксида имеет максимум поглощения при 300 нм, а в 0,1 н. растворе сульфатной кислоты - при 302 нм; в ИК-области спектра салициловая кислота (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1657, 1446, 1288 и 758 см^-1.

4. Открытие салициловой кислоты в моче и крови. Для открытия салициловой кислоты в моче и крови предложены предварительные пробы, которые базируются на реакции с реактивом Триндлера и на реакции с ферум (III) нитратом.

Методика выполнения реакции. 1. К 1 мл мочи прибавляют 2-3 капли реактива Триндлера. Возникновение пурпурового цвета свидетельствует о наличии салициловой кислоты в моче.

2. К 0,5 мл мочи или плазмы крови прибавляют 4,5 мл 0,55%-го раствора ферум (III) нитрата в 0,04 н. растворе нитратной кислоты. Появление пурпурового цвета свидетельствует о наличии салициловой кислоты в исследуемых объектах.

Открытие ацетилсалициловой кислоты

1. Реакция с раствором гидроксида натрия. Вследствие реакции наблюдается появление осадка, а при добавлении метанола - появление специфического запаха.

Методика выполнения реакции. Сухой остаток, полученный после выпарывания нескольких капель хлороформного извлечения, нагревают с раствором натрий гидроксида. При этом образуется динатрийсалицилат и ацетат натрия. Содержимое пробирки охлаждают и подкисляют сульфатной кислотой. Выпадает осадок салициловой кислоты. Если к образованной смеси прибавить этиловый спирт и нагреть, то возникает характерный запах этилсалицилата (подобный метилсалицилату).

ИСХОДНЫЙ УРОВЕНЬ ЗНАНИЙ И УМЕНИЙ

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

Методы изолирования барбитуратов и салицилатов из биологического материала.
Условия проведения характерных реакций на барбитураты, салицилаты,

ноксирон.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

Проводить реакции открытия барбитуратов, салицилатов, ноксирона.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:

Основные: 1. Крамаренко В.Ф. Токсикологическая химия. - К. Высшая школа. 1995.- С. 184-199, 211-213

Дополнительные: 1. Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М. Медицина. 1975. - С. 133-157.

2. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - К. Высшая школа. 1982.- С. 153-160.

ЗАНЯТИЕ № 4.

следующая страница>